營養(yǎng)知識(shí)
最新資訊
-
電話： 400-113-6988 郵箱： dongfangxicao@163.com 地址： 深圳市南山區(qū)粵海街道高新中三道9號(hào)環(huán)球數(shù)碼大廈19樓
↓ 微信掃碼識(shí)別關(guān)注我們 ↓ 
缺硒條件下誘導(dǎo)Nrf2靶基因
發(fā)表于：2021-09-01 作者：admin 來源：本站 點(diǎn)擊量：22563
原文：M Müller, Banning A , R Brigelius-Flohé, et al. Nrf2 target genes are induced under marginal selenium-deficiency[J]. Genes & Nutrition, 2010, 5(4):297-307.
翻譯：
關(guān)鍵詞：硒；Nrf2； II相酶； 腸；氧化應(yīng)激
引言
在哺乳動(dòng)物中，必需的微量元素硒作為硒代半胱氨酸并入硒蛋白活性中心發(fā)揮作用。人類有25個(gè)基因編碼硒蛋白[30]，其中許多涉及氧化還原過程[35]，包括谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）[8]和硫氧還蛋白還原酶（TrxR）[14]。歐洲人口中存在的少量硒缺乏癥可能伴隨著輕微的氧化狀態(tài)[45]。 硒蛋白的表達(dá)取決于細(xì)胞中硒的狀態(tài)。但是，一些微陣列研究表明，硒的可用性也會(huì)影響非硒蛋白的表達(dá)（在[13]中進(jìn)行了綜述）。仍然缺乏基本機(jī)制。硒狀態(tài)碼經(jīng)常影響抗氧化劑防御酶和II期系統(tǒng)的酶[13,44]。一方面，大劑量的硒刺激諸如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）和NADPH：醌氧化還原酶（NQO1）等II期酶的活性。這種作用可以分別通過硒代半胱氨酸硒結(jié)合物[53]和二甲基二硒化物[58]來介導(dǎo)。另一方面，有強(qiáng)有力的證據(jù)證明在硒缺乏時(shí)會(huì)誘導(dǎo)抗氧化劑和II期酶的產(chǎn)生。早在1970年代末期，據(jù)報(bào)道血紅素加氧酶1（HMOX1）[12]以及GST活性在缺硒的大鼠肝臟中有所升高[32]。硒缺乏癥中抗氧化劑和II期酶的補(bǔ)償性上調(diào)的想法進(jìn)一步得到了小鼠的發(fā)現(xiàn)，該小鼠具有針對(duì)器官的靶向去除編碼硒代半胱氨酸t(yī)RNA（Trsp）的基因。肝臟中硒蛋白的完全喪失導(dǎo)致了GSTPi，NQO1和HMOX1的誘導(dǎo)[52]。 參與細(xì)胞抗氧化劑防御和II期排毒的大多數(shù)蛋白質(zhì)基因是由氧化還原和親電敏感的轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子（Nrf2）調(diào)控的（在[16]中進(jìn)行了綜述），該因子與順式作用的抗氧化劑或親電反應(yīng)元件（ARE / EpRE）[48，56]。 Nrf2-/-小鼠對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)的毒性和腫瘤發(fā)生敏感[43]。另外，Nrf2-/-小鼠對(duì)氧化應(yīng)激高度敏感[1]，并具有較低的基礎(chǔ)谷胱甘肽（GSH）水平[47]。在不受刺激的條件下，Nrf2保留在與Keap1結(jié)合的胞質(zhì)溶膠中，Keap1充當(dāng)基于Cul3的E3泛素連接酶的底物銜接子，并靶向Nrf2進(jìn)行降解。靶基因的反式激活是響應(yīng)活性氧（ROS）或親電試劑而引起的，這些試劑修飾Keap1的易感硫醇基團(tuán)，導(dǎo)致核Nrf2蛋白水平迅速提高（在文獻(xiàn)[38]中進(jìn)行了綜述）。 Trsp和Nrf2的同時(shí)破壞消除了II期酶的誘導(dǎo)，從而驗(yàn)證了Nrf2在響應(yīng)硒蛋白丟失中的作用[52]。與飼喂對(duì)照飲食的小鼠相比，飼喂缺硒飲食的ARE報(bào)告小鼠的ARE驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因活性顯著增強(qiáng)[9]。另外，在缺硒的野生型小鼠中觀察到的GST和NQO1活性增加在Nrf2-/-小鼠中無法檢測(cè)到[9]。這提供了飲食中硒缺乏與Nrf2激活之間的第一個(gè)直接聯(lián)系。 基于這些結(jié)果，當(dāng)前的研究集中在邊緣缺硒飲食對(duì)Nrf2調(diào)控基因表達(dá)的影響上。貧硒飲食中小鼠的建議每日允許攝入量（RDA）為一半[28]，反映出生理狀況可能會(huì)因改變營養(yǎng)習(xí)慣或季節(jié)性食物變化而同樣發(fā)??生。分析的目標(biāo)器官是結(jié)腸和十二指腸的腸段，這是抵抗異種生物脅迫的第一道防線，還有肝臟，肝臟高度表達(dá)II期酶。先前研究[28]中獲得的微陣列數(shù)據(jù)的途徑分析未表明Nrf2途徑受到影響，因?yàn)樗贸绦騁enMAPP不包含該途徑的MAPP（微陣列途徑概況）。因此，手動(dòng)鑒定了48個(gè)Nrf2靶基因和12個(gè)經(jīng)典II期酶，并通過qPCR證實(shí)了有趣的候選基因。
材料和方法
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
從先前報(bào)道的動(dòng)物中獲取組織樣品[28]。對(duì)雄性C57BL / 6 J小鼠（3-4周齡）飼喂貧硒（0.086 mg Se / kg）或通過混合硒代蛋氨酸（Acros，比利時(shí)的蓋爾（Geel）陷入貧困的人（德國的拉格（Altromin））。喂養(yǎng)6周后，麻醉的動(dòng)物因頸脫位而被處死。冷凍固定在液氮中的血漿和組織儲(chǔ)存在-80°C下。每組12只動(dòng)物的硒狀態(tài)以血漿硒含量和肝GPx活性為特征，發(fā)現(xiàn)在中等硒缺乏時(shí)分別降低至硒充足的13％和35％[28]。
RNA分離
在液氮冷卻下將組織研磨。將20–30 mg的粉末懸浮在800μl的冷Trizol（Invitrogen，卡爾斯魯厄，德國）中，并用組織裂解器（Qiagen，Hilden，德國）以30 Hz勻化2×2分鐘。根據(jù)制造商的說明，使用Trizol方案分離RNA。用10 U RQ1 DNase（Promega，曼海姆，德國）消化基因組DNA，并通過苯酚-氯仿提取純化RNA。使用NanoDrop ND-1000（Peqlab Biotechnologie GmbH，德國埃爾蘭根）測(cè)量RNA濃度。
芯片分析
如前所述[28]，使用Mouse 44 K芯片（Agilent Technologies，Böblingen，德國）進(jìn)行芯片分析。Student’s t-test檢驗(yàn)可鑒定出顯著調(diào)控的基因（P <0.05）。 實(shí)時(shí)定量PCR 用150 fmol oligo（dT）15引物和180 U莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega）反轉(zhuǎn)錄RNA（3μg），總體積為45μl。
實(shí)時(shí)PCR
（Mx3005PTM QPCR系統(tǒng)，Stratagene，阿姆斯特丹，荷蘭）使用SYBR Green I（Molecular Probes，Eugene，USA）作為熒光報(bào)告物，在25μl反應(yīng)混合物中以1μl十倍稀釋的cDNA一式三份進(jìn)行。所有PCR反應(yīng)的退火溫度分別為60和62°C（表1）。 PCR產(chǎn)物的定量范圍為1×103至1×109個(gè)拷貝的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過將至少一種引物置于PerlPrimer v1.1.14的外顯子/內(nèi)含子邊界上，設(shè)計(jì)引物（表1，Sigma–Aldrich，Taufkirchen，德國）對(duì)cDNA具有特異性。參考基因Rpl13a和Hprt1的平均值用于在結(jié)腸和肝臟中qPCR結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化，而Rpl13a僅用于十二指腸。
表1. 所用底物序列表
表2. 微陣列分析測(cè)量硒對(duì)結(jié)腸Nrf2靶基因作用
組織裂解液的制備
將10 mg磨碎的組織懸浮于含有2μl蛋白酶抑制劑混合物III（Calbiochem，Bad Soden，Germany）的250μl均質(zhì)緩沖液（100 mM Tris-HCl，300 mM KCl，0.01％Triton X-100）中并用組織裂解器（Qiagen）在30 Hz下持續(xù)2×2分鐘。裂解液在21,000×g和4°C下離心15分鐘，然后根據(jù)Bradford [7]評(píng)估蛋白質(zhì)含量。
蛋白質(zhì)印跡
將等分試樣（20μg蛋白/泳道）進(jìn)行SDS-PAGE，并按[5]所述進(jìn)行印跡。用兔抗人NQO1抗血清（1：3,000； ab34173，Abcam，劍橋，英國）檢測(cè)到NQO1。通過兔抗人β-肌動(dòng)蛋白抗血清（1：5,000； ab8229，Abcam）檢測(cè)到的β-肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)部對(duì)照。使用過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔抗體（1：50,000； Chemicon，霍夫海姆，德國）作為二抗。檢測(cè)是在以SuperSignal West Dura（德國波恩的Perbio）為底物的Fuji LAS3000-CCD系統(tǒng)中完成的。用Aida / 2D光密度測(cè)定法4.0軟件（Raytest，Straubenhardt，德國）對(duì)條帶進(jìn)行定量。
NQO1活動(dòng)
根據(jù)[42]測(cè)量雙香豆酚敏感的NQO1活性。在590 nm的微量滴定板吸光度讀取器上追蹤由甲萘醌介導(dǎo)的3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）的還原（Synergy 2，Biotek Instruments GmbH，Bad Friedrichshall，德國），將不同的填充量校正為1厘米的路徑長度。將3μl裂解物與190μl反應(yīng)緩沖液（25 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.665 mg / l BSA，0.01％Tween 20，5μMFAD，1 mM葡萄糖-6-磷酸鹽，30μM一起用于測(cè)定NADP，0.72 mM MTT，0.3 U / ml 6磷酸葡萄糖脫氫酶，50μM甲萘醌），總體積為250μl。 NQO1的活性計(jì)算為有和沒有雙香豆酚時(shí)MTT還原速率之間的差異，使用的還原MTT的消光系數(shù)在590 nm處估計(jì)為11,961（mol / l）-1×cm-1。
統(tǒng)計(jì)分析
比較兩組，通過未配對(duì)的Student’s t-test（GraphPadPrism®5.0版，美國加利福尼亞州圣地亞哥）計(jì)算出顯著差異。 P值<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果
兩個(gè)Nrf2硒蛋白靶基因GPx2和TrxR1是特殊情況，因?yàn)樗鼈兊姆g依賴于硒的可用性及其在層次結(jié)構(gòu)中的排名。 高硒蛋白GPx2 [57]和TrxR1 [10]的mRNA在缺硒結(jié)腸中顯著降低，GPx2受影響小于TrxR1。 相反，兩種酶的mRNA在硒缺乏十二指腸中增強(qiáng)（圖3a，b）。 硒缺乏時(shí)GPx2 mRNA的上調(diào)已經(jīng)在細(xì)胞培養(yǎng)中顯示[57]。 在限制硒條件下mRNA的穩(wěn)定性使得在補(bǔ)充硒后能夠在缺硒細(xì)胞中快速重新合成GPx2 [57]。 兩種觀察都可以作為硒蛋白質(zhì)層次中GPx2高級(jí)別的證據(jù)。NQO1 RNA在缺硒十二指腸中的上調(diào)與NQO1蛋白表達(dá)和活性相關(guān)
在蛋白質(zhì)和活性水平上進(jìn)一步分析NQO1作為Nrf2靶基因的原型。 在十二指腸中，NQO1蛋白和活性在缺硒組中顯著增強(qiáng)（圖4），與增強(qiáng)的mRNA相關(guān)（圖2a）。 在結(jié)腸中，蛋白質(zhì)水平和活性都沒有改變，表明NQO1 mRNA的輕微增加不會(huì)通過增加的翻譯和活性反映出來。
討論
本研究是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的一部分，其中給小鼠喂食符合RDA的小鼠或硒含量降低至約50％的飲食[28]。雖然硒攝入量?jī)H適度減少，但四種硒蛋白SelW，GPx1，SelH和SelM的RNA表達(dá)明顯下調(diào)，Wnt途徑的基因在結(jié)腸中上調(diào)[28]。對(duì)微陣列數(shù)據(jù)的人工分析表明，Nrf2靶基因和II期酶也受硒狀態(tài)的調(diào)節(jié);在結(jié)腸中表達(dá)的60個(gè)基因中，41個(gè)被上調(diào)占68％（表2）。通過qPCR證實(shí)了12種用于抗氧化防御和II期酶的所選基因的表達(dá)（圖1和2）。 Nrf2靶基因在邊緣硒缺乏中的一致上調(diào)是高度相關(guān)的，因?yàn)榇蝺?yōu)的硒供應(yīng)也可能是由人類經(jīng)常消耗的低硒飲食造成的[45]。邊緣硒缺乏的建立與大多數(shù)其他研究高硒補(bǔ)充劑或嚴(yán)重缺硒的研究相反。
圖1.硒缺乏（-Se）小鼠與相對(duì)于不缺硒（+Se）小鼠的結(jié)腸（n = 9）和 十二指腸（n = 6）中抗氧化酶的mRNA表達(dá)分析。 a血紅素加氧酶1（Hmox1），b金屬硫蛋白2（Mt2），c peroxiredoxin 1 (Prdx1), d sulfifiredoxin（Srxn1），e超氧化物歧化酶1（Sod1），f c-谷氨酰半胱氨酸合成酶，催化亞基（Gclc）?；虮磉_(dá)通過qPCR分析，并在十二指腸采用Rpl13a進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。 在結(jié)腸中參考Hprt1和Rpl13a進(jìn)行平均。 * P＜ 0.05； ** P＜ 0.01； 設(shè)置+Se為1,采用t-test分析方法進(jìn)行分析
圖2.硒缺乏（-Se）小鼠與相對(duì)于不缺硒（+Se）小鼠的結(jié)腸（n = 9）和 十二指腸（n = 6）中II相酶的mRNA表達(dá)。NADPH：醌氧化還原酶（Nqo1）， b谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶a1 / a2（Gsta1 / a2），c谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶m1（Gstm1），d谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶p1（Gstp1），e磺基轉(zhuǎn)移酶1b1（Sult1b1），f UDP葡糖醛酸糖基轉(zhuǎn)移酶1a6 a / b （Ugt1a6a / b）?；虮磉_(dá)通過qPCR分析，并在十二指腸采用Rpl13a進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。 在結(jié)腸中參考Hprt1和Rpl13a進(jìn)行平均。 * P＜ 0.05； ** P＜ 0.01； 設(shè)置+Se為1,采用t-test分析方法進(jìn)行分析。
此外，Burk及其同事提供了飲食中硒缺乏和Nrf2激活之間的第一個(gè)直接聯(lián)系，比較了每公斤飼喂0.25毫克亞硒酸鈉的完全缺硒或補(bǔ)充飲食的小鼠[9]。 在硒缺乏條件下，ARE驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因活性以及GST和NQO1活性在野生型小鼠的肝臟中強(qiáng)烈增加，但在Nrf2 - / - 小鼠中沒有變化。 目前的研究表明，邊緣硒缺乏可導(dǎo)致II期酶的上調(diào)，強(qiáng)調(diào)了生物體對(duì)硒體內(nèi)平衡變化的敏感程度。
圖3 硒缺乏（-Se）小鼠與相對(duì)于不缺硒（+Se）小鼠的結(jié)腸（n = 9）和 十二指腸（n = 6）中硒蛋白的mRNA表達(dá)。 a 硫氧還蛋白還原酶1（Txnrd1）， b谷胱甘肽過氧化物酶2（Gpx2），c硒蛋白W（Sepw1）。 基因表達(dá)通過qPCR分析，并在十二指腸采用Rpl13a進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。 在結(jié)腸中參考Hprt1和Rpl13a進(jìn)行平均。 * P＜ 0.05； ** P＜ 0.01； 設(shè)置+Se為1,采用t-test分析方法進(jìn)行分析
圖4. 小鼠十二指腸中的NQO1蛋白表達(dá)和活性測(cè)試。 蛋白質(zhì)測(cè)量通過Western Blot（a）方法，光密度分析與歸一化采用b-actin（b）方法。 通過降低MTT方法（c）來測(cè)量絕對(duì)NQO1活性。 *** P＜ 0.001； 設(shè)置+Se為1,采用t-test分析方法進(jìn)行分析，詳情請(qǐng)參閱“材料和方法”
由于Nrf2靶基因表達(dá)不受肝臟中邊緣硒缺乏的影響（表3），但在腸道中上調(diào)，可以得出結(jié)論，腸道對(duì)減少的硒供應(yīng)更敏感。 在Nrf2 - / - 小鼠的肝臟中，大多數(shù)已知的Nrf2靶基因被下調(diào)，而主要用于解毒的酶在Keap1敲低小鼠中增加，其特征在于Nrf2激活增加[47]。 作者得出結(jié)論，Nrf2的肝臟激活對(duì)于解毒比對(duì)抗氧化防御更重要。 在目前的研究中，在十二指腸中觀察到用于抗氧化防御的酶的明顯上調(diào)。 由于減少的氧化還原狀態(tài)維持腸上皮細(xì)胞增殖并防止早熟細(xì)胞凋亡[3]，對(duì)抗氧化防御酶的更高需求可以解釋目前的發(fā)現(xiàn)。
然而，也有相反的發(fā)現(xiàn)：當(dāng)喂食0.01毫克硒/千克膳食或1毫克/千克時(shí)，解毒基因被硒缺乏下調(diào)[44]。 因此，硒含量相差100倍，而在本研究中，因子僅為2.相互矛盾的結(jié)果（[13]中綜述）可以解釋為超營養(yǎng)飲食可以誘導(dǎo)II期酶更多 比硒缺乏有效。 以超營養(yǎng)飲食作為缺乏飲食的參考，凈效應(yīng)是硒缺乏的下調(diào)。
表3 肝臟中Nrf2靶基因和II期酶的qPCR結(jié)果
低硒含量和高硒含量影響的潛在機(jī)制似乎不同。 高濃度的某些硒化合物或代謝物可通過改變Keap1中的關(guān)鍵硫醇直接激活Nrf2途徑。 反應(yīng)性巰基也可以通過氧化來修飾[22,29]，這種情況在硒缺乏中占主導(dǎo)地位[52,55]。 需要澄清中度缺硒小鼠中較高的氧化狀態(tài)是否是誘導(dǎo)的Nrf2靶基因表達(dá)的原因。
通過敲除肝細(xì)胞中Sec特異性tRNA（Trsp）的基因完全喪失所有硒蛋白，增強(qiáng)了幾種II期酶的表達(dá)，表明至少一種硒蛋白通常抑制Nrf2通路的激活[50]。為了降低推定候選者的數(shù)量，Sengupta及其同事使用了第二只小鼠品系，其中Trsp突變的方式只有管家而非壓力相關(guān)的硒蛋白表達(dá)。這些小鼠沒有對(duì)II期酶的代償性上調(diào)作出反應(yīng)，這表明管家硒蛋白必須阻止Nrf2的活化[50]。由于硫氧還蛋白還原酶家族屬于管家硒蛋白[10]，因此分析了肝臟特異性TrxR1敲除對(duì)Nrf2途徑的潛在激活。實(shí)際上，TrxR1敲除導(dǎo)致Nrf2的核積累和21個(gè)Nrf2靶基因的誘導(dǎo)[51]。 TrxR2，TrxR3或硫氧還蛋白的mRNA水平未受影響。因此，TrxR1似乎抵消Nrf2激活和/或用作Nrf2激活的關(guān)閉信號(hào)。然而，缺乏TrxR1的肝臟未顯示氧化應(yīng)激的證據(jù)，使?jié)撛诘臋C(jī)制不清楚[51]。
硒還影響編碼非硒蛋白的多個(gè)基因的表達(dá)，這些基因可能參與邊緣硒缺乏時(shí)Nrf2通路的特異性激活。 在之前的研究[28]中，我們發(fā)現(xiàn)Wnt通路被激活，表現(xiàn)為b-連環(huán)蛋白，Dvl2，Lef1和c-Myc的表達(dá)增強(qiáng)以及Gsk3β的下調(diào)。 Gsk3β是一種多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶，不僅參與糖原代謝和經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，而且還顯示出使Nrf2通路失活[23,49]。 Fyn激酶被磷酸化，從而被Gsk3β激活。 反過來，Phospho-Fyn使Nrf2磷酸化，導(dǎo)致Nrf2的核輸出[23]。 Gsk3β的活性降低，這可能是在先前研究中硒限制條件下從Gsk3β的下調(diào)推斷出的，可能會(huì)降低活性Fyn的量，從而導(dǎo)致Nrf2的核積累。
邊緣硒缺乏中Nrf2通路的激活與結(jié)直腸癌的發(fā)展有關(guān)。在炎癥引發(fā)的結(jié)腸直腸癌發(fā)生模型中，與野生型小鼠相比，Nrf2 - / - 小鼠的發(fā)病率，多樣性和腫瘤大小增加[25]。一方面，GST，SULT和UGT家族等II期酶參與異生物質(zhì)的結(jié)合和排泄。加上抗氧化酶如過氧化物酶，硫化毒素，Sod1，Hmox1和金屬硫蛋白等基因的上調(diào)，可以保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷。另一方面，Nrf2激活也可能有助于增加藥物輸出，抗藥性和腫瘤細(xì)胞存活[16,31]。因此，不能容易地確定Nrf2靶基因在硒缺乏中對(duì)結(jié)腸直腸癌的上調(diào)的結(jié)果。硒缺乏癥中Wnt途徑的激活指向低硒狀態(tài)的癌癥促進(jìn)功能，并且與硒缺乏中較高的癌癥發(fā)病率一致（在[46]中綜述）。 Nrf2途徑的激活是否是通過內(nèi)源性防御系統(tǒng)的強(qiáng)化來補(bǔ)償硒蛋白的損失的嘗試，或者它是否已經(jīng)有助于癌細(xì)胞的存活，這是進(jìn)一步研究的挑戰(zhàn)。
翻譯：
缺硒條件下誘導(dǎo)Nrf2靶基因
摘要：在歐洲，硒攝入不足似乎是普遍存在的。因此，目前的研究主要集中在攝入不足的條件下基因表達(dá)的變化。之前，有研究采用微陣列分析方法，揭示了小鼠在充足硒營養(yǎng)或中度缺乏硒營養(yǎng)喂養(yǎng)條件下的結(jié)腸的幾種途徑的基因的變化。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重的硒缺乏會(huì)影響適應(yīng)性反應(yīng)的Nrf2調(diào)節(jié)的基因。由于先前的分析途徑是采用不關(guān)聯(lián)Nrf2靶基因的程序開展的，而通過qPCR手動(dòng)選擇和確認(rèn)各自的基因表達(dá)變化，更具意義。qPCR顯示在缺硒飲食條件下，誘導(dǎo)II相酶（Nqo1，Gsts，Sult1b1和Ugt1a6）和抗氧化酶（Hmox1，Mt2，Prdx1，Srxn1，Sod1和Gclc），這被認(rèn)為是對(duì)硒蛋白損失的補(bǔ)償。在十二指腸中觀察到最強(qiáng)的效果，其中抗氧化酶的基因被優(yōu)先上調(diào)。這些還包括硒蛋白TrxR1和GPx2的mRNA，它們能夠在硒重新攝入時(shí)立即翻譯表達(dá)。在先前的論文中，觀察到的中度硒缺乏癥中Gsk3β的下調(diào)，為Nrf2途徑的激活提供了可能的解釋，因?yàn)镚sk3β的抑制導(dǎo)致Nrf2的積累。關(guān)鍵詞：硒；Nrf2； II相酶； 腸；氧化應(yīng)激
引言
在哺乳動(dòng)物中，必需的微量元素硒作為硒代半胱氨酸并入硒蛋白活性中心發(fā)揮作用。人類有25個(gè)基因編碼硒蛋白[30]，其中許多涉及氧化還原過程[35]，包括谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）[8]和硫氧還蛋白還原酶（TrxR）[14]。歐洲人口中存在的少量硒缺乏癥可能伴隨著輕微的氧化狀態(tài)[45]。 硒蛋白的表達(dá)取決于細(xì)胞中硒的狀態(tài)。但是，一些微陣列研究表明，硒的可用性也會(huì)影響非硒蛋白的表達(dá)（在[13]中進(jìn)行了綜述）。仍然缺乏基本機(jī)制。硒狀態(tài)碼經(jīng)常影響抗氧化劑防御酶和II期系統(tǒng)的酶[13,44]。一方面，大劑量的硒刺激諸如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）和NADPH：醌氧化還原酶（NQO1）等II期酶的活性。這種作用可以分別通過硒代半胱氨酸硒結(jié)合物[53]和二甲基二硒化物[58]來介導(dǎo)。另一方面，有強(qiáng)有力的證據(jù)證明在硒缺乏時(shí)會(huì)誘導(dǎo)抗氧化劑和II期酶的產(chǎn)生。早在1970年代末期，據(jù)報(bào)道血紅素加氧酶1（HMOX1）[12]以及GST活性在缺硒的大鼠肝臟中有所升高[32]。硒缺乏癥中抗氧化劑和II期酶的補(bǔ)償性上調(diào)的想法進(jìn)一步得到了小鼠的發(fā)現(xiàn)，該小鼠具有針對(duì)器官的靶向去除編碼硒代半胱氨酸t(yī)RNA（Trsp）的基因。肝臟中硒蛋白的完全喪失導(dǎo)致了GSTPi，NQO1和HMOX1的誘導(dǎo)[52]。 參與細(xì)胞抗氧化劑防御和II期排毒的大多數(shù)蛋白質(zhì)基因是由氧化還原和親電敏感的轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子（Nrf2）調(diào)控的（在[16]中進(jìn)行了綜述），該因子與順式作用的抗氧化劑或親電反應(yīng)元件（ARE / EpRE）[48，56]。 Nrf2-/-小鼠對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)的毒性和腫瘤發(fā)生敏感[43]。另外，Nrf2-/-小鼠對(duì)氧化應(yīng)激高度敏感[1]，并具有較低的基礎(chǔ)谷胱甘肽（GSH）水平[47]。在不受刺激的條件下，Nrf2保留在與Keap1結(jié)合的胞質(zhì)溶膠中，Keap1充當(dāng)基于Cul3的E3泛素連接酶的底物銜接子，并靶向Nrf2進(jìn)行降解。靶基因的反式激活是響應(yīng)活性氧（ROS）或親電試劑而引起的，這些試劑修飾Keap1的易感硫醇基團(tuán)，導(dǎo)致核Nrf2蛋白水平迅速提高（在文獻(xiàn)[38]中進(jìn)行了綜述）。 Trsp和Nrf2的同時(shí)破壞消除了II期酶的誘導(dǎo)，從而驗(yàn)證了Nrf2在響應(yīng)硒蛋白丟失中的作用[52]。與飼喂對(duì)照飲食的小鼠相比，飼喂缺硒飲食的ARE報(bào)告小鼠的ARE驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因活性顯著增強(qiáng)[9]。另外，在缺硒的野生型小鼠中觀察到的GST和NQO1活性增加在Nrf2-/-小鼠中無法檢測(cè)到[9]。這提供了飲食中硒缺乏與Nrf2激活之間的第一個(gè)直接聯(lián)系。 基于這些結(jié)果，當(dāng)前的研究集中在邊緣缺硒飲食對(duì)Nrf2調(diào)控基因表達(dá)的影響上。貧硒飲食中小鼠的建議每日允許攝入量（RDA）為一半[28]，反映出生理狀況可能會(huì)因改變營養(yǎng)習(xí)慣或季節(jié)性食物變化而同樣發(fā)??生。分析的目標(biāo)器官是結(jié)腸和十二指腸的腸段，這是抵抗異種生物脅迫的第一道防線，還有肝臟，肝臟高度表達(dá)II期酶。先前研究[28]中獲得的微陣列數(shù)據(jù)的途徑分析未表明Nrf2途徑受到影響，因?yàn)樗贸绦騁enMAPP不包含該途徑的MAPP（微陣列途徑概況）。因此，手動(dòng)鑒定了48個(gè)Nrf2靶基因和12個(gè)經(jīng)典II期酶，并通過qPCR證實(shí)了有趣的候選基因。
材料和方法
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
從先前報(bào)道的動(dòng)物中獲取組織樣品[28]。對(duì)雄性C57BL / 6 J小鼠（3-4周齡）飼喂貧硒（0.086 mg Se / kg）或通過混合硒代蛋氨酸（Acros，比利時(shí)的蓋爾（Geel）陷入貧困的人（德國的拉格（Altromin））。喂養(yǎng)6周后，麻醉的動(dòng)物因頸脫位而被處死。冷凍固定在液氮中的血漿和組織儲(chǔ)存在-80°C下。每組12只動(dòng)物的硒狀態(tài)以血漿硒含量和肝GPx活性為特征，發(fā)現(xiàn)在中等硒缺乏時(shí)分別降低至硒充足的13％和35％[28]。
RNA分離
在液氮冷卻下將組織研磨。將20–30 mg的粉末懸浮在800μl的冷Trizol（Invitrogen，卡爾斯魯厄，德國）中，并用組織裂解器（Qiagen，Hilden，德國）以30 Hz勻化2×2分鐘。根據(jù)制造商的說明，使用Trizol方案分離RNA。用10 U RQ1 DNase（Promega，曼海姆，德國）消化基因組DNA，并通過苯酚-氯仿提取純化RNA。使用NanoDrop ND-1000（Peqlab Biotechnologie GmbH，德國埃爾蘭根）測(cè)量RNA濃度。
芯片分析
如前所述[28]，使用Mouse 44 K芯片（Agilent Technologies，Böblingen，德國）進(jìn)行芯片分析。Student’s t-test檢驗(yàn)可鑒定出顯著調(diào)控的基因（P <0.05）。 實(shí)時(shí)定量PCR 用150 fmol oligo（dT）15引物和180 U莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega）反轉(zhuǎn)錄RNA（3μg），總體積為45μl。
實(shí)時(shí)PCR
（Mx3005PTM QPCR系統(tǒng)，Stratagene，阿姆斯特丹，荷蘭）使用SYBR Green I（Molecular Probes，Eugene，USA）作為熒光報(bào)告物，在25μl反應(yīng)混合物中以1μl十倍稀釋的cDNA一式三份進(jìn)行。所有PCR反應(yīng)的退火溫度分別為60和62°C（表1）。 PCR產(chǎn)物的定量范圍為1×103至1×109個(gè)拷貝的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過將至少一種引物置于PerlPrimer v1.1.14的外顯子/內(nèi)含子邊界上，設(shè)計(jì)引物（表1，Sigma–Aldrich，Taufkirchen，德國）對(duì)cDNA具有特異性。參考基因Rpl13a和Hprt1的平均值用于在結(jié)腸和肝臟中qPCR結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化，而Rpl13a僅用于十二指腸。
表1. 所用底物序列表
表2. 微陣列分析測(cè)量硒對(duì)結(jié)腸Nrf2靶基因作用
組織裂解液的制備
將10 mg磨碎的組織懸浮于含有2μl蛋白酶抑制劑混合物III（Calbiochem，Bad Soden，Germany）的250μl均質(zhì)緩沖液（100 mM Tris-HCl，300 mM KCl，0.01％Triton X-100）中并用組織裂解器（Qiagen）在30 Hz下持續(xù)2×2分鐘。裂解液在21,000×g和4°C下離心15分鐘，然后根據(jù)Bradford [7]評(píng)估蛋白質(zhì)含量。
蛋白質(zhì)印跡
將等分試樣（20μg蛋白/泳道）進(jìn)行SDS-PAGE，并按[5]所述進(jìn)行印跡。用兔抗人NQO1抗血清（1：3,000； ab34173，Abcam，劍橋，英國）檢測(cè)到NQO1。通過兔抗人β-肌動(dòng)蛋白抗血清（1：5,000； ab8229，Abcam）檢測(cè)到的β-肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)部對(duì)照。使用過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔抗體（1：50,000； Chemicon，霍夫海姆，德國）作為二抗。檢測(cè)是在以SuperSignal West Dura（德國波恩的Perbio）為底物的Fuji LAS3000-CCD系統(tǒng)中完成的。用Aida / 2D光密度測(cè)定法4.0軟件（Raytest，Straubenhardt，德國）對(duì)條帶進(jìn)行定量。
NQO1活動(dòng)
根據(jù)[42]測(cè)量雙香豆酚敏感的NQO1活性。在590 nm的微量滴定板吸光度讀取器上追蹤由甲萘醌介導(dǎo)的3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）的還原（Synergy 2，Biotek Instruments GmbH，Bad Friedrichshall，德國），將不同的填充量校正為1厘米的路徑長度。將3μl裂解物與190μl反應(yīng)緩沖液（25 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.665 mg / l BSA，0.01％Tween 20，5μMFAD，1 mM葡萄糖-6-磷酸鹽，30μM一起用于測(cè)定NADP，0.72 mM MTT，0.3 U / ml 6磷酸葡萄糖脫氫酶，50μM甲萘醌），總體積為250μl。 NQO1的活性計(jì)算為有和沒有雙香豆酚時(shí)MTT還原速率之間的差異，使用的還原MTT的消光系數(shù)在590 nm處估計(jì)為11,961（mol / l）-1×cm-1。
統(tǒng)計(jì)分析
比較兩組，通過未配對(duì)的Student’s t-test（GraphPadPrism®5.0版，美國加利福尼亞州圣地亞哥）計(jì)算出顯著差異。 P值<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果
兩個(gè)Nrf2硒蛋白靶基因GPx2和TrxR1是特殊情況，因?yàn)樗鼈兊姆g依賴于硒的可用性及其在層次結(jié)構(gòu)中的排名。 高硒蛋白GPx2 [57]和TrxR1 [10]的mRNA在缺硒結(jié)腸中顯著降低，GPx2受影響小于TrxR1。 相反，兩種酶的mRNA在硒缺乏十二指腸中增強(qiáng)（圖3a，b）。 硒缺乏時(shí)GPx2 mRNA的上調(diào)已經(jīng)在細(xì)胞培養(yǎng)中顯示[57]。 在限制硒條件下mRNA的穩(wěn)定性使得在補(bǔ)充硒后能夠在缺硒細(xì)胞中快速重新合成GPx2 [57]。 兩種觀察都可以作為硒蛋白質(zhì)層次中GPx2高級(jí)別的證據(jù)。NQO1 RNA在缺硒十二指腸中的上調(diào)與NQO1蛋白表達(dá)和活性相關(guān)
在蛋白質(zhì)和活性水平上進(jìn)一步分析NQO1作為Nrf2靶基因的原型。 在十二指腸中，NQO1蛋白和活性在缺硒組中顯著增強(qiáng)（圖4），與增強(qiáng)的mRNA相關(guān)（圖2a）。 在結(jié)腸中，蛋白質(zhì)水平和活性都沒有改變，表明NQO1 mRNA的輕微增加不會(huì)通過增加的翻譯和活性反映出來。
討論
本研究是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的一部分，其中給小鼠喂食符合RDA的小鼠或硒含量降低至約50％的飲食[28]。雖然硒攝入量?jī)H適度減少，但四種硒蛋白SelW，GPx1，SelH和SelM的RNA表達(dá)明顯下調(diào)，Wnt途徑的基因在結(jié)腸中上調(diào)[28]。對(duì)微陣列數(shù)據(jù)的人工分析表明，Nrf2靶基因和II期酶也受硒狀態(tài)的調(diào)節(jié);在結(jié)腸中表達(dá)的60個(gè)基因中，41個(gè)被上調(diào)占68％（表2）。通過qPCR證實(shí)了12種用于抗氧化防御和II期酶的所選基因的表達(dá)（圖1和2）。 Nrf2靶基因在邊緣硒缺乏中的一致上調(diào)是高度相關(guān)的，因?yàn)榇蝺?yōu)的硒供應(yīng)也可能是由人類經(jīng)常消耗的低硒飲食造成的[45]。邊緣硒缺乏的建立與大多數(shù)其他研究高硒補(bǔ)充劑或嚴(yán)重缺硒的研究相反。
圖1.硒缺乏（-Se）小鼠與相對(duì)于不缺硒（+Se）小鼠的結(jié)腸（n = 9）和 十二指腸（n = 6）中抗氧化酶的mRNA表達(dá)分析。 a血紅素加氧酶1（Hmox1），b金屬硫蛋白2（Mt2），c peroxiredoxin 1 (Prdx1), d sulfifiredoxin（Srxn1），e超氧化物歧化酶1（Sod1），f c-谷氨酰半胱氨酸合成酶，催化亞基（Gclc）?；虮磉_(dá)通過qPCR分析，并在十二指腸采用Rpl13a進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。 在結(jié)腸中參考Hprt1和Rpl13a進(jìn)行平均。 * P＜ 0.05； ** P＜ 0.01； 設(shè)置+Se為1,采用t-test分析方法進(jìn)行分析
圖2.硒缺乏（-Se）小鼠與相對(duì)于不缺硒（+Se）小鼠的結(jié)腸（n = 9）和 十二指腸（n = 6）中II相酶的mRNA表達(dá)。NADPH：醌氧化還原酶（Nqo1）， b谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶a1 / a2（Gsta1 / a2），c谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶m1（Gstm1），d谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶p1（Gstp1），e磺基轉(zhuǎn)移酶1b1（Sult1b1），f UDP葡糖醛酸糖基轉(zhuǎn)移酶1a6 a / b （Ugt1a6a / b）?；虮磉_(dá)通過qPCR分析，并在十二指腸采用Rpl13a進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。 在結(jié)腸中參考Hprt1和Rpl13a進(jìn)行平均。 * P＜ 0.05； ** P＜ 0.01； 設(shè)置+Se為1,采用t-test分析方法進(jìn)行分析。
此外，Burk及其同事提供了飲食中硒缺乏和Nrf2激活之間的第一個(gè)直接聯(lián)系，比較了每公斤飼喂0.25毫克亞硒酸鈉的完全缺硒或補(bǔ)充飲食的小鼠[9]。 在硒缺乏條件下，ARE驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因活性以及GST和NQO1活性在野生型小鼠的肝臟中強(qiáng)烈增加，但在Nrf2 - / - 小鼠中沒有變化。 目前的研究表明，邊緣硒缺乏可導(dǎo)致II期酶的上調(diào)，強(qiáng)調(diào)了生物體對(duì)硒體內(nèi)平衡變化的敏感程度。
圖3 硒缺乏（-Se）小鼠與相對(duì)于不缺硒（+Se）小鼠的結(jié)腸（n = 9）和 十二指腸（n = 6）中硒蛋白的mRNA表達(dá)。 a 硫氧還蛋白還原酶1（Txnrd1）， b谷胱甘肽過氧化物酶2（Gpx2），c硒蛋白W（Sepw1）。 基因表達(dá)通過qPCR分析，并在十二指腸采用Rpl13a進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。 在結(jié)腸中參考Hprt1和Rpl13a進(jìn)行平均。 * P＜ 0.05； ** P＜ 0.01； 設(shè)置+Se為1,采用t-test分析方法進(jìn)行分析
圖4. 小鼠十二指腸中的NQO1蛋白表達(dá)和活性測(cè)試。 蛋白質(zhì)測(cè)量通過Western Blot（a）方法，光密度分析與歸一化采用b-actin（b）方法。 通過降低MTT方法（c）來測(cè)量絕對(duì)NQO1活性。 *** P＜ 0.001； 設(shè)置+Se為1,采用t-test分析方法進(jìn)行分析，詳情請(qǐng)參閱“材料和方法”
由于Nrf2靶基因表達(dá)不受肝臟中邊緣硒缺乏的影響（表3），但在腸道中上調(diào)，可以得出結(jié)論，腸道對(duì)減少的硒供應(yīng)更敏感。 在Nrf2 - / - 小鼠的肝臟中，大多數(shù)已知的Nrf2靶基因被下調(diào)，而主要用于解毒的酶在Keap1敲低小鼠中增加，其特征在于Nrf2激活增加[47]。 作者得出結(jié)論，Nrf2的肝臟激活對(duì)于解毒比對(duì)抗氧化防御更重要。 在目前的研究中，在十二指腸中觀察到用于抗氧化防御的酶的明顯上調(diào)。 由于減少的氧化還原狀態(tài)維持腸上皮細(xì)胞增殖并防止早熟細(xì)胞凋亡[3]，對(duì)抗氧化防御酶的更高需求可以解釋目前的發(fā)現(xiàn)。
然而，也有相反的發(fā)現(xiàn)：當(dāng)喂食0.01毫克硒/千克膳食或1毫克/千克時(shí)，解毒基因被硒缺乏下調(diào)[44]。 因此，硒含量相差100倍，而在本研究中，因子僅為2.相互矛盾的結(jié)果（[13]中綜述）可以解釋為超營養(yǎng)飲食可以誘導(dǎo)II期酶更多 比硒缺乏有效。 以超營養(yǎng)飲食作為缺乏飲食的參考，凈效應(yīng)是硒缺乏的下調(diào)。
表3 肝臟中Nrf2靶基因和II期酶的qPCR結(jié)果
低硒含量和高硒含量影響的潛在機(jī)制似乎不同。 高濃度的某些硒化合物或代謝物可通過改變Keap1中的關(guān)鍵硫醇直接激活Nrf2途徑。 反應(yīng)性巰基也可以通過氧化來修飾[22,29]，這種情況在硒缺乏中占主導(dǎo)地位[52,55]。 需要澄清中度缺硒小鼠中較高的氧化狀態(tài)是否是誘導(dǎo)的Nrf2靶基因表達(dá)的原因。
通過敲除肝細(xì)胞中Sec特異性tRNA（Trsp）的基因完全喪失所有硒蛋白，增強(qiáng)了幾種II期酶的表達(dá)，表明至少一種硒蛋白通常抑制Nrf2通路的激活[50]。為了降低推定候選者的數(shù)量，Sengupta及其同事使用了第二只小鼠品系，其中Trsp突變的方式只有管家而非壓力相關(guān)的硒蛋白表達(dá)。這些小鼠沒有對(duì)II期酶的代償性上調(diào)作出反應(yīng)，這表明管家硒蛋白必須阻止Nrf2的活化[50]。由于硫氧還蛋白還原酶家族屬于管家硒蛋白[10]，因此分析了肝臟特異性TrxR1敲除對(duì)Nrf2途徑的潛在激活。實(shí)際上，TrxR1敲除導(dǎo)致Nrf2的核積累和21個(gè)Nrf2靶基因的誘導(dǎo)[51]。 TrxR2，TrxR3或硫氧還蛋白的mRNA水平未受影響。因此，TrxR1似乎抵消Nrf2激活和/或用作Nrf2激活的關(guān)閉信號(hào)。然而，缺乏TrxR1的肝臟未顯示氧化應(yīng)激的證據(jù)，使?jié)撛诘臋C(jī)制不清楚[51]。
硒還影響編碼非硒蛋白的多個(gè)基因的表達(dá)，這些基因可能參與邊緣硒缺乏時(shí)Nrf2通路的特異性激活。 在之前的研究[28]中，我們發(fā)現(xiàn)Wnt通路被激活，表現(xiàn)為b-連環(huán)蛋白，Dvl2，Lef1和c-Myc的表達(dá)增強(qiáng)以及Gsk3β的下調(diào)。 Gsk3β是一種多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶，不僅參與糖原代謝和經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，而且還顯示出使Nrf2通路失活[23,49]。 Fyn激酶被磷酸化，從而被Gsk3β激活。 反過來，Phospho-Fyn使Nrf2磷酸化，導(dǎo)致Nrf2的核輸出[23]。 Gsk3β的活性降低，這可能是在先前研究中硒限制條件下從Gsk3β的下調(diào)推斷出的，可能會(huì)降低活性Fyn的量，從而導(dǎo)致Nrf2的核積累。
邊緣硒缺乏中Nrf2通路的激活與結(jié)直腸癌的發(fā)展有關(guān)。在炎癥引發(fā)的結(jié)腸直腸癌發(fā)生模型中，與野生型小鼠相比，Nrf2 - / - 小鼠的發(fā)病率，多樣性和腫瘤大小增加[25]。一方面，GST，SULT和UGT家族等II期酶參與異生物質(zhì)的結(jié)合和排泄。加上抗氧化酶如過氧化物酶，硫化毒素，Sod1，Hmox1和金屬硫蛋白等基因的上調(diào)，可以保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷。另一方面，Nrf2激活也可能有助于增加藥物輸出，抗藥性和腫瘤細(xì)胞存活[16,31]。因此，不能容易地確定Nrf2靶基因在硒缺乏中對(duì)結(jié)腸直腸癌的上調(diào)的結(jié)果。硒缺乏癥中Wnt途徑的激活指向低硒狀態(tài)的癌癥促進(jìn)功能，并且與硒缺乏中較高的癌癥發(fā)病率一致（在[46]中綜述）。 Nrf2途徑的激活是否是通過內(nèi)源性防御系統(tǒng)的強(qiáng)化來補(bǔ)償硒蛋白的損失的嘗試，或者它是否已經(jīng)有助于癌細(xì)胞的存活，這是進(jìn)一步研究的挑戰(zhàn)。
本文由福山生物整理翻譯，轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明出處。
點(diǎn)擊咨詢
400-113-6988