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具有兩個(gè)氧化還原中心的含硒醌基三唑的合成、抗腫瘤活性及其機(jī)理研究
發(fā)表于：2021-05-13 作者：admin 來源：本站 點(diǎn)擊量：18339
原文：Cruz E , Silvers M A , Jardim G , et al. Synthesis and antitumor activity of selenium-containing quinone-based triazoles possessing two redox centres, and their mechanistic insights[J]. European Journal of Medicinal Chemistry, 2016, 122:1-16.
翻譯：
在對(duì)抗不同類型癌癥的過程中，發(fā)展多種治療方法至關(guān)重要。醌類化合物被認(rèn)為是一種特殊結(jié)構(gòu)，是最重要的抗癌藥物之一。盡管單靶點(diǎn)藥物成功地抑制或激活了特定靶點(diǎn)，能夠同時(shí)作用于多種生物靶點(diǎn)的藥物在新藥設(shè)計(jì)中更具吸引力。在這種情況下，喹諾酮類化合物是一類重要的多目標(biāo)化合物。
天然萘醌類化合物，如從塔貝屬植物心材中分離得到的拉帕醇和β-拉帕醇（β-lap），是研究最多的潛在抗腫瘤活性的化合物之一。Docampo等人發(fā)現(xiàn)β-lap在體外和S-180腫瘤的小鼠中對(duì)肉瘤180腹水腫瘤細(xì)胞（S-180細(xì)胞）有顯著的活性。雖然β-lap對(duì)Yoshida肉瘤和Walker-256癌細(xì)胞的抗腫瘤作用已被研究，但其確切的作用機(jī)制直到最近才被發(fā)現(xiàn)。
β-拉帕醇特異性地破壞內(nèi)含NADP（P）H：醌氧化還原酶1（NQO1）的癌細(xì)胞，而不考慮p53、caspase或細(xì)胞周期狀態(tài)。雖然在臨床試驗(yàn)中，β-lap（即ARQ 501）被錯(cuò)誤地宣傳為細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激活劑，但細(xì)胞死亡的主要決定因素是通過NQO1的表達(dá)。該藥物不是已知多藥耐藥或藥物泵的底物，β-lap細(xì)胞死亡不受細(xì)胞周期位置、致癌因子或促或抗凋亡因子的影響。最后，藥物靶點(diǎn)（即，被）NQO1，一種二期致癌誘導(dǎo)酶‘生物活性化’，該酶也由電離輻射（IR）在一些癌細(xì)胞（但不是正常細(xì)胞）中誘導(dǎo)。
β-Lap作為一種化療藥物的使用由于其高疏水性而受到限制，這種疏水性導(dǎo)致患者高鐵血紅蛋白血癥。當(dāng)與載體羥丙基-β-環(huán)糊精混合時(shí)，載體本身有助于溶血。Ohayon和他的同事們最近闡明了β-lap對(duì)二氫喹啉酶的抑制作用是不可逆的假設(shè)。這些結(jié)果表明，β-Lap的治療作用可能與泛素特異性肽酶2（USP2）氧化有關(guān)，這可能是通過NQO1無效循環(huán)代謝β-lap產(chǎn)生活性氧（ROS）的下游效應(yīng)。NQO1是一個(gè)獨(dú)特的基因，當(dāng)被刪除時(shí)，會(huì)導(dǎo)致對(duì)b-lap和其他NQO1生物活性藥物產(chǎn)生耐藥性，強(qiáng)烈表明被引入的大多數(shù)下游效應(yīng)是NQO1衍生的ROS上調(diào)和細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加的結(jié)果， PARP1過度激活NAD+- Keresis引起NAD+/ATP的快速和顯著損失。
在過去的幾年里，我們的團(tuán)隊(duì)一直致力于合成和評(píng)估拉帕酮對(duì)癌細(xì)胞株的作用。我們發(fā)現(xiàn)了一系列具有改性C-環(huán)的拉帕醇（方案1a），它們對(duì)癌癥譜系具有很強(qiáng)的活性。最近，我們發(fā)現(xiàn)了具有獨(dú)特亞基的生物活性化合物，激發(fā)了人們對(duì)制備醌基三唑類化合物的興趣。最近，Perumal等人用同樣的分子雜交策略制備了具有抗細(xì)菌活性的氨基-1,4-萘醌-三唑類化合物。對(duì)MDA-MB-435癌細(xì)胞而言，β-拉帕醇基1,2,3-三唑具有顯著的活性，其IC50值小于2μM。這些化合物通過一種明顯的凋亡細(xì)胞死亡機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞死亡，這種機(jī)制與顯著的活性氧生成有關(guān)。在1，4-萘醌中插入三唑部分的方法也很有效，因?yàn)檫@個(gè)單元被稱為有效的藥效基團(tuán)。最近，1,4-萘醌基1,2,3-三唑類化合物（方案1a）在HL-60人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中被報(bào)道具有1.4-1.9μM的高活性。
從另一個(gè)角度看，有機(jī)硒化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗神經(jīng)變性和抗病毒的特性。一系列的硒蛋白參與了重要的生理過程。Jocob和同事展示了硒仿醌（方案1b）潛在的抗腫瘤活性，其能夠模仿人酶谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的酶活性。GPx靶向氧化還原敏感的硫醇蛋白，同時(shí)在臨界閾值產(chǎn)生活性氧。因此，這些藥物充當(dāng)活性氧使用者和活性氧增強(qiáng)劑，影響下游目標(biāo)。這一作用將補(bǔ)充β-lap的作用機(jī)制，因?yàn)樵撛噭┮鸬乃劳鲆蕾囉谟蒖OS（H2O2）刺激的PARP1的過度激活。
在繼續(xù)獲得新的有效抗腫瘤萘醌的項(xiàng)目中，根據(jù)我們小組最近報(bào)告的發(fā)現(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)了含有β-lap的有效查爾根（方案1b）。在這里，我們描述了15種新的含硒醌類化合物，我們的策略是插入這個(gè)藥效團(tuán)，生成含1,2,3-三唑硒的拉帕酮（方案1c）。所選的萘醌對(duì)幾種癌細(xì)胞株具有識(shí)別活性的結(jié)構(gòu)框架，用于制備新化合物。這些結(jié)構(gòu)被設(shè)計(jì)成可能導(dǎo)致NQO1細(xì)胞死亡的多靶配體。
2、結(jié)構(gòu)與討論
2.1 化學(xué)
第一類具有兩個(gè)氧化還原中心的化合物是從拉帕醇（1）中獲得的含硒二氫吡喃萘醌（方案2）。以1為原料，經(jīng)酸催化環(huán)合制備了α-拉帕酮2，并以2為原料合成了含硒衍生物6和7。化合物6，由銅（I）催化化合物4與（疊氮甲基）（苯基）硅烷的點(diǎn)擊反應(yīng)以中等產(chǎn)率（75%）制備。中間體4是由3-乙炔基苯胺和溴代衍生物3反應(yīng)得到的。如前所述，在二氯甲烷中3與疊氮化鈉反應(yīng)容易合成4-疊氮-a-拉帕酮（5）。5與苯基炔丙基硒化物的反應(yīng)得到含硒的α-拉帕酮1,2,3-三唑7。最后，從我們報(bào)道的疊氮化物衍生物9中，得到紅色固體β-lap基1，2，3-三唑10。化合物3-10是外消旋的。然而，化合物9和10是單非對(duì)映體，相對(duì)立體化學(xué)是反式的。通過與先前報(bào)道的數(shù)據(jù)對(duì)比，證實(shí)了反式立體化學(xué)。
我們開始合成含硒二氫呋喃萘醌，這是第二類化合物，最初是通過合成nor-α-拉帕醇衍生物15和16（方案3）。由于芳胺取代的拉帕酮和疊氮醌的合成在本組中已得到充分的證實(shí)，因此如方案3所示制備了化合物13和14。采用點(diǎn)擊法，化合物13和14分別與含硒疊氮化物和炔烴反應(yīng)，得到萘醌15和16，產(chǎn)率分別為70%和80%。
以nor-拉帕醇（17）為原料，采用Pinto和同事描述的方法合成溴中間體18（方案4）。報(bào)道了由18而來的不同抗腫瘤化合物的合成，如芳胺基和烷氧基取代的nor-β-拉帕醇，在1,2,3-三唑基存在下的拉帕醇和硫酮的雜化物?；谙惹懊枋龅木哂锌拱┗钚缘幕衔?，制備了帶有末端炔基的未公開發(fā)表的芳胺基取代的拉帕酮19。本文所述含硒1,2,3-三唑21從19形成，使我們能夠得到設(shè)計(jì)有兩個(gè)氧化還原中心的產(chǎn)品。使用上述相同的策略，化合物22從疊氮化物衍生物20中獲得，先前由我們小組報(bào)告（方案4）。
在這一點(diǎn)上，我們描述了從其亞同系物拉帕醇（1）和非拉帕醇（17）中獲得的拉帕酮的合成。最近，我們報(bào)道了一類新的萘醌類化合物的合成，該類化合物由C-烯丙基指甲花醌（23）合成，含有1，2，3-三唑基序。23的碘化反應(yīng)得到了68%的產(chǎn)率和1:1的比例（方案5）的化合物24和27，它們很容易被柱色譜分離。在這些化合物的作用下，疊氮化鈉與二甲基甲酰胺反應(yīng)合成了疊氮化物衍生物，化合物25和28。通過銅催化疊氮炔環(huán)加成反應(yīng)制備了相應(yīng)的硒衍生物化合物26和29（方案5）。
1，4-萘醌與含硒的1，2，3-三唑偶聯(lián)也是我們的研究課題。從化合物33-35和39中，使用先前討論的方法制備了相應(yīng)的三唑衍生物，化合物36-38和40（方案6）。得到了合適的化合物35和38的晶體，并用晶體學(xué)方法對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。
最近，我們報(bào)道了一種直接的方法來獲得對(duì)映體富集的α-拉帕酮衍生物。為了鑒定新的對(duì)映體富集的抗腫瘤化合物，利用指甲花醌（41）與手性方酰胺通過有機(jī)催化制備了硝基衍生物42和43（方案7）。用NiCl2.6H2O/NaBH4將醌的硝基還原為氨基，得到了氨基醌44和45。由于不穩(wěn)定，這些化合物在合成后立即用于在重氮轉(zhuǎn)移反應(yīng)后制備疊氮醌46和47。在最后一步中，我們采用經(jīng)典的點(diǎn)擊法，在二氯甲烷和水的1:1混合物中，通過抗壞血酸鈉和硫酸銅（II）的催化作用，與苯基丙炔硒醚反應(yīng)，制備了含1,2,3-三唑48和49的硫系化合物。
通過1H、13C NMR和2D NMR譜（COSY、HMBC和HSQC）測(cè)定了新化合物4、6、7、10、13、15、16、19、21、22、26、29、36、37、38、40、48和49的結(jié)構(gòu)。還獲得了電噴霧電離質(zhì)譜，以確認(rèn)化合物的特性。
2.2 生物學(xué)研究
所有含硒醌基1,2,3-三唑類化合物（方案2-7）及其合成前體均采用MTT法對(duì)六種腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行體外評(píng)價(jià)：HL-60（人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞，NQO1-）、HCT-116（人結(jié)腸癌細(xì)胞，NQO1）、PC3（人前列腺細(xì)胞，NQO1+）、SF295（人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，NQO1+），MDA-MB-435（黑色素瘤細(xì)胞，NQO1+）和OVCAR-8（人卵巢癌細(xì)胞，NQO1+）。β-拉帕酮和阿霉素作為陽性對(duì)照（表1）。NQO1-正常細(xì)胞、人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）和小鼠成纖維細(xì)胞永生化細(xì)胞系（V79和L929）評(píng)價(jià)化合物的選擇性。還使用相當(dāng)特異的NQO1抑制劑雙香豆素對(duì)所選化合物的NQO1-依賴性的機(jī)制方面進(jìn)行了研究。如前所述，根據(jù)其活性將化合物分類為高活性（IC50<2 μM）、中等活性（2 μM50<10 μM）或非活性（IC50>10 μM）。
結(jié)果表明，大多數(shù)化合物對(duì)所評(píng)價(jià)的所有癌細(xì)胞株都有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，IC50值<2 μM。總的來說，鄰喹諾酮類化合物比對(duì)苯二酚更為活躍。然而，還發(fā)現(xiàn)了具有強(qiáng)抗腫瘤活性的α-拉帕酮衍生物。
萘并吡喃醌5-7、9和10具有高到中等的活性（IC50在0.92-5.46μM范圍內(nèi)），非活性化合物4是這類化合物的例外。對(duì)于含硒醌6和10，插入第二氧化還原中心的策略是成功的，并且這些衍生物比其萘醌前體更為活躍。對(duì)于含硒醌6和10，插入第二氧化還原中心的策略是成功的，并且這些衍生物比其萘醌前體更為活躍。近年來，我們報(bào)道了幾種α-拉帕酮基1，2，3-三唑類化合物的合成及其抗腫瘤活性。值得注意的是，含硒的1，2，3-三唑7比不含硫鍵的化合物表現(xiàn)出更好的活性。
萘呋喃醌是第二類化合物。對(duì)萘醌15和16對(duì)所研究的所有癌細(xì)胞株都有活性。在過去的幾年中，我們描述了從lapachol（1）中獲得的非α-lapachone基1,2,3-三唑，其IC50值大于2μM。本文中用于在硒存在下制備化合物15和16的策略提高了基于nor-α-lapachone的1,2,3-三唑類化合物的活性，并且這些衍生物的IC50值在0.68-1.71μM（15）和1.59-2.95μM（16）。
Nor-β-lapachone及其衍生物是來自lapachol基團(tuán)的最有效的化合物之一。最近，我們還展示了Nor-β-lapachone在人淋巴細(xì)胞、HL-60白血病和永生正常小鼠V79成纖維細(xì)胞中的細(xì)胞毒性和遺傳毒性，其范圍為2.5～5μM。該化合物未能誘導(dǎo)非腫瘤細(xì)胞DNA損傷，但在最高濃度下，它誘導(dǎo)DNA單鏈和雙鏈斷裂，增加染色體畸變的頻率。它的生物學(xué)效應(yīng)與其消耗谷胱甘肽（GSH）的能力有關(guān)，它導(dǎo)致了一種親細(xì)胞的親氧化細(xì)胞狀態(tài)，從而促進(jìn)了它的抗增殖特性。
在此背景下，我們描述了nor-β-lapachones的有效抗腫瘤活性。重要的是，C-環(huán)修飾的，帶有芳胺基的nor-β-lapachones是所描述的最活躍的lapachones。這些化合物在人髓系白血病細(xì)胞系中具有顯著的抗增殖作用，并通過ROS產(chǎn)生氧化性DNA損傷。它們也以某種方式損害DNA修復(fù)活性，同時(shí)引發(fā)細(xì)胞死亡，這可能是細(xì)胞凋亡?；衔?strong>21是根據(jù)先前使用這些生物活性拉帕酮的經(jīng)驗(yàn)設(shè)計(jì)的。該化合物包含先前報(bào)道的3-芳胺基-nor-β-拉帕酮衍生物的結(jié)構(gòu)框架，但通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)插入了第二個(gè)氧化還原硫族中心。這種物質(zhì)對(duì)所有被評(píng)估的癌細(xì)胞系都具有高度的活性，IC50值在0.07到0.38μM之間。此外，化合物21具有高選擇性指數(shù)（SI表示為正常細(xì)胞和不同的癌細(xì)胞株之間的細(xì)胞毒性比率）。例如，PBMC vs HL-60=19.8。相比之下，阿霉素，一種臨床上用于治療各種癌癥的標(biāo)準(zhǔn)藥物，其選擇性指數(shù)值為10.6。同樣，化合物22（IC50在1.06-2.56μM范圍內(nèi)）比不含硫族原子的nor-β-lapachone基1,2,3-三唑更具活性。本文報(bào)道了成功制備具有兩個(gè)氧化還原中心的強(qiáng)抗腫瘤醌的兩個(gè)重要實(shí)例?；衔?strong>26，另一種從胼胝酰指甲花醌（23）中獲得的nor-lapachone衍生物，也表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗腫瘤活性。這種藥物被認(rèn)為是高度活躍的，其IC50值在0.07到0.29μM之間，表明其具有高度活躍的結(jié)構(gòu)。化合物21和26具有類似的抗腫瘤活性，顯示了正萘氟烷醌部分和三唑硒基團(tuán)的重要性，它們可能在相同兩個(gè)氧化還原中心結(jié)構(gòu)中協(xié)同工作。
還評(píng)估了1,4-萘醌36-40，這些化合物被認(rèn)為是中等活性的，但化合物40對(duì)所檢測(cè)的所有癌細(xì)胞都不起作用。最后評(píng)估的化合物是不對(duì)稱的a-拉帕酮48和49，這些物質(zhì)是不活躍的。正如我們最近所描述的，不對(duì)稱的a-拉帕酮衍生物對(duì)所評(píng)估的幾種癌細(xì)胞系無效。在此，我們?cè)噲D通過在這些醌類化合物中插入硫的方法來提高它們的活性，但這一策略失敗了。表2總結(jié)了最活躍化合物的選擇性指數(shù)。
我們實(shí)驗(yàn)室先前的研究表明，化合物50-53（圖1）可被視為具有對(duì)抗多種癌細(xì)胞的有效抗腫瘤活性的原型。為了加深我們對(duì)化合物50-53作用機(jī)理的認(rèn)識(shí)，并將先前報(bào)道的結(jié)構(gòu)與含硒的拉帕酮為基礎(chǔ)的1,2,3-三唑類化合物進(jìn)行比較，我們用設(shè)定的2小時(shí)暴露研究其潛在的NQO1依賴性細(xì)胞毒性，有或沒有NQO1抑制劑二糖醇。與相關(guān)正常組織相比，這種暴露利用了大多數(shù)實(shí)體癌中NQO1水平的升高。在含硒醌類化合物中，我們選擇了化合物21和22，以通過NQO1依賴機(jī)制評(píng)估其特性。
NQO1依賴性評(píng)估。在所測(cè)試的藥物濃度范圍內(nèi)，該化合物對(duì)人肺腺癌A549（肺泡基底上皮細(xì)胞系）有活性。這些細(xì)胞表達(dá)高水平的NQO1（3000+300個(gè)酶單位）。由于添加了雙香豆素（DIC，一種NQO1抑制劑），許多受試化合物的細(xì)胞死亡是NQO1特異性的。根據(jù)存活曲線（圖2），先前報(bào)道的芳胺取代的nor-β-lapachone預(yù)測(cè)了IC50如下，化合物：50=2.6μM，51=1.8μM，52=2.4μM和53=1.3μM。化合物53在狹窄的治療窗口內(nèi)顯示出最顯著的殺傷力，從0.8μM的93%存活率上升到1.6μM的11%?？偟膩碚f，化合物50-53是NQO1特異性藥物，其IC50值與β-拉帕酮相似或更低?；衔?strong>21和22，含硒醌，其IC50值分別為0.64和1.2μM，是該系列中最活躍的，并且具有NQO1依賴性（表3）。他們展示了巨大的治療窗口，使用DIC治療作為對(duì)NQO1細(xì)胞反應(yīng)的替代物，如對(duì)幾乎所有人類正常組織的治療。這些反應(yīng)是NQO1依賴性的無效的氧化還原循環(huán)，這些藥物產(chǎn)生大量的活性氧，特別是H2O2，最終導(dǎo)致PARP1過度活化和程序性壞死。
磷脂酰絲氨酸的外化被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過程中的一個(gè)重要標(biāo)志。經(jīng)處理后，所選化合物21和22誘導(dǎo)細(xì)胞表面表達(dá)磷脂酰絲氨酸的PC3細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖3）。另一方面，在21和22暴露前用NAC預(yù)處理的培養(yǎng)物或與雙香豆素聯(lián)合處理的培養(yǎng)物中未觀察到磷脂酰絲氨酸外化（圖3）。我們的數(shù)據(jù)表明，測(cè)試化合物的細(xì)胞毒性機(jī)制可能涉及醌還原酶NQO1的藥物生物還原，以及強(qiáng)調(diào)ROS對(duì)細(xì)胞毒性的貢獻(xiàn)，這表明受試化合物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與ROS產(chǎn)生相關(guān)。最后，證實(shí)了這些研究，我們觀察到化合物21短時(shí)間暴露（1h）導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。另一方面，在用NAC預(yù)暴露的培養(yǎng)物中，化合物21不能產(chǎn)生ROS，這可以通過NAC行使的抗氧化保護(hù)來解釋。
3、結(jié)論
通過將兩個(gè)氧化還原中心、一個(gè)喹諾酮類部分和硒原子連接起來的策略，我們制備并評(píng)價(jià)了新的和多種含硒的醌基1,2,3-三唑化合物對(duì)正常細(xì)胞系的抗癌活性。我們?cè)u(píng)估了這些藥物的總體殺傷力（表1）以及NQO1的具體作用。總的來說，我們的方法是有效的，并且我們鑒定了IC50值低于0.3 μM的化合物，這些化合物比β-拉帕酮或阿霉素（一種用于治療幾種癌癥的標(biāo)準(zhǔn)臨床藥物）更有效。我們還研究了另外兩種活性化合物21和22的功效，發(fā)現(xiàn)它們被NQO1特異性地生物活性化，比我們之前發(fā)表的nor-β-lapachone具有更高的效價(jià)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)，這些藥物中含有谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）樣活性，所選擇的硒含有nor-β-拉帕酮基1，2，3-三唑，是最有效的，并且在這兩個(gè)靶標(biāo)上起作用。Annexin V細(xì)胞計(jì)數(shù)分析也被用于可視化化合物21和22的活細(xì)胞、早細(xì)胞和晚期凋亡階段的細(xì)胞群。21和22的細(xì)胞毒性機(jī)制與ROS對(duì)細(xì)胞毒性的貢獻(xiàn)本質(zhì)上相關(guān)，提示凋亡與ROS產(chǎn)生有關(guān)。在此基礎(chǔ)上，我們描述了不同種類的醌類、鄰喹啉類和對(duì)苯二酚類化合物的抗腫瘤活性。例如，化合物29（對(duì)苯二酚）在所評(píng)估的癌細(xì)胞系中具有0.62-2.42μM范圍內(nèi)的IC50。以化合物10、21、22和26為例，鄰醌的IC50在0.07-2.52μM之間。最后，我們已經(jīng)描述了有效的抗腫瘤萘醌化合物，這些化合物作為治療過度表達(dá)NQO1的癌癥的有希望的分子出現(xiàn)。
翻譯：
具有兩個(gè)氧化還原中心的含硒醌基三唑的合成、抗腫瘤活性及其機(jī)理研究
1、介紹在對(duì)抗不同類型癌癥的過程中，發(fā)展多種治療方法至關(guān)重要。醌類化合物被認(rèn)為是一種特殊結(jié)構(gòu)，是最重要的抗癌藥物之一。盡管單靶點(diǎn)藥物成功地抑制或激活了特定靶點(diǎn)，能夠同時(shí)作用于多種生物靶點(diǎn)的藥物在新藥設(shè)計(jì)中更具吸引力。在這種情況下，喹諾酮類化合物是一類重要的多目標(biāo)化合物。
天然萘醌類化合物，如從塔貝屬植物心材中分離得到的拉帕醇和β-拉帕醇（β-lap），是研究最多的潛在抗腫瘤活性的化合物之一。Docampo等人發(fā)現(xiàn)β-lap在體外和S-180腫瘤的小鼠中對(duì)肉瘤180腹水腫瘤細(xì)胞（S-180細(xì)胞）有顯著的活性。雖然β-lap對(duì)Yoshida肉瘤和Walker-256癌細(xì)胞的抗腫瘤作用已被研究，但其確切的作用機(jī)制直到最近才被發(fā)現(xiàn)。
β-拉帕醇特異性地破壞內(nèi)含NADP（P）H：醌氧化還原酶1（NQO1）的癌細(xì)胞，而不考慮p53、caspase或細(xì)胞周期狀態(tài)。雖然在臨床試驗(yàn)中，β-lap（即ARQ 501）被錯(cuò)誤地宣傳為細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激活劑，但細(xì)胞死亡的主要決定因素是通過NQO1的表達(dá)。該藥物不是已知多藥耐藥或藥物泵的底物，β-lap細(xì)胞死亡不受細(xì)胞周期位置、致癌因子或促或抗凋亡因子的影響。最后，藥物靶點(diǎn)（即，被）NQO1，一種二期致癌誘導(dǎo)酶‘生物活性化’，該酶也由電離輻射（IR）在一些癌細(xì)胞（但不是正常細(xì)胞）中誘導(dǎo)。
β-Lap作為一種化療藥物的使用由于其高疏水性而受到限制，這種疏水性導(dǎo)致患者高鐵血紅蛋白血癥。當(dāng)與載體羥丙基-β-環(huán)糊精混合時(shí)，載體本身有助于溶血。Ohayon和他的同事們最近闡明了β-lap對(duì)二氫喹啉酶的抑制作用是不可逆的假設(shè)。這些結(jié)果表明，β-Lap的治療作用可能與泛素特異性肽酶2（USP2）氧化有關(guān)，這可能是通過NQO1無效循環(huán)代謝β-lap產(chǎn)生活性氧（ROS）的下游效應(yīng)。NQO1是一個(gè)獨(dú)特的基因，當(dāng)被刪除時(shí)，會(huì)導(dǎo)致對(duì)b-lap和其他NQO1生物活性藥物產(chǎn)生耐藥性，強(qiáng)烈表明被引入的大多數(shù)下游效應(yīng)是NQO1衍生的ROS上調(diào)和細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加的結(jié)果， PARP1過度激活NAD+- Keresis引起NAD+/ATP的快速和顯著損失。
在過去的幾年里，我們的團(tuán)隊(duì)一直致力于合成和評(píng)估拉帕酮對(duì)癌細(xì)胞株的作用。我們發(fā)現(xiàn)了一系列具有改性C-環(huán)的拉帕醇（方案1a），它們對(duì)癌癥譜系具有很強(qiáng)的活性。最近，我們發(fā)現(xiàn)了具有獨(dú)特亞基的生物活性化合物，激發(fā)了人們對(duì)制備醌基三唑類化合物的興趣。最近，Perumal等人用同樣的分子雜交策略制備了具有抗細(xì)菌活性的氨基-1,4-萘醌-三唑類化合物。對(duì)MDA-MB-435癌細(xì)胞而言，β-拉帕醇基1,2,3-三唑具有顯著的活性，其IC50值小于2μM。這些化合物通過一種明顯的凋亡細(xì)胞死亡機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞死亡，這種機(jī)制與顯著的活性氧生成有關(guān)。在1，4-萘醌中插入三唑部分的方法也很有效，因?yàn)檫@個(gè)單元被稱為有效的藥效基團(tuán)。最近，1,4-萘醌基1,2,3-三唑類化合物（方案1a）在HL-60人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中被報(bào)道具有1.4-1.9μM的高活性。
從另一個(gè)角度看，有機(jī)硒化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗神經(jīng)變性和抗病毒的特性。一系列的硒蛋白參與了重要的生理過程。Jocob和同事展示了硒仿醌（方案1b）潛在的抗腫瘤活性，其能夠模仿人酶谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的酶活性。GPx靶向氧化還原敏感的硫醇蛋白，同時(shí)在臨界閾值產(chǎn)生活性氧。因此，這些藥物充當(dāng)活性氧使用者和活性氧增強(qiáng)劑，影響下游目標(biāo)。這一作用將補(bǔ)充β-lap的作用機(jī)制，因?yàn)樵撛噭┮鸬乃劳鲆蕾囉谟蒖OS（H2O2）刺激的PARP1的過度激活。
在繼續(xù)獲得新的有效抗腫瘤萘醌的項(xiàng)目中，根據(jù)我們小組最近報(bào)告的發(fā)現(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)了含有β-lap的有效查爾根（方案1b）。在這里，我們描述了15種新的含硒醌類化合物，我們的策略是插入這個(gè)藥效團(tuán)，生成含1,2,3-三唑硒的拉帕酮（方案1c）。所選的萘醌對(duì)幾種癌細(xì)胞株具有識(shí)別活性的結(jié)構(gòu)框架，用于制備新化合物。這些結(jié)構(gòu)被設(shè)計(jì)成可能導(dǎo)致NQO1細(xì)胞死亡的多靶配體。
2、結(jié)構(gòu)與討論
2.1 化學(xué)
第一類具有兩個(gè)氧化還原中心的化合物是從拉帕醇（1）中獲得的含硒二氫吡喃萘醌（方案2）。以1為原料，經(jīng)酸催化環(huán)合制備了α-拉帕酮2，并以2為原料合成了含硒衍生物6和7。化合物6，由銅（I）催化化合物4與（疊氮甲基）（苯基）硅烷的點(diǎn)擊反應(yīng)以中等產(chǎn)率（75%）制備。中間體4是由3-乙炔基苯胺和溴代衍生物3反應(yīng)得到的。如前所述，在二氯甲烷中3與疊氮化鈉反應(yīng)容易合成4-疊氮-a-拉帕酮（5）。5與苯基炔丙基硒化物的反應(yīng)得到含硒的α-拉帕酮1,2,3-三唑7。最后，從我們報(bào)道的疊氮化物衍生物9中，得到紅色固體β-lap基1，2，3-三唑10。化合物3-10是外消旋的。然而，化合物9和10是單非對(duì)映體，相對(duì)立體化學(xué)是反式的。通過與先前報(bào)道的數(shù)據(jù)對(duì)比，證實(shí)了反式立體化學(xué)。
我們開始合成含硒二氫呋喃萘醌，這是第二類化合物，最初是通過合成nor-α-拉帕醇衍生物15和16（方案3）。由于芳胺取代的拉帕酮和疊氮醌的合成在本組中已得到充分的證實(shí)，因此如方案3所示制備了化合物13和14。采用點(diǎn)擊法，化合物13和14分別與含硒疊氮化物和炔烴反應(yīng)，得到萘醌15和16，產(chǎn)率分別為70%和80%。
以nor-拉帕醇（17）為原料，采用Pinto和同事描述的方法合成溴中間體18（方案4）。報(bào)道了由18而來的不同抗腫瘤化合物的合成，如芳胺基和烷氧基取代的nor-β-拉帕醇，在1,2,3-三唑基存在下的拉帕醇和硫酮的雜化物?；谙惹懊枋龅木哂锌拱┗钚缘幕衔?，制備了帶有末端炔基的未公開發(fā)表的芳胺基取代的拉帕酮19。本文所述含硒1,2,3-三唑21從19形成，使我們能夠得到設(shè)計(jì)有兩個(gè)氧化還原中心的產(chǎn)品。使用上述相同的策略，化合物22從疊氮化物衍生物20中獲得，先前由我們小組報(bào)告（方案4）。
在這一點(diǎn)上，我們描述了從其亞同系物拉帕醇（1）和非拉帕醇（17）中獲得的拉帕酮的合成。最近，我們報(bào)道了一類新的萘醌類化合物的合成，該類化合物由C-烯丙基指甲花醌（23）合成，含有1，2，3-三唑基序。23的碘化反應(yīng)得到了68%的產(chǎn)率和1:1的比例（方案5）的化合物24和27，它們很容易被柱色譜分離。在這些化合物的作用下，疊氮化鈉與二甲基甲酰胺反應(yīng)合成了疊氮化物衍生物，化合物25和28。通過銅催化疊氮炔環(huán)加成反應(yīng)制備了相應(yīng)的硒衍生物化合物26和29（方案5）。
1，4-萘醌與含硒的1，2，3-三唑偶聯(lián)也是我們的研究課題。從化合物33-35和39中，使用先前討論的方法制備了相應(yīng)的三唑衍生物，化合物36-38和40（方案6）。得到了合適的化合物35和38的晶體，并用晶體學(xué)方法對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。
最近，我們報(bào)道了一種直接的方法來獲得對(duì)映體富集的α-拉帕酮衍生物。為了鑒定新的對(duì)映體富集的抗腫瘤化合物，利用指甲花醌（41）與手性方酰胺通過有機(jī)催化制備了硝基衍生物42和43（方案7）。用NiCl2.6H2O/NaBH4將醌的硝基還原為氨基，得到了氨基醌44和45。由于不穩(wěn)定，這些化合物在合成后立即用于在重氮轉(zhuǎn)移反應(yīng)后制備疊氮醌46和47。在最后一步中，我們采用經(jīng)典的點(diǎn)擊法，在二氯甲烷和水的1:1混合物中，通過抗壞血酸鈉和硫酸銅（II）的催化作用，與苯基丙炔硒醚反應(yīng)，制備了含1,2,3-三唑48和49的硫系化合物。
通過1H、13C NMR和2D NMR譜（COSY、HMBC和HSQC）測(cè)定了新化合物4、6、7、10、13、15、16、19、21、22、26、29、36、37、38、40、48和49的結(jié)構(gòu)。還獲得了電噴霧電離質(zhì)譜，以確認(rèn)化合物的特性。
2.2 生物學(xué)研究
所有含硒醌基1,2,3-三唑類化合物（方案2-7）及其合成前體均采用MTT法對(duì)六種腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行體外評(píng)價(jià)：HL-60（人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞，NQO1-）、HCT-116（人結(jié)腸癌細(xì)胞，NQO1）、PC3（人前列腺細(xì)胞，NQO1+）、SF295（人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，NQO1+），MDA-MB-435（黑色素瘤細(xì)胞，NQO1+）和OVCAR-8（人卵巢癌細(xì)胞，NQO1+）。β-拉帕酮和阿霉素作為陽性對(duì)照（表1）。NQO1-正常細(xì)胞、人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）和小鼠成纖維細(xì)胞永生化細(xì)胞系（V79和L929）評(píng)價(jià)化合物的選擇性。還使用相當(dāng)特異的NQO1抑制劑雙香豆素對(duì)所選化合物的NQO1-依賴性的機(jī)制方面進(jìn)行了研究。如前所述，根據(jù)其活性將化合物分類為高活性（IC50<2 μM）、中等活性（2 μM
結(jié)果表明，大多數(shù)化合物對(duì)所評(píng)價(jià)的所有癌細(xì)胞株都有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，IC50值<2 μM。總的來說，鄰喹諾酮類化合物比對(duì)苯二酚更為活躍。然而，還發(fā)現(xiàn)了具有強(qiáng)抗腫瘤活性的α-拉帕酮衍生物。
萘并吡喃醌5-7、9和10具有高到中等的活性（IC50在0.92-5.46μM范圍內(nèi)），非活性化合物4是這類化合物的例外。對(duì)于含硒醌6和10，插入第二氧化還原中心的策略是成功的，并且這些衍生物比其萘醌前體更為活躍。對(duì)于含硒醌6和10，插入第二氧化還原中心的策略是成功的，并且這些衍生物比其萘醌前體更為活躍。近年來，我們報(bào)道了幾種α-拉帕酮基1，2，3-三唑類化合物的合成及其抗腫瘤活性。值得注意的是，含硒的1，2，3-三唑7比不含硫鍵的化合物表現(xiàn)出更好的活性。
萘呋喃醌是第二類化合物。對(duì)萘醌15和16對(duì)所研究的所有癌細(xì)胞株都有活性。在過去的幾年中，我們描述了從lapachol（1）中獲得的非α-lapachone基1,2,3-三唑，其IC50值大于2μM。本文中用于在硒存在下制備化合物15和16的策略提高了基于nor-α-lapachone的1,2,3-三唑類化合物的活性，并且這些衍生物的IC50值在0.68-1.71μM（15）和1.59-2.95μM（16）。
Nor-β-lapachone及其衍生物是來自lapachol基團(tuán)的最有效的化合物之一。最近，我們還展示了Nor-β-lapachone在人淋巴細(xì)胞、HL-60白血病和永生正常小鼠V79成纖維細(xì)胞中的細(xì)胞毒性和遺傳毒性，其范圍為2.5～5μM。該化合物未能誘導(dǎo)非腫瘤細(xì)胞DNA損傷，但在最高濃度下，它誘導(dǎo)DNA單鏈和雙鏈斷裂，增加染色體畸變的頻率。它的生物學(xué)效應(yīng)與其消耗谷胱甘肽（GSH）的能力有關(guān)，它導(dǎo)致了一種親細(xì)胞的親氧化細(xì)胞狀態(tài)，從而促進(jìn)了它的抗增殖特性。
在此背景下，我們描述了nor-β-lapachones的有效抗腫瘤活性。重要的是，C-環(huán)修飾的，帶有芳胺基的nor-β-lapachones是所描述的最活躍的lapachones。這些化合物在人髓系白血病細(xì)胞系中具有顯著的抗增殖作用，并通過ROS產(chǎn)生氧化性DNA損傷。它們也以某種方式損害DNA修復(fù)活性，同時(shí)引發(fā)細(xì)胞死亡，這可能是細(xì)胞凋亡?；衔?strong>21是根據(jù)先前使用這些生物活性拉帕酮的經(jīng)驗(yàn)設(shè)計(jì)的。該化合物包含先前報(bào)道的3-芳胺基-nor-β-拉帕酮衍生物的結(jié)構(gòu)框架，但通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)插入了第二個(gè)氧化還原硫族中心。這種物質(zhì)對(duì)所有被評(píng)估的癌細(xì)胞系都具有高度的活性，IC50值在0.07到0.38μM之間。此外，化合物21具有高選擇性指數(shù)（SI表示為正常細(xì)胞和不同的癌細(xì)胞株之間的細(xì)胞毒性比率）。例如，PBMC vs HL-60=19.8。相比之下，阿霉素，一種臨床上用于治療各種癌癥的標(biāo)準(zhǔn)藥物，其選擇性指數(shù)值為10.6。同樣，化合物22（IC50在1.06-2.56μM范圍內(nèi)）比不含硫族原子的nor-β-lapachone基1,2,3-三唑更具活性。本文報(bào)道了成功制備具有兩個(gè)氧化還原中心的強(qiáng)抗腫瘤醌的兩個(gè)重要實(shí)例?；衔?strong>26，另一種從胼胝酰指甲花醌（23）中獲得的nor-lapachone衍生物，也表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗腫瘤活性。這種藥物被認(rèn)為是高度活躍的，其IC50值在0.07到0.29μM之間，表明其具有高度活躍的結(jié)構(gòu)。化合物21和26具有類似的抗腫瘤活性，顯示了正萘氟烷醌部分和三唑硒基團(tuán)的重要性，它們可能在相同兩個(gè)氧化還原中心結(jié)構(gòu)中協(xié)同工作。
還評(píng)估了1,4-萘醌36-40，這些化合物被認(rèn)為是中等活性的，但化合物40對(duì)所檢測(cè)的所有癌細(xì)胞都不起作用。最后評(píng)估的化合物是不對(duì)稱的a-拉帕酮48和49，這些物質(zhì)是不活躍的。正如我們最近所描述的，不對(duì)稱的a-拉帕酮衍生物對(duì)所評(píng)估的幾種癌細(xì)胞系無效。在此，我們?cè)噲D通過在這些醌類化合物中插入硫的方法來提高它們的活性，但這一策略失敗了。表2總結(jié)了最活躍化合物的選擇性指數(shù)。
我們實(shí)驗(yàn)室先前的研究表明，化合物50-53（圖1）可被視為具有對(duì)抗多種癌細(xì)胞的有效抗腫瘤活性的原型。為了加深我們對(duì)化合物50-53作用機(jī)理的認(rèn)識(shí)，并將先前報(bào)道的結(jié)構(gòu)與含硒的拉帕酮為基礎(chǔ)的1,2,3-三唑類化合物進(jìn)行比較，我們用設(shè)定的2小時(shí)暴露研究其潛在的NQO1依賴性細(xì)胞毒性，有或沒有NQO1抑制劑二糖醇。與相關(guān)正常組織相比，這種暴露利用了大多數(shù)實(shí)體癌中NQO1水平的升高。在含硒醌類化合物中，我們選擇了化合物21和22，以通過NQO1依賴機(jī)制評(píng)估其特性。
NQO1依賴性評(píng)估。在所測(cè)試的藥物濃度范圍內(nèi)，該化合物對(duì)人肺腺癌A549（肺泡基底上皮細(xì)胞系）有活性。這些細(xì)胞表達(dá)高水平的NQO1（3000+300個(gè)酶單位）。由于添加了雙香豆素（DIC，一種NQO1抑制劑），許多受試化合物的細(xì)胞死亡是NQO1特異性的。根據(jù)存活曲線（圖2），先前報(bào)道的芳胺取代的nor-β-lapachone預(yù)測(cè)了IC50如下，化合物：50=2.6μM，51=1.8μM，52=2.4μM和53=1.3μM。化合物53在狹窄的治療窗口內(nèi)顯示出最顯著的殺傷力，從0.8μM的93%存活率上升到1.6μM的11%?？偟膩碚f，化合物50-53是NQO1特異性藥物，其IC50值與β-拉帕酮相似或更低?；衔?strong>21和22，含硒醌，其IC50值分別為0.64和1.2μM，是該系列中最活躍的，并且具有NQO1依賴性（表3）。他們展示了巨大的治療窗口，使用DIC治療作為對(duì)NQO1細(xì)胞反應(yīng)的替代物，如對(duì)幾乎所有人類正常組織的治療。這些反應(yīng)是NQO1依賴性的無效的氧化還原循環(huán)，這些藥物產(chǎn)生大量的活性氧，特別是H2O2，最終導(dǎo)致PARP1過度活化和程序性壞死。
磷脂酰絲氨酸的外化被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過程中的一個(gè)重要標(biāo)志。經(jīng)處理后，所選化合物21和22誘導(dǎo)細(xì)胞表面表達(dá)磷脂酰絲氨酸的PC3細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖3）。另一方面，在21和22暴露前用NAC預(yù)處理的培養(yǎng)物或與雙香豆素聯(lián)合處理的培養(yǎng)物中未觀察到磷脂酰絲氨酸外化（圖3）。我們的數(shù)據(jù)表明，測(cè)試化合物的細(xì)胞毒性機(jī)制可能涉及醌還原酶NQO1的藥物生物還原，以及強(qiáng)調(diào)ROS對(duì)細(xì)胞毒性的貢獻(xiàn)，這表明受試化合物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與ROS產(chǎn)生相關(guān)。最后，證實(shí)了這些研究，我們觀察到化合物21短時(shí)間暴露（1h）導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。另一方面，在用NAC預(yù)暴露的培養(yǎng)物中，化合物21不能產(chǎn)生ROS，這可以通過NAC行使的抗氧化保護(hù)來解釋。
3、結(jié)論
通過將兩個(gè)氧化還原中心、一個(gè)喹諾酮類部分和硒原子連接起來的策略，我們制備并評(píng)價(jià)了新的和多種含硒的醌基1,2,3-三唑化合物對(duì)正常細(xì)胞系的抗癌活性。我們?cè)u(píng)估了這些藥物的總體殺傷力（表1）以及NQO1的具體作用。總的來說，我們的方法是有效的，并且我們鑒定了IC50值低于0.3 μM的化合物，這些化合物比β-拉帕酮或阿霉素（一種用于治療幾種癌癥的標(biāo)準(zhǔn)臨床藥物）更有效。我們還研究了另外兩種活性化合物21和22的功效，發(fā)現(xiàn)它們被NQO1特異性地生物活性化，比我們之前發(fā)表的nor-β-lapachone具有更高的效價(jià)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)，這些藥物中含有谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）樣活性，所選擇的硒含有nor-β-拉帕酮基1，2，3-三唑，是最有效的，并且在這兩個(gè)靶標(biāo)上起作用。Annexin V細(xì)胞計(jì)數(shù)分析也被用于可視化化合物21和22的活細(xì)胞、早細(xì)胞和晚期凋亡階段的細(xì)胞群。21和22的細(xì)胞毒性機(jī)制與ROS對(duì)細(xì)胞毒性的貢獻(xiàn)本質(zhì)上相關(guān)，提示凋亡與ROS產(chǎn)生有關(guān)。在此基礎(chǔ)上，我們描述了不同種類的醌類、鄰喹啉類和對(duì)苯二酚類化合物的抗腫瘤活性。例如，化合物29（對(duì)苯二酚）在所評(píng)估的癌細(xì)胞系中具有0.62-2.42μM范圍內(nèi)的IC50。以化合物10、21、22和26為例，鄰醌的IC50在0.07-2.52μM之間。最后，我們已經(jīng)描述了有效的抗腫瘤萘醌化合物，這些化合物作為治療過度表達(dá)NQO1的癌癥的有希望的分子出現(xiàn)。
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