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miR-483-3P上調(diào)DKK3在黑樹莓花色苷介導的結直腸癌化學預防中的重要作用
發(fā)表于：2021-02-20 作者：admin 來源：本站 點擊量：27227
原文：Guo J, Yang Z, Zhou H, et al. Upregulation of DKK3 by miR‐483‐3p plays an important role in the chemoprevention of colorectal cancer mediated by black raspberry anthocyanins. Molecular Carcinogenesis. 2019;1–11. https://doi.org/10.1002/mc.23138
翻譯：
據(jù)報道，黑樹莓(BRB)花色苷可作為一種潛在的結直腸癌(CRC)化學預防藥物。然而，BRB花色苷抑制大腸癌細胞癌變的潛在機制尚未闡明。靶向重要抑癌基因的microRNAs(MiRNAs)的異常表達通常與大腸癌的發(fā)生有關。在本研究中，我們探討了BRB花色苷在偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的小鼠大腸癌模型和人大腸癌細胞系中是否影響某些miRNAs的表達。采用miRNA微陣列分析方法，研究飼喂不含或不含BRB花青素的飼料誘導的AOM/DSS小鼠miRNA表達的差異。一種特殊的miRNA，miR-483-3p的表達在AOM/DSS誘導的小鼠中被發(fā)現(xiàn)在飼料中添加BRB花青素后顯著降低。隨后的實時定量聚合酶鏈反應和Western blot分析表明，miR-483-3p表達降低的同時，生物信息學分析預測的miR-483-3p的潛在靶點Dickkopf3(DKK3)的表達增加。當miR-483-3p特異性抑制劑下調(diào)miR-483-3p的表達水平時，DKK3的蛋白和信使RNA水平明顯上調(diào)，提示DKK3可能是miR-483-3p的靶基因。此外，包括Wnt/β-catenin在內(nèi)的DKK3信號通路下游因子也在MIR483-3p介導的BRB花色苷抗癌作用中發(fā)揮作用。因此，miR-483-3p可能是BRB花色苷介導的預防大腸癌的潛在靶點。
關鍵詞：
BRB花色苷、結直腸癌、DKK3、miR-483-3p、Wnt/β-catenin通路
1、簡介
MicroRNAs(MiRNAs)是一種小分子單鏈RNA，普遍存在于動植物中。它通過與靶基因mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)結合，抑制翻譯或直接降解信使RNA(MRNA)，直接影響細胞生長、器官形成、能量代謝、細胞增殖、凋亡和防御系統(tǒng)。miRNAs還參與癌癥的發(fā)展，既可以是癌基因，也可以是抑癌基因。例如，miR-21-5p和miR-142-5p既可以作為致癌基因也可以作為抑癌基因，而miR-22、miR-490-3p和miR-93都可以作為腫瘤抑制基因。此外，miRNAs還可以作為檢測癌癥的有用標記物。例如，血液中的miR-193a-3p、miR-23a和miR-338-5p可用于大腸癌(CRC)的早期檢測。miR-483-3p通過抑制DPC4/Smad4的表達發(fā)揮促癌作用，從而促進胰腺癌的細胞增殖和克隆性。隨著越來越多的miRNAs被發(fā)現(xiàn)在結直腸癌中異常表達，miRNA的應用將成為結直腸癌診斷、靶向治療和預后研究的熱點。大腸癌是一種常見的癌癥，是世界上第四大常見死亡原因。大腸癌的發(fā)生發(fā)展涉及多個基因和信號通路的改變。大腸癌的發(fā)生發(fā)展伴隨著Wnt/β-catenin信號通路的異常激活。Dickkopf蛋白家族由DKK1、DKK2、DKK3和DKK4組成，是Wnt/β-catenin信號通路的細胞外抑制因子，它通過與LRP5/LRP5受體相互作用來影響Wnt信號通路的非經(jīng)典激活。
長期食用黑樹莓(BRB)可以降低患癌癥、心臟病、關節(jié)炎和呼吸系統(tǒng)疾病的風險。食用BRB會產(chǎn)生更多的次生代謝物，從而改善健康。BRB花色苷是BRB在體內(nèi)產(chǎn)生的主要代謝物之一，也是膳食中花色苷的主要來源。BRB最顯著的有益作用是其潛在的癌癥化學預防作用，已有多項研究對此進行了研究。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，BRB花色苷可以調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系，進一步使分泌的卷曲相關蛋白5的啟動子去甲基化，最終延緩偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉(AOM/DSS)處理小鼠的結直腸癌的發(fā)展?；ㄉ账坪跏桥R床試驗中使用的冷凍干燥BRB粉末中的關鍵抗癌成分。
我們最近的研究發(fā)現(xiàn)miR-24-1-5p可以下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路，有助于其在預防大腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，從而參與BRB花色苷介導的結直腸癌的化學預防過程中的miRNAs的作用。在本研究中，miR-24-1-5p可下調(diào)Wnt/miRNAs-catenin信號通路的表達，從而起到預防大腸癌發(fā)生的作用。在這項研究中，我們研究了另一種miRNA miR-483-3p的作用，以確定它可能通過口服BRB花色苷抑制AOM/DSS誘導的CRC小鼠模型中CRC的發(fā)展的機制。在用BRB花色苷處理人大腸癌細胞后，還檢測了miR-483-3p的作用。
2、材料和方法
2.1收購BRB花青素
BRBs含有各種化學物質(zhì)，如酚酸和花色苷。BRB花色苷的主要成分為花青素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-蘆丁苷、花青素-3-O-木糖基-蘆丁苷等。本研究采用JF Natural公司(天津建峰天然產(chǎn)品研發(fā)有限公司)提取BRB花色苷。簡單地說，冷凍干燥的BRB粉末用乙醇-水(75：25，體積/體積)在35°C下攪拌3h，直至粉末變白，得到粗提物。萃取物經(jīng)濾紙過濾后裝入聚酰胺色譜柱分離成不同組分。進一步用制備高效液相色譜分離純化得到純化的BRB花色苷。BRB花色苷保存在−20°C的環(huán)境中。
2.2 CRC小鼠模型的建立
將20只C57雄性小鼠(體重18~20g，遼寧長生實驗動物生物技術有限公司)隨機分為2組，每組10只。其中一組被指定為模型組，按正常飲食喂養(yǎng)。另一組為試驗組，飼喂含7.0molmol/g BRB花色苷的普通飼料。飼料中BRB花色苷的濃度是在我們前期研究的基礎上選擇的。兩組小鼠在實驗的第一天注射AOM(10 mg/kg)，然后在實驗的第8天再注射。同時，第1周每天用2%DSS水治療，隨后2周每天用正常水治療，整個過程重復3次。因此，整個實驗持續(xù)了9周，在治療期結束時，處死并取出它們的結腸，并將其冷凍在液氮中。部分組織用于miRNA陣列分析，其余組織保存在−80°C進行進一步分析。
在整個實驗過程中，小鼠被關在籠子里(每籠3~5只)，保持在22°C±1°C和50%±5%的濕度下，光照-黑暗周期為12小時(上午7：00-晚上7：00)。所有的程序都是根據(jù)國家衛(wèi)生研究院關于動物護理和使用的規(guī)定進行的，并得到了遼寧中醫(yī)藥大學倫理委員會的批準。
2.3 miRNA微陣列
提取的結腸組織進行微陣列分析。使用安捷倫(安捷倫，Palo Alto，CA)對原始數(shù)據(jù)中不同基因的表達進行微陣列(8*60K，設計ID：070155)和基本分析。
2.4 細胞培養(yǎng)
人HCT116和HT29大腸癌細胞系購自中國科學院(上海)細胞庫。LOVO細胞和SW480細胞購自上海明景生物研究所。細胞培養(yǎng)在37°C的5%CO2加濕環(huán)境中。
2.5 miRNAs瞬時轉染
miR-483-3P抑制劑和miR-NC購自GenePharma(中國上海)。LoVo和SW480細胞的瞬時轉染按照制造商方案進行。
2.6 RNA提取及qRT-PCR
用TRIzol試劑(上海桑貢生物科技有限公司)從細胞和組織中提取總RNA。編碼miRNA的第一鏈互補DNA(cDNA)用miRNA cDNA合成試劑盒(ComWin Biotech Co，Ltd，China，China)反轉錄獲得。用ComWin Biotech Co，Ltd的miRNA實時檢測試劑盒進行miR-483-3p的實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)。用PrimeScript RT試劑盒檢測DKK3的mRNA水平，試劑盒采用gDNA擦除器和TB Green PreMix Ex Taq II(北京塔卡拉生物醫(yī)學技術有限公司)。用特異引物(表S1)進行qRT-PCR，并使用應用生物系統(tǒng)7500實時PCR系統(tǒng)進行擴增。
2.7 蛋白質(zhì)提取及Western blot分析
冰凍條件下先用放射免疫沉淀分析緩沖液(北京鼎國長生生物科技有限公司)裂解細胞，隨后細胞裂解液離心。然后，使用針對DKK3、β-肌動蛋白、Bcl-2、BAX(Sangon Biotech Shanghai Co，Ltd)、Cyclin D1、c-Myc、CDK4或E-cadherin(細胞信號技術，MA)的抗體，對所獲得的含有可溶性蛋白的上清液進行Western blot分析。使用Image J軟件對條帶強度進行量化。
2.8 傷口愈合試驗
這些細胞在一個六孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，直到它們達到60%的融合。然后用無菌微吸管刮除細胞層形成傷口，并用新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)液。然后，將miRNAs轉染細胞24小時，拍攝細胞層的顯微照片。光鏡下計算細胞遷移程度。
2.9 3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化法
BRB花色苷的原液用培養(yǎng)基稀釋到合適的濃度，然后加入96孔板，其中包含生長到60%融合的細胞。在細胞中分別加入BRB花色苷到最終濃度為25和50μg/mL。對照組僅向細胞中加入等量培養(yǎng)基，而不加入BRB花色苷。用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(Sangon Biotech Shanghai Co，Ltd)試劑(Sangon Biotech Shanghai Co，Ltd)測定細胞增殖。
2.10 miRNA靶基因的鑒定及其與大腸癌患者生存率的關系
利用在線數(shù)據(jù)庫microRNA.org預測miR-483-3p的靶基因(http://www.microrna.org/microrna/home.do)。從人類蛋白質(zhì)圖譜網(wǎng)站(www.proteinatlas.org)獲得結直腸癌患者結腸組織中DKK3的表達譜。并用miRbase(http://www.mirbase.org/)對不同物種的miR-483-3p序列進行比對。使用在線數(shù)據(jù)庫PROGeneV2(http://genomics.jefferson.edu/proggene/)驗證DKK3的表達與大腸癌患者生存率的關系。
2.11 統(tǒng)計方式
采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。不同組間比較采用t檢驗和方差分析。在P<0.05和P<0.01水平上有統(tǒng)計學意義。
3 結果
3.1 miR-483-3p可能在BRB花色苷介導的大腸癌預防中發(fā)揮作用
應用miRNA微陣列分析方法獲得了AOM/DSS誘導的小鼠結腸中miRNA的表達特征，這些小鼠分別飼喂了不添加(對照)或添加BRB花色苷的飼料。在接受BRB花色苷組中，幾個miRNAs的表達模式與對照組不同。接受BRB花色苷的小鼠顯示其結腸中miR-483-3p的表達減少(圖1A，B)。此外，qRT-PCR顯示，經(jīng)BRB花色苷處理的CRC細胞與未處理的CRC細胞相比，miR-483-3p的表達也降低(圖1C和1F)。提示miR-483-3p可能在BRB花色苷介導的化學預防大腸癌中起作用。
3.2 DKK3是miR-483-3p的預測靶基因，DKK3的表達水平與大腸癌患者有關
為了更好地了解miR-483-3p在大腸癌中的意義，我們對不同物種的miR-483序列進行了比對。結果顯示，高等哺乳動物的miR-483序列具有高度的保守性(圖2A)。此外，生物信息學分析預測DKK3可能是miR-483-3p的潛在靶基因(圖2B)。然后利用在線數(shù)據(jù)庫PROGeneV2分析DKK3與大腸癌患者生存時間的關系。DKK3 mRNA水平與患者總生存率呈正相關(圖2C)。此外，從人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站獲得的DKK3蛋白免疫組織化學染色數(shù)據(jù)顯示，這些大腸癌患者中DKK3的表達下調(diào)(圖2D，E)。綜上所述，DKK3可能是miR-483-3p在大腸癌患者中低表達的靶基因。BRB花色苷可能通過下調(diào)miR-483-3p的表達來調(diào)節(jié)DKK3的表達。
為了進一步檢測miR-483-3p對DKK3的作用，用miR-483-3p抑制劑轉染LoVo細胞和SW480細胞，該抑制劑由與miR-483-3p序列互補的寡核苷酸組成。轉染miR-483-3p抑制劑后，細胞中DKK3的蛋白和mRNA水平均顯著升高(圖3A-C和3F)。此外，經(jīng)BRB花色苷處理的LoVo和SW480細胞顯示DKK3蛋白水平升高(圖3g，H)，進一步支持DKK3可能是miR-483-3p的靶基因的推測，BRB花色苷可能通過下調(diào)miR-483-3p表達來下調(diào)DKK3的表達。
3.3 miR-483-3p調(diào)控腫瘤發(fā)生相關基因
DKK3屬于DKKs家族，一般認為它是信號分子Wnt的拮抗劑。DKK3可以通過與卷曲的受體結合來阻斷Wnt信號通路，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活。我們的數(shù)據(jù)表明DKK3可能是miR483-3p的一個很有前途的靶基因，因此我們推測miR-483-3p可能影響結直腸癌Wnt/β-catenin信號通路，從而干擾結直腸癌的發(fā)展。沉默miR-483-3p可降低Wnt/β-catenin途徑中的關鍵蛋白β-catenin的水平(圖4A，B)。此外，轉染miR-483-3p抑制劑的LoVo和SW480細胞c-Myc、cyclinD1、Bcl2水平表達降低，bax、E-cadherin水平表達增強，進一步提示miR-483-3p抑制劑可以抑制這兩種細胞系Wnt/β-catenin蛋白通路的激活(圖4A，B)。綜上所述，DKK3-Wnt/β-catenin可能是miR-483-3p的直接靶點，提示miR-483-3p可能在體外調(diào)控腫瘤發(fā)生相關基因。
3.4 miR-483-3P對大腸癌細胞增殖和遷移的影響
Cyclin D1、CDK4、Bcl-2、Bax和E-cadherin是影響細胞遷移和增殖的基因。因此，為了進一步評價miR-483-3p的功能，將miR-483-3p抑制劑轉染SW480和LoVo細胞，然后進行傷口愈合實驗。轉染miR-483-3p抑制劑后，LoVo和SW480細胞的遷移能力均下降(圖4C，D)。此外，與未轉染miR-483-3p抑制劑的細胞相比，這些細胞的活力明顯降低(圖5A，B)。在不同的實驗中，用miR-483-3p抑制劑轉染LoVo細胞和SW480細胞，進行集落形成實驗。與未轉染抑制劑的細胞相比，這些細胞的集落數(shù)量減少(圖5C，D)。綜上所述，結果提示miR-483-3p的下調(diào)可能會降低大腸癌細胞的增殖和遷移能力。
4 討論
在本研究中發(fā)現(xiàn)，在AOM/DSS誘導的小鼠中，補充BRB花色苷膳食的小鼠miR-483-3p的表達顯著降低。miR-483-3p可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路，有效干擾癌細胞的遷移，從而發(fā)揮對大腸癌的治療作用。
全世界都有證據(jù)表明，結直腸癌與高發(fā)病率和高死亡率有關。針對結直腸癌的治療方法和結直腸癌患者的預后的進展仍然是不合需要的。因此，建立結直腸癌發(fā)病的潛在機制，尋找更有效的防治結直腸癌的方法具有重要意義。miRNAs是以相關mRNA的3‘-UTR為靶點、抑制其翻譯的短鏈非編碼RNA。miRNAs調(diào)控不同的生物學過程，包括細胞凋亡、細胞血管生成、細胞遷移和細胞增殖，通常通過靶向不同的mRNAs來表現(xiàn)為腫瘤抑制基因或癌基因。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在CRC小鼠模型中給予BRB花色苷后，作為癌基因的miR-483-3p表達減少。肺癌、胰腺癌患者血漿中存在miR-483-3p的高表達；大腸癌中miR-483-3p也有高表達，但其具體作用機制尚未詳細研究。大腸癌中檢測到DKK3表達下調(diào)，生物信息學分析顯示DKK3的表達可能影響患者的生存時間(圖2C)。經(jīng)BRB花色苷處理后，LoVo和SW480細胞的DKK3水平上調(diào)(圖3g，H)。因此，BRB花色苷可以影響miR-483-3p和DKK3的表達。
DKK3已被證明可以抑制骨肉瘤、結腸癌、胃癌、膠質(zhì)瘤、前列腺、宮頸癌、肝癌和肺癌中癌細胞的增殖。此外，DKK3也是Wnt信號通路的抑制劑，它參與了核β-catenin的降解，阻止了蛋白質(zhì)向胞漿的轉移。Wnt信號通路高度保守，在胚胎發(fā)育、動態(tài)平衡和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。Wnt/β-catenin信號通路參與細胞的侵襲、遷移、增殖和分化過程，在大腸癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。DKK3參與miR-483-3p介導的抑制CRC細胞增殖和遷移的作用，進一步證明了在用miR-483-3p特異性抑制劑處理時CRC細胞遷移和增殖能力降低(圖4C、D和5A-D)。
以前，我們已經(jīng)證明miR-24-1-5p的上調(diào)參與了BRB花色苷對CRC的化學預防，提示調(diào)節(jié)miRNA的表達可能是BRB花色苷對CRC發(fā)揮化學預防作用的一個可能機制。這也首次證明了miRNA可以參與BRB花色苷介導的抑制CRC的作用。本研究的發(fā)現(xiàn)進一步增強了miRNA在大腸癌發(fā)病機制中的重要性。它鑒定了另一個miRNA，miR-483-3p，證明了miR-483-3p在大腸癌發(fā)病機制中的潛在功能，并定位了其靶基因DKK3，作為揭示BRB花色苷抗癌活性介導的機制的一部分。因此，這項研究支持了我們的假設，即miRNAs參與了BRB花色苷介導的結直腸癌的化學預防。圖6描繪了miR-483-3P可能通過BRB花色苷的化學預防作用來對抗結直腸癌的可能途徑。我們通過miRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)了受BRB花色苷調(diào)控的miRNAs。由于該方法的局限性以及小鼠組織樣品與人組織樣品的差異，我們認為miR-24-1-5p或miR-483-3p不是唯一受BRB花色苷調(diào)控的miRNA。然而，BRB花色苷對miRNA表達的調(diào)控仍不清楚。最近的報道描述了miRNA表達的調(diào)控是通過表觀遺傳機制進行的。在大腸癌和其他各種癌癥中，miRNAs的表達受DNA甲基化的調(diào)節(jié)。例如，在HT-29 CRC細胞中miR-342的表達被高甲基化抑制。大腸癌中表觀遺傳沉默的miR-149與鄰近CpG區(qū)域的高甲基化有關。許多參與DNA甲基化和組蛋白乙?；{(diào)控的酶，如DNA甲基轉移酶(DNMTs)、組蛋白脫乙酰酶或多梳抑制復合體基因等都參與了染色質(zhì)結構的調(diào)控。有趣的是，許多研究表明，天然存在的生物活性化合物可以抑制這些酶的活性。例如，綠茶兒茶素中的活性多酚表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯可以抑制DNMTs的活性，從而抑制DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達。此外，I期先導研究顯示，黑樹莓可以使人體內(nèi)一些結直腸癌的抑癌基因去甲基化，而BRB花色苷也可以通過抑制結腸癌細胞中的DNMT1和DNMT3b使抑癌基因去甲基化。此外，在癌前病變組織中，黑樹莓保護性地調(diào)節(jié)Wnt信號通路中基因的甲基化。因此，我們推測BRB花色苷對miRNA表達(以及可能的活性)的影響可能是通過BRB花色苷對表觀遺傳機制的影響來介導的。然而，BRB花色苷是否可以通過調(diào)節(jié)參與表觀遺傳過程的酶來影響miRNAs的表達，這還是一個有待進一步研究的課題。
綜上所述，本研究結果表明，miR-483-3p可能通過其靶基因之一Dkk3調(diào)控Wnt/β-catenin途徑在結直腸癌中發(fā)揮重要作用，并且miR-483-3p的表達可被BRB花色苷下調(diào)，進一步證明了BRB花色苷作為結直腸癌化學預防劑的潛力。此外，miR-483-3p的沉默可顯著抑制大腸癌細胞的遷移和增殖，提示特異性靶向miR-483-3p的表達也可能成為未來治療大腸癌的一種途徑。
圖1 BRB花色苷對AOM/DSS誘導小鼠及不同大腸癌細胞株miR-483-3p表達的影響。a、miRNAs在小鼠結腸中的差異表達。綠色-下調(diào)；紅色-上調(diào)。B，下調(diào)的miRNAs用藍色表示。定量RT-PCR檢測AOM/DSS誘導的小鼠接受和不接受BRB花色苷后結腸組織miR-483-3p的水平。d、BRB花色苷處理前后HCT-116細胞miR-483-3p的相對表達。經(jīng)BRB花色苷處理的LoVo細胞miR-483-3p的相對表達量。f，在加或不加BRB花色苷的SW480細胞中，miR-483-3p的相對表達。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。*和**分別在P<0.05和P<0.01水平上與對照組(不補充BRB)有顯著差異。AOM，偶氮甲烷；BRB，黑莓；CRC，結直腸癌；DSS，葡聚糖硫酸鈉；miRNAs，microRNAs；RT-PCR，實時聚合酶鏈反應[彩色圖表可在wileyonlinelibrary.com查看]
圖2 利用生物信息學分析預測miR-483-3p靶基因。不同物種miR-483-3p序列的比對。B，靶向DKK3mRNA 3‘-UTR位點的miR-483-3p模型。根據(jù)在線數(shù)據(jù)庫PROGeneV2的數(shù)據(jù)分析DKK3與大腸癌患者生存時間的關系。免疫組織化學染色顯示大腸癌組織中D、DKK3水平。數(shù)據(jù)來源于人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫。圖2D中DKK3蛋白表達的免疫組化染色數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。3‘-UTR，3’-非翻譯區(qū)；CRC，結直腸癌；miR，microRNA[彩色圖可在wileyonlinelibrary.com查看].
圖3 miR-483-3p下調(diào)DKK3的表達。將miR-483-3p抑制劑轉染LOVO和SW480細胞，qRT-PCR檢測miR-483-3p(A和B)和DKK3(C和D)的表達水平，Western blot檢測DKK3(E和F)的表達水平。Western blot檢測BRB花色苷對LoVo(G)和SW480(H)細胞DKK3表達的影響。qRT-PCR數(shù)據(jù)為三次測定的平均值±SEMs。*和**分別與對照組(未加miR-483-3p抑制劑)在P<0.05和P<0.01水平上有顯著性差異。對于Western blot分析，只顯示有代表性的斑點。BRB，黑樹莓；miR，microRNA；qRT-PCR，實時定量聚合酶鏈反應.
圖4 miR-483-3p對腫瘤發(fā)生相關基因和細胞遷移的影響。Western blot分析轉染β-483-3p抑制劑后LoVo(A)和SW480(B)細胞中c-myc、cyclinD1、CDK4、Bcl2、bax、E-cadherin和β-actin的表達水平。傷口愈合實驗顯示轉染miR-483-3p抑制劑后的LoVo(C)和SW480(D)細胞遷移能力降低。圖像旁邊的圖定量比較了在沒有miR-483-p抑制劑和存在miR-483-p抑制劑的情況下相應細胞的遷移距離。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。*和**分別在P<0.05和P<0.01水平上與對照組(不補充BRB)有顯著差異。BRB，黑色樹莓；miR，microRNA。
圖5 miR-483-3p對大腸癌細胞增殖和集落形成的影響。將miR-483-3p抑制劑轉染人大腸癌細胞、LoVo細胞和SW480細胞，A、B用MTT法檢測細胞存活率，C、D用集落形成實驗檢測細胞增殖。這些曲線圖顯示了C和D中數(shù)據(jù)的定量比較。數(shù)據(jù)以均值±SEMS表示。*和**分別在P<0.05和P<0.01水平上與對照組(不補充BRB)有顯著差異。BRB，黑色覆盆子；CRC，結直腸癌；MTT，3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴[彩色圖形可在wileyonlinelibrary.com查看]
圖6 這個模型描述了miR-483-3p如何通過BRB花青素的化學預防作用來對抗結直腸癌，在CRC細胞中，miR-483-3p可以通過下調(diào)DKK3的表達來促進細胞的增殖和遷移。BRB花色苷可抑制miR-483-3p，從而抑制大腸癌細胞的增殖和遷移。3‘-UTR，3’-非翻譯區(qū)；BRB，黑莓；CRC，結直腸癌；miR，microRNA[彩色圖形可在wileyonlinelibrary.com查看]
翻譯：
miR-483-3P上調(diào)DKK3在黑樹莓花色苷介導的結直腸癌化學預防中的重要作用
摘要：據(jù)報道，黑樹莓(BRB)花色苷可作為一種潛在的結直腸癌(CRC)化學預防藥物。然而，BRB花色苷抑制大腸癌細胞癌變的潛在機制尚未闡明。靶向重要抑癌基因的microRNAs(MiRNAs)的異常表達通常與大腸癌的發(fā)生有關。在本研究中，我們探討了BRB花色苷在偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的小鼠大腸癌模型和人大腸癌細胞系中是否影響某些miRNAs的表達。采用miRNA微陣列分析方法，研究飼喂不含或不含BRB花青素的飼料誘導的AOM/DSS小鼠miRNA表達的差異。一種特殊的miRNA，miR-483-3p的表達在AOM/DSS誘導的小鼠中被發(fā)現(xiàn)在飼料中添加BRB花青素后顯著降低。隨后的實時定量聚合酶鏈反應和Western blot分析表明，miR-483-3p表達降低的同時，生物信息學分析預測的miR-483-3p的潛在靶點Dickkopf3(DKK3)的表達增加。當miR-483-3p特異性抑制劑下調(diào)miR-483-3p的表達水平時，DKK3的蛋白和信使RNA水平明顯上調(diào)，提示DKK3可能是miR-483-3p的靶基因。此外，包括Wnt/β-catenin在內(nèi)的DKK3信號通路下游因子也在MIR483-3p介導的BRB花色苷抗癌作用中發(fā)揮作用。因此，miR-483-3p可能是BRB花色苷介導的預防大腸癌的潛在靶點。
關鍵詞：
BRB花色苷、結直腸癌、DKK3、miR-483-3p、Wnt/β-catenin通路
1、簡介
MicroRNAs(MiRNAs)是一種小分子單鏈RNA，普遍存在于動植物中。它通過與靶基因mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)結合，抑制翻譯或直接降解信使RNA(MRNA)，直接影響細胞生長、器官形成、能量代謝、細胞增殖、凋亡和防御系統(tǒng)。miRNAs還參與癌癥的發(fā)展，既可以是癌基因，也可以是抑癌基因。例如，miR-21-5p和miR-142-5p既可以作為致癌基因也可以作為抑癌基因，而miR-22、miR-490-3p和miR-93都可以作為腫瘤抑制基因。此外，miRNAs還可以作為檢測癌癥的有用標記物。例如，血液中的miR-193a-3p、miR-23a和miR-338-5p可用于大腸癌(CRC)的早期檢測。miR-483-3p通過抑制DPC4/Smad4的表達發(fā)揮促癌作用，從而促進胰腺癌的細胞增殖和克隆性。隨著越來越多的miRNAs被發(fā)現(xiàn)在結直腸癌中異常表達，miRNA的應用將成為結直腸癌診斷、靶向治療和預后研究的熱點。大腸癌是一種常見的癌癥，是世界上第四大常見死亡原因。大腸癌的發(fā)生發(fā)展涉及多個基因和信號通路的改變。大腸癌的發(fā)生發(fā)展伴隨著Wnt/β-catenin信號通路的異常激活。Dickkopf蛋白家族由DKK1、DKK2、DKK3和DKK4組成，是Wnt/β-catenin信號通路的細胞外抑制因子，它通過與LRP5/LRP5受體相互作用來影響Wnt信號通路的非經(jīng)典激活。
長期食用黑樹莓(BRB)可以降低患癌癥、心臟病、關節(jié)炎和呼吸系統(tǒng)疾病的風險。食用BRB會產(chǎn)生更多的次生代謝物，從而改善健康。BRB花色苷是BRB在體內(nèi)產(chǎn)生的主要代謝物之一，也是膳食中花色苷的主要來源。BRB最顯著的有益作用是其潛在的癌癥化學預防作用，已有多項研究對此進行了研究。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，BRB花色苷可以調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系，進一步使分泌的卷曲相關蛋白5的啟動子去甲基化，最終延緩偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉(AOM/DSS)處理小鼠的結直腸癌的發(fā)展?；ㄉ账坪跏桥R床試驗中使用的冷凍干燥BRB粉末中的關鍵抗癌成分。
我們最近的研究發(fā)現(xiàn)miR-24-1-5p可以下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路，有助于其在預防大腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，從而參與BRB花色苷介導的結直腸癌的化學預防過程中的miRNAs的作用。在本研究中，miR-24-1-5p可下調(diào)Wnt/miRNAs-catenin信號通路的表達，從而起到預防大腸癌發(fā)生的作用。在這項研究中，我們研究了另一種miRNA miR-483-3p的作用，以確定它可能通過口服BRB花色苷抑制AOM/DSS誘導的CRC小鼠模型中CRC的發(fā)展的機制。在用BRB花色苷處理人大腸癌細胞后，還檢測了miR-483-3p的作用。
2、材料和方法
2.1收購BRB花青素
BRBs含有各種化學物質(zhì)，如酚酸和花色苷。BRB花色苷的主要成分為花青素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-蘆丁苷、花青素-3-O-木糖基-蘆丁苷等。本研究采用JF Natural公司(天津建峰天然產(chǎn)品研發(fā)有限公司)提取BRB花色苷。簡單地說，冷凍干燥的BRB粉末用乙醇-水(75：25，體積/體積)在35°C下攪拌3h，直至粉末變白，得到粗提物。萃取物經(jīng)濾紙過濾后裝入聚酰胺色譜柱分離成不同組分。進一步用制備高效液相色譜分離純化得到純化的BRB花色苷。BRB花色苷保存在−20°C的環(huán)境中。
2.2 CRC小鼠模型的建立
將20只C57雄性小鼠(體重18~20g，遼寧長生實驗動物生物技術有限公司)隨機分為2組，每組10只。其中一組被指定為模型組，按正常飲食喂養(yǎng)。另一組為試驗組，飼喂含7.0molmol/g BRB花色苷的普通飼料。飼料中BRB花色苷的濃度是在我們前期研究的基礎上選擇的。兩組小鼠在實驗的第一天注射AOM(10 mg/kg)，然后在實驗的第8天再注射。同時，第1周每天用2%DSS水治療，隨后2周每天用正常水治療，整個過程重復3次。因此，整個實驗持續(xù)了9周，在治療期結束時，處死并取出它們的結腸，并將其冷凍在液氮中。部分組織用于miRNA陣列分析，其余組織保存在−80°C進行進一步分析。
在整個實驗過程中，小鼠被關在籠子里(每籠3~5只)，保持在22°C±1°C和50%±5%的濕度下，光照-黑暗周期為12小時(上午7：00-晚上7：00)。所有的程序都是根據(jù)國家衛(wèi)生研究院關于動物護理和使用的規(guī)定進行的，并得到了遼寧中醫(yī)藥大學倫理委員會的批準。
2.3 miRNA微陣列
提取的結腸組織進行微陣列分析。使用安捷倫(安捷倫，Palo Alto，CA)對原始數(shù)據(jù)中不同基因的表達進行微陣列(8*60K，設計ID：070155)和基本分析。
2.4 細胞培養(yǎng)
人HCT116和HT29大腸癌細胞系購自中國科學院(上海)細胞庫。LOVO細胞和SW480細胞購自上海明景生物研究所。細胞培養(yǎng)在37°C的5%CO2加濕環(huán)境中。
2.5 miRNAs瞬時轉染
miR-483-3P抑制劑和miR-NC購自GenePharma(中國上海)。LoVo和SW480細胞的瞬時轉染按照制造商方案進行。
2.6 RNA提取及qRT-PCR
用TRIzol試劑(上海桑貢生物科技有限公司)從細胞和組織中提取總RNA。編碼miRNA的第一鏈互補DNA(cDNA)用miRNA cDNA合成試劑盒(ComWin Biotech Co，Ltd，China，China)反轉錄獲得。用ComWin Biotech Co，Ltd的miRNA實時檢測試劑盒進行miR-483-3p的實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)。用PrimeScript RT試劑盒檢測DKK3的mRNA水平，試劑盒采用gDNA擦除器和TB Green PreMix Ex Taq II(北京塔卡拉生物醫(yī)學技術有限公司)。用特異引物(表S1)進行qRT-PCR，并使用應用生物系統(tǒng)7500實時PCR系統(tǒng)進行擴增。
2.7 蛋白質(zhì)提取及Western blot分析
冰凍條件下先用放射免疫沉淀分析緩沖液(北京鼎國長生生物科技有限公司)裂解細胞，隨后細胞裂解液離心。然后，使用針對DKK3、β-肌動蛋白、Bcl-2、BAX(Sangon Biotech Shanghai Co，Ltd)、Cyclin D1、c-Myc、CDK4或E-cadherin(細胞信號技術，MA)的抗體，對所獲得的含有可溶性蛋白的上清液進行Western blot分析。使用Image J軟件對條帶強度進行量化。
2.8 傷口愈合試驗
這些細胞在一個六孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，直到它們達到60%的融合。然后用無菌微吸管刮除細胞層形成傷口，并用新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)液。然后，將miRNAs轉染細胞24小時，拍攝細胞層的顯微照片。光鏡下計算細胞遷移程度。
2.9 3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化法
BRB花色苷的原液用培養(yǎng)基稀釋到合適的濃度，然后加入96孔板，其中包含生長到60%融合的細胞。在細胞中分別加入BRB花色苷到最終濃度為25和50μg/mL。對照組僅向細胞中加入等量培養(yǎng)基，而不加入BRB花色苷。用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(Sangon Biotech Shanghai Co，Ltd)試劑(Sangon Biotech Shanghai Co，Ltd)測定細胞增殖。
2.10 miRNA靶基因的鑒定及其與大腸癌患者生存率的關系
利用在線數(shù)據(jù)庫microRNA.org預測miR-483-3p的靶基因(http://www.microrna.org/microrna/home.do)。從人類蛋白質(zhì)圖譜網(wǎng)站(www.proteinatlas.org)獲得結直腸癌患者結腸組織中DKK3的表達譜。并用miRbase(http://www.mirbase.org/)對不同物種的miR-483-3p序列進行比對。使用在線數(shù)據(jù)庫PROGeneV2(http://genomics.jefferson.edu/proggene/)驗證DKK3的表達與大腸癌患者生存率的關系。
2.11 統(tǒng)計方式
采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。不同組間比較采用t檢驗和方差分析。在P<0.05和P<0.01水平上有統(tǒng)計學意義。
3 結果
3.1 miR-483-3p可能在BRB花色苷介導的大腸癌預防中發(fā)揮作用
應用miRNA微陣列分析方法獲得了AOM/DSS誘導的小鼠結腸中miRNA的表達特征，這些小鼠分別飼喂了不添加(對照)或添加BRB花色苷的飼料。在接受BRB花色苷組中，幾個miRNAs的表達模式與對照組不同。接受BRB花色苷的小鼠顯示其結腸中miR-483-3p的表達減少(圖1A，B)。此外，qRT-PCR顯示，經(jīng)BRB花色苷處理的CRC細胞與未處理的CRC細胞相比，miR-483-3p的表達也降低(圖1C和1F)。提示miR-483-3p可能在BRB花色苷介導的化學預防大腸癌中起作用。
3.2 DKK3是miR-483-3p的預測靶基因，DKK3的表達水平與大腸癌患者有關
為了更好地了解miR-483-3p在大腸癌中的意義，我們對不同物種的miR-483序列進行了比對。結果顯示，高等哺乳動物的miR-483序列具有高度的保守性(圖2A)。此外，生物信息學分析預測DKK3可能是miR-483-3p的潛在靶基因(圖2B)。然后利用在線數(shù)據(jù)庫PROGeneV2分析DKK3與大腸癌患者生存時間的關系。DKK3 mRNA水平與患者總生存率呈正相關(圖2C)。此外，從人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站獲得的DKK3蛋白免疫組織化學染色數(shù)據(jù)顯示，這些大腸癌患者中DKK3的表達下調(diào)(圖2D，E)。綜上所述，DKK3可能是miR-483-3p在大腸癌患者中低表達的靶基因。BRB花色苷可能通過下調(diào)miR-483-3p的表達來調(diào)節(jié)DKK3的表達。
為了進一步檢測miR-483-3p對DKK3的作用，用miR-483-3p抑制劑轉染LoVo細胞和SW480細胞，該抑制劑由與miR-483-3p序列互補的寡核苷酸組成。轉染miR-483-3p抑制劑后，細胞中DKK3的蛋白和mRNA水平均顯著升高(圖3A-C和3F)。此外，經(jīng)BRB花色苷處理的LoVo和SW480細胞顯示DKK3蛋白水平升高(圖3g，H)，進一步支持DKK3可能是miR-483-3p的靶基因的推測，BRB花色苷可能通過下調(diào)miR-483-3p表達來下調(diào)DKK3的表達。
3.3 miR-483-3p調(diào)控腫瘤發(fā)生相關基因
DKK3屬于DKKs家族，一般認為它是信號分子Wnt的拮抗劑。DKK3可以通過與卷曲的受體結合來阻斷Wnt信號通路，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活。我們的數(shù)據(jù)表明DKK3可能是miR483-3p的一個很有前途的靶基因，因此我們推測miR-483-3p可能影響結直腸癌Wnt/β-catenin信號通路，從而干擾結直腸癌的發(fā)展。沉默miR-483-3p可降低Wnt/β-catenin途徑中的關鍵蛋白β-catenin的水平(圖4A，B)。此外，轉染miR-483-3p抑制劑的LoVo和SW480細胞c-Myc、cyclinD1、Bcl2水平表達降低，bax、E-cadherin水平表達增強，進一步提示miR-483-3p抑制劑可以抑制這兩種細胞系Wnt/β-catenin蛋白通路的激活(圖4A，B)。綜上所述，DKK3-Wnt/β-catenin可能是miR-483-3p的直接靶點，提示miR-483-3p可能在體外調(diào)控腫瘤發(fā)生相關基因。
3.4 miR-483-3P對大腸癌細胞增殖和遷移的影響
Cyclin D1、CDK4、Bcl-2、Bax和E-cadherin是影響細胞遷移和增殖的基因。因此，為了進一步評價miR-483-3p的功能，將miR-483-3p抑制劑轉染SW480和LoVo細胞，然后進行傷口愈合實驗。轉染miR-483-3p抑制劑后，LoVo和SW480細胞的遷移能力均下降(圖4C，D)。此外，與未轉染miR-483-3p抑制劑的細胞相比，這些細胞的活力明顯降低(圖5A，B)。在不同的實驗中，用miR-483-3p抑制劑轉染LoVo細胞和SW480細胞，進行集落形成實驗。與未轉染抑制劑的細胞相比，這些細胞的集落數(shù)量減少(圖5C，D)。綜上所述，結果提示miR-483-3p的下調(diào)可能會降低大腸癌細胞的增殖和遷移能力。
4 討論
在本研究中發(fā)現(xiàn)，在AOM/DSS誘導的小鼠中，補充BRB花色苷膳食的小鼠miR-483-3p的表達顯著降低。miR-483-3p可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路，有效干擾癌細胞的遷移，從而發(fā)揮對大腸癌的治療作用。
全世界都有證據(jù)表明，結直腸癌與高發(fā)病率和高死亡率有關。針對結直腸癌的治療方法和結直腸癌患者的預后的進展仍然是不合需要的。因此，建立結直腸癌發(fā)病的潛在機制，尋找更有效的防治結直腸癌的方法具有重要意義。miRNAs是以相關mRNA的3‘-UTR為靶點、抑制其翻譯的短鏈非編碼RNA。miRNAs調(diào)控不同的生物學過程，包括細胞凋亡、細胞血管生成、細胞遷移和細胞增殖，通常通過靶向不同的mRNAs來表現(xiàn)為腫瘤抑制基因或癌基因。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在CRC小鼠模型中給予BRB花色苷后，作為癌基因的miR-483-3p表達減少。肺癌、胰腺癌患者血漿中存在miR-483-3p的高表達；大腸癌中miR-483-3p也有高表達，但其具體作用機制尚未詳細研究。大腸癌中檢測到DKK3表達下調(diào)，生物信息學分析顯示DKK3的表達可能影響患者的生存時間(圖2C)。經(jīng)BRB花色苷處理后，LoVo和SW480細胞的DKK3水平上調(diào)(圖3g，H)。因此，BRB花色苷可以影響miR-483-3p和DKK3的表達。
DKK3已被證明可以抑制骨肉瘤、結腸癌、胃癌、膠質(zhì)瘤、前列腺、宮頸癌、肝癌和肺癌中癌細胞的增殖。此外，DKK3也是Wnt信號通路的抑制劑，它參與了核β-catenin的降解，阻止了蛋白質(zhì)向胞漿的轉移。Wnt信號通路高度保守，在胚胎發(fā)育、動態(tài)平衡和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。Wnt/β-catenin信號通路參與細胞的侵襲、遷移、增殖和分化過程，在大腸癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。DKK3參與miR-483-3p介導的抑制CRC細胞增殖和遷移的作用，進一步證明了在用miR-483-3p特異性抑制劑處理時CRC細胞遷移和增殖能力降低(圖4C、D和5A-D)。
以前，我們已經(jīng)證明miR-24-1-5p的上調(diào)參與了BRB花色苷對CRC的化學預防，提示調(diào)節(jié)miRNA的表達可能是BRB花色苷對CRC發(fā)揮化學預防作用的一個可能機制。這也首次證明了miRNA可以參與BRB花色苷介導的抑制CRC的作用。本研究的發(fā)現(xiàn)進一步增強了miRNA在大腸癌發(fā)病機制中的重要性。它鑒定了另一個miRNA，miR-483-3p，證明了miR-483-3p在大腸癌發(fā)病機制中的潛在功能，并定位了其靶基因DKK3，作為揭示BRB花色苷抗癌活性介導的機制的一部分。因此，這項研究支持了我們的假設，即miRNAs參與了BRB花色苷介導的結直腸癌的化學預防。圖6描繪了miR-483-3P可能通過BRB花色苷的化學預防作用來對抗結直腸癌的可能途徑。我們通過miRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)了受BRB花色苷調(diào)控的miRNAs。由于該方法的局限性以及小鼠組織樣品與人組織樣品的差異，我們認為miR-24-1-5p或miR-483-3p不是唯一受BRB花色苷調(diào)控的miRNA。然而，BRB花色苷對miRNA表達的調(diào)控仍不清楚。最近的報道描述了miRNA表達的調(diào)控是通過表觀遺傳機制進行的。在大腸癌和其他各種癌癥中，miRNAs的表達受DNA甲基化的調(diào)節(jié)。例如，在HT-29 CRC細胞中miR-342的表達被高甲基化抑制。大腸癌中表觀遺傳沉默的miR-149與鄰近CpG區(qū)域的高甲基化有關。許多參與DNA甲基化和組蛋白乙?；{(diào)控的酶，如DNA甲基轉移酶(DNMTs)、組蛋白脫乙酰酶或多梳抑制復合體基因等都參與了染色質(zhì)結構的調(diào)控。有趣的是，許多研究表明，天然存在的生物活性化合物可以抑制這些酶的活性。例如，綠茶兒茶素中的活性多酚表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯可以抑制DNMTs的活性，從而抑制DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達。此外，I期先導研究顯示，黑樹莓可以使人體內(nèi)一些結直腸癌的抑癌基因去甲基化，而BRB花色苷也可以通過抑制結腸癌細胞中的DNMT1和DNMT3b使抑癌基因去甲基化。此外，在癌前病變組織中，黑樹莓保護性地調(diào)節(jié)Wnt信號通路中基因的甲基化。因此，我們推測BRB花色苷對miRNA表達(以及可能的活性)的影響可能是通過BRB花色苷對表觀遺傳機制的影響來介導的。然而，BRB花色苷是否可以通過調(diào)節(jié)參與表觀遺傳過程的酶來影響miRNAs的表達，這還是一個有待進一步研究的課題。
綜上所述，本研究結果表明，miR-483-3p可能通過其靶基因之一Dkk3調(diào)控Wnt/β-catenin途徑在結直腸癌中發(fā)揮重要作用，并且miR-483-3p的表達可被BRB花色苷下調(diào)，進一步證明了BRB花色苷作為結直腸癌化學預防劑的潛力。此外，miR-483-3p的沉默可顯著抑制大腸癌細胞的遷移和增殖，提示特異性靶向miR-483-3p的表達也可能成為未來治療大腸癌的一種途徑。
圖1 BRB花色苷對AOM/DSS誘導小鼠及不同大腸癌細胞株miR-483-3p表達的影響。a、miRNAs在小鼠結腸中的差異表達。綠色-下調(diào)；紅色-上調(diào)。B，下調(diào)的miRNAs用藍色表示。定量RT-PCR檢測AOM/DSS誘導的小鼠接受和不接受BRB花色苷后結腸組織miR-483-3p的水平。d、BRB花色苷處理前后HCT-116細胞miR-483-3p的相對表達。經(jīng)BRB花色苷處理的LoVo細胞miR-483-3p的相對表達量。f，在加或不加BRB花色苷的SW480細胞中，miR-483-3p的相對表達。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。*和**分別在P<0.05和P<0.01水平上與對照組(不補充BRB)有顯著差異。AOM，偶氮甲烷；BRB，黑莓；CRC，結直腸癌；DSS，葡聚糖硫酸鈉；miRNAs，microRNAs；RT-PCR，實時聚合酶鏈反應[彩色圖表可在wileyonlinelibrary.com查看]
圖2 利用生物信息學分析預測miR-483-3p靶基因。不同物種miR-483-3p序列的比對。B，靶向DKK3mRNA 3‘-UTR位點的miR-483-3p模型。根據(jù)在線數(shù)據(jù)庫PROGeneV2的數(shù)據(jù)分析DKK3與大腸癌患者生存時間的關系。免疫組織化學染色顯示大腸癌組織中D、DKK3水平。數(shù)據(jù)來源于人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫。圖2D中DKK3蛋白表達的免疫組化染色數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。3‘-UTR，3’-非翻譯區(qū)；CRC，結直腸癌；miR，microRNA[彩色圖可在wileyonlinelibrary.com查看].
圖3 miR-483-3p下調(diào)DKK3的表達。將miR-483-3p抑制劑轉染LOVO和SW480細胞，qRT-PCR檢測miR-483-3p(A和B)和DKK3(C和D)的表達水平，Western blot檢測DKK3(E和F)的表達水平。Western blot檢測BRB花色苷對LoVo(G)和SW480(H)細胞DKK3表達的影響。qRT-PCR數(shù)據(jù)為三次測定的平均值±SEMs。*和**分別與對照組(未加miR-483-3p抑制劑)在P<0.05和P<0.01水平上有顯著性差異。對于Western blot分析，只顯示有代表性的斑點。BRB，黑樹莓；miR，microRNA；qRT-PCR，實時定量聚合酶鏈反應.
圖4 miR-483-3p對腫瘤發(fā)生相關基因和細胞遷移的影響。Western blot分析轉染β-483-3p抑制劑后LoVo(A)和SW480(B)細胞中c-myc、cyclinD1、CDK4、Bcl2、bax、E-cadherin和β-actin的表達水平。傷口愈合實驗顯示轉染miR-483-3p抑制劑后的LoVo(C)和SW480(D)細胞遷移能力降低。圖像旁邊的圖定量比較了在沒有miR-483-p抑制劑和存在miR-483-p抑制劑的情況下相應細胞的遷移距離。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。*和**分別在P<0.05和P<0.01水平上與對照組(不補充BRB)有顯著差異。BRB，黑色樹莓；miR，microRNA。
圖5 miR-483-3p對大腸癌細胞增殖和集落形成的影響。將miR-483-3p抑制劑轉染人大腸癌細胞、LoVo細胞和SW480細胞，A、B用MTT法檢測細胞存活率，C、D用集落形成實驗檢測細胞增殖。這些曲線圖顯示了C和D中數(shù)據(jù)的定量比較。數(shù)據(jù)以均值±SEMS表示。*和**分別在P<0.05和P<0.01水平上與對照組(不補充BRB)有顯著差異。BRB，黑色覆盆子；CRC，結直腸癌；MTT，3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴[彩色圖形可在wileyonlinelibrary.com查看]
圖6 這個模型描述了miR-483-3p如何通過BRB花青素的化學預防作用來對抗結直腸癌，在CRC細胞中，miR-483-3p可以通過下調(diào)DKK3的表達來促進細胞的增殖和遷移。BRB花色苷可抑制miR-483-3p，從而抑制大腸癌細胞的增殖和遷移。3‘-UTR，3’-非翻譯區(qū)；BRB，黑莓；CRC，結直腸癌；miR，microRNA[彩色圖形可在wileyonlinelibrary.com查看]
本文由福山生物整理翻譯，轉載請注明出處。
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