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miR-24-1-5p的上調(diào)參與了黑樹(shù)莓花色苷對(duì)結(jié)直腸癌的化學(xué)預(yù)防作用
發(fā)表于：2019-05-13 作者：admin 來(lái)源：本站 點(diǎn)擊量：9274
摘要
作為重要的表觀遺傳調(diào)控因子，microRNA通過(guò)觸發(fā)靶mRNA的降解和/或通過(guò)抑制其翻譯來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)。已報(bào)道在包括結(jié)直腸癌的一些癌癥中存在microRNA表達(dá)失調(diào)。在這項(xiàng)研究中，microRNA陣列差異分析顯示，在用黑樹(shù)莓花色苷喂養(yǎng)9周的偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織中，miR-24-1-5p的表達(dá)顯著增強(qiáng)。在人類(lèi)結(jié)直腸癌細(xì)胞中，miR-24-1-5p的過(guò)度表達(dá)顯著抑制了β-連環(huán)蛋白的表達(dá)，同時(shí)降低了細(xì)胞的增殖、遷移和存活。此外，mir-24-1-5p可以靶向β-連環(huán)蛋白并觸發(fā)β-連環(huán)蛋白及其下游靶基因的負(fù)調(diào)控環(huán)。β-連環(huán)蛋白信號(hào)對(duì)人結(jié)直腸癌的形成和發(fā)展至關(guān)重要。因此，目前的研究發(fā)現(xiàn)，miR-24-1-5p是β-連環(huán)蛋白的有效調(diào)節(jié)因子，這可能為β-連環(huán)蛋白信號(hào)驅(qū)動(dòng)的結(jié)直腸癌提供一種新的化學(xué)預(yù)防和治療策略。
結(jié)直腸癌（CRC）是全球第三大惡性腫瘤，約占所有癌癥發(fā)病率和死亡率的10 %。盡管過(guò)去20年里人們致力于CRC診斷和治療策略，但仍有五分之一的患者被診斷為CRC時(shí)已進(jìn)入晚期，通常采用手術(shù)和輔助化療相結(jié)合的方法進(jìn)行治療（3-5）。大多數(shù)患者發(fā)生化療耐藥，癌癥可能再次發(fā)生在這些患者身上并最終轉(zhuǎn)移（6）。最近一些研究已經(jīng)報(bào)道了microRNA（miRNA）表達(dá)與CRC（7-9）進(jìn)展的顯著關(guān)聯(lián)。因此，在RNA網(wǎng)絡(luò)分析的基礎(chǔ)上，尋找一種可用于預(yù)防或治療結(jié)直腸癌的新靶點(diǎn)是十分必要的。
miRNA是一種長(zhǎng)度為18-22 nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過(guò)結(jié)合mRNA的3′-UTR（未翻譯區(qū)域）來(lái)干擾其翻譯，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，直接降解結(jié)合的mRNA（10,11）。在許多人類(lèi)癌癥中，miRNA的異常表達(dá)可激活腫瘤抑制基因或癌基因。在結(jié)直腸癌中，有幾個(gè)miRNA被鑒定為腫瘤發(fā)育的必要條件。Michael等人（12）首次報(bào)道了人結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)腸直腸粘膜中miRNA的表達(dá)差異，共檢測(cè)到28個(gè)差異表達(dá)的miRNA，包括miR-320、miR-321、miR-200c、miR-223和miR-145。Monzo等人（13）發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p可以靶向E2F轉(zhuǎn)錄因子1，該轉(zhuǎn)錄因子存在于人類(lèi)結(jié)腸早期胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生時(shí)期并調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。其他研究者報(bào)道，miR-34a直接并負(fù)向控制p53的一系列下游靶基因，形成miR-34a-p53的正反饋環(huán)（14）。Bandres等人（15）發(fā)現(xiàn)，miRNA-451可以調(diào)節(jié)遷移抑制因子（MIF）的表達(dá)，從而抑制CRC細(xì)胞的增殖，提高腫瘤對(duì)放療的敏感性。此外，miRNA-320a和miR-139可分別靶向β-連環(huán)蛋白和RAP1B（RAS癌基因家族成員），抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖（16，17）。2001年，Lagos Quintana等人（18）在研究非脊柱動(dòng)物和脊柱動(dòng)物時(shí)首次發(fā)現(xiàn)了miR-24。人的miR-24由miR-24-1和miR-24-2組成，分別位于9號(hào)和19號(hào)染色體上，成熟序列包括miR-24-3p、miR-24-1-5p和miR-24-2-5p（19）。有報(bào)道稱(chēng)，miR-24-1在數(shù)種癌癥組織中表達(dá)異常（20-26）。然而，miR-24-1-5p在CRC中的功能尚不清楚。
黑樹(shù)莓（BRB）屬于莓類(lèi)中的Rubus occidentalis科，富含黃酮類(lèi)和酚酸（27，28）。BRB對(duì)結(jié)直腸癌的化學(xué)預(yù)防作用已被本研究組和其他研究組（29-32）的研究所證實(shí)。然而，很少有研究關(guān)注miRNA與BRB在結(jié)直腸癌中的化學(xué)預(yù)防作用及其潛在機(jī)制的相關(guān)性。
在本研究中，我們假設(shè)miR-24-1-5p在結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，也參與了BRB對(duì)結(jié)直腸癌的化學(xué)預(yù)防作用。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們?cè)谛∈笊线M(jìn)行了一項(xiàng)體內(nèi)研究，并對(duì)人類(lèi)細(xì)胞系進(jìn)行了數(shù)項(xiàng)體外研究，發(fā)現(xiàn)miR-24-1-5p可以作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用，其靶向數(shù)個(gè)CRC相關(guān)通路中的β-連環(huán)蛋白相關(guān)癌基因。我們目前的發(fā)現(xiàn)可能有助于發(fā)展新的診斷和治療策略，用以預(yù)防和治療結(jié)直腸癌。
方法
化合物與試劑
氧化偶氮甲烷（AOM，A5486）購(gòu)自Sigma Aldrich公司，葡聚糖硫酸鈉（DSS，0216011091）購(gòu)自MP公司。建豐自然產(chǎn)品技術(shù)有限公司提供BRB花色苷（純度>90%）。BRB花色苷由三種主要花色苷——矢車(chē)菊素葡萄糖苷、矢車(chē)菊素木糖基蘆丁糖苷和矢車(chē)菊素蕓香糖苷組成，含量分別為2.63、0.73和16.91 mg/g。矢車(chē)菊素桑布雙糖苷的含量不太豐富，我們最近發(fā)表的論文（33）詳細(xì)介紹了這一點(diǎn)。β-連環(huán)蛋白、細(xì)胞周期蛋白D1、c-Myc和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶4（CDK4）從細(xì)胞信號(hào)技術(shù)公司獲得，β-肌動(dòng)蛋白、E-鈣粘蛋白、糖原合酶激酶3β（GSK3-β）、磷酸糖原合酶激酶3β（p-GSK3-β）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（BCL-2）和血凝素從Sangon Biotech有限公司獲得。分泌型卷曲相關(guān)蛋白2（SFRP2）購(gòu)自Abcam公司。從Biorbyt Explore生物試劑公司中購(gòu)得分泌型卷曲相關(guān)蛋白5（SFRP5）。免疫印跡的二級(jí)抗體為辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG，從ComWin生物科技有限公司獲得。
（譯者注：化學(xué)結(jié)構(gòu)式從左至右分別為矢車(chē)菊素葡萄糖苷、矢車(chē)菊素木糖基蘆丁糖苷、矢車(chē)菊素蕓香糖苷與矢車(chē)菊素桑布雙糖苷）
動(dòng)物護(hù)理和實(shí)驗(yàn)方案
5周大的雄性C57BL/6J小鼠（18-20g，本溪長(zhǎng)生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）給予隨意飲水，維持在12小時(shí)光暗循環(huán)下。這些動(dòng)物被關(guān)在籠子里（每籠5只動(dòng)物），房間溫度設(shè)置為21±2.0°C，濕度控制50±5%。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均獲遼寧中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)（中國(guó)，沈陽(yáng)）批準(zhǔn)。
結(jié)腸炎誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌小鼠模型的建立及黑樹(shù)莓花色苷的補(bǔ)充
在1周適應(yīng)期后，小鼠單次腹腔注射AOM（10 mg/kg體重）。1周后，在飲用水中給予2% DSS持續(xù)1周，接著給予正常水持續(xù)2周，該循環(huán)再重復(fù)2次。
小鼠分為三組：一組健康對(duì)照組和兩組AOM/DSS處理組。每組10只。健康對(duì)照組的小鼠沒(méi)有接受任何處理，喂以飼料超過(guò)9周。對(duì)于兩個(gè)AOM/DSS處理組，一組只用飼料喂養(yǎng)，而另一組則用含有7.0μmol/g BRB花色苷的飼料（10%BRB）喂養(yǎng)。添加飼料中BRB花色苷濃度相當(dāng)于10%凍干BRB粉中的花色苷含量，這是基于前人研究（32,34）選定的。飼料和BRB花色苷補(bǔ)充飼料的配方組成如表1所示。實(shí)驗(yàn)中的所有飼料使用前儲(chǔ)存于-20 ℃。
在第9周結(jié)束后，小鼠吸入二氧化碳后頸椎脫臼處死。結(jié)腸組織立即冷凍在液氮中，然后儲(chǔ)存在-80℃下準(zhǔn)備進(jìn)行microRNA陣列分析。
表1 飼料和BRB花色苷補(bǔ)充飼料的配方
MicroRNA微陣列表達(dá)譜與數(shù)據(jù)分析
miRNA表達(dá)譜由Agilent Mouse miRNA（8×60K，設(shè)計(jì)ID:070155；Agilent Technologies公司）生成。總RNA用NanoDrop ND-2000（Thermo Scientific）定量。用Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies公司）評(píng)估RNA完整性?？俁NA去磷酸化、變性后，用花青苷-3-胞苷三磷酸標(biāo)記。純化后，標(biāo)記的RNA與微陣列雜交。清洗后，使用Agilent Scanner G2505C（Agilent Technologies公司）對(duì)陣列進(jìn)行掃描。陣列圖像用Feature Extraction軟件（版本10.7.1.1；Agilent Technologies公司）獲取。使用GeneSpring軟件（版本13.1；Agilent Technologies公司）分析原始數(shù)據(jù)。
RNA提取與定量實(shí)時(shí)PCR
總RNA使用Trizol試劑盒（Comwin Biotech有限公司）從細(xì)胞中分離，并使用miRNA cDNA合成試劑盒（ComWin Biotech有限公司）通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生第一鏈互補(bǔ)DNA（cDNA）編碼的帶poly A尾的miRNA。實(shí)時(shí)PCR（RT-PCR）采用SYBR Green方法以特異性引物進(jìn)行。根據(jù)制造商的說(shuō)明，RT-PCR在Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行擴(kuò)增，并用microRNA實(shí)時(shí)分析試劑盒（ComWin Biotech有限公司）進(jìn)行分析。引物序列為：mmu-miR-24-1-5p：正鏈5′-AGTGCCTACTGAGCTGATATCAGT-3′；hsa-miR-24-1-5p：正鏈5′-GTGCCTACTGAGCTGATATCAGT-3′；β-連環(huán)蛋白：正鏈 5′-GCTGGTGACAGGGAAGACAT-3′，反鏈5′-AGGCAAACCGTGAAAAGATG-3′；細(xì)胞周期蛋白D1：正鏈5′-AACTACCTGGACCGCTTCCT-3′，反鏈 5′-CCACTTGAGCTTGTTCACCA-3′；c-Myc：正鏈5′-TTCGGGTAGTGGAAAACCAG-3′，反鏈5′-CAGCAGCTCGAATTTCTTCC-3′；CDK4：正鏈 5′-ATTGGTGTCGGTGCCTATG-3′，反鏈5′-AACTGTGCTGATGGGAAGG-3′。這些基因的表達(dá)水平按照2–ΔΔCT方法以內(nèi)部對(duì)照（U6：正鏈 5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反鏈5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′或β-肌動(dòng)蛋白：正鏈5′-AGGCAAACCGTGAAAAGATG-3′，反鏈 5′-AGGCAAACCGTGAAAAGATG-3′）正?；?。
（譯者注：正鏈（forward strand），與mRNA序列相同的DNA單鏈，另一條則為反鏈（reverse strand）；互補(bǔ)DNA鏈中攜帶編碼蛋白質(zhì)信息的鏈稱(chēng)為正義鏈（sense strand），又稱(chēng)編碼鏈（coding strand），另一條稱(chēng)為反義鏈（antisense strand），又稱(chēng)模板鏈（template strand）。）
質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染
miR-24-1-5p的成熟序列為UGCCUACUGAGCUGAUAUCAGU。人pri miR-24-1-5p序列構(gòu)建使用如下引物：miR-24-1-5p正鏈， 5′-CCGCTCGAGCAACAGGGTTTTCCAAGTCTAC-3′；miR-24-1-5p反鏈，5′-GGAAGATCTTCACCTAAGTCGGAAATCATGTGGTA-3′。PCR產(chǎn)物用XhoI和BglII 這一對(duì)內(nèi)切酶消化，插入到XhoI-BglII切開(kāi)的pcDNA3-血凝素（質(zhì)粒載體）中。然后用lipofectamine 2000（Invitrogen）將HCT-116和Caco-2細(xì)胞與人pri-miR-24-1-5p一起轉(zhuǎn)染。用空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。構(gòu)建的人pri-miR-24-1-5p經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。
（備注：成熟的miRNAs是由較長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過(guò)一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，初級(jí)轉(zhuǎn)錄物稱(chēng)為pri-miRNA。pri-miRNA長(zhǎng)度從幾百到幾千個(gè)堿基不等，帶有5‘帽子和3’poly A尾巴，以及1到數(shù)個(gè)發(fā)夾徑環(huán)結(jié)構(gòu)。pri-miRNA經(jīng)剪切產(chǎn)生約70個(gè)堿基的miRNA前體，即pre-miRNA。pre-miRNA為單一發(fā)夾結(jié)構(gòu)，5‘帶有磷酸基團(tuán)，3’有兩個(gè)突出堿基，并帶有3‘羥基。pre-miRNA經(jīng)進(jìn)一步剪切，形成長(zhǎng)度約為22個(gè)堿基的單鏈成熟miRNA。）
細(xì)胞培養(yǎng)
人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT-116（CCL-247；美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC，American type culture collection））和Caco-2（北京癌癥研究所細(xì)胞庫(kù)）分別在Dulbecco改進(jìn)的Eagle's培養(yǎng)基和α-最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Hyclone，Thermo Fisher Scientific公司）中培養(yǎng)。這兩種培養(yǎng)基中都添加10%（v/v）胎牛血清（大連美倫生物）、10000 U/ml青霉素G、10 mg/ml鏈霉素，在37℃的5% CO2濕潤(rùn)空氣中孵育。
傷口愈合試驗(yàn)
傷口愈合試驗(yàn)采用匯合度為70%的HCT-116和Caco-2細(xì)胞。首先，用無(wú)菌移液管尖端在細(xì)胞單層上劃一條直線。用PBS洗滌細(xì)胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基。然后用miR-24-1-5p轉(zhuǎn)染，24小時(shí)后，丟棄培養(yǎng)基，用顯微照片計(jì)算劃痕中剩余的間隙。
細(xì)胞增殖和群落形成分析
用 3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）法測(cè)定細(xì)胞活力。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，在miR-24-1-5p轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，用0.5 mg/ml MTT試劑培養(yǎng)Caco-2和HCT-116細(xì)胞4小時(shí)。然后去除培養(yǎng)基，在每個(gè)孔中加入100μl二甲亞砜，以溶解甲贊晶體。在490nm處測(cè)量板的吸光度。為了進(jìn)一步研究miR-24-1-5p在癌細(xì)胞存活中的作用，將細(xì)胞以200/孔接種在六孔板中，培養(yǎng)2周進(jìn)行菌落形成分析。出現(xiàn)的細(xì)胞群落首先用PBS洗滌，然后用甲醇固定，再用0.5%的吉姆薩染液（Giemsa，天青-伊紅）染色。用倒置顯微鏡計(jì)數(shù)每孔中出現(xiàn)的群落數(shù)。
Transwell遷移分析
將Caco-2和HCT-116細(xì)胞接種在Transwell孔的上室，在下室中加入無(wú)血清培養(yǎng)基。24小時(shí)后，用棉簽去除膜頂部的細(xì)胞，然后用4%多聚甲醛固定Transwell孔插入膜。遷移到膜底的細(xì)胞用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司）染色。從每個(gè)插入膜中隨機(jī)選擇10個(gè)域，在20倍放大的顯微鏡下進(jìn)行捕獲。使用Image Pro Plus 6.0對(duì)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行量化。為了計(jì)算遷移指數(shù)，將每個(gè)處理組捕獲的細(xì)胞數(shù)歸一化為對(duì)照組細(xì)胞數(shù)。
microRNA的靶向預(yù)測(cè)
利用Miranda 3.3a版的算法和網(wǎng)站工具（http://www.microrna.org/microrna/home.do）對(duì)miR-24-1-5p的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并給出了默認(rèn)參數(shù)和截止值（評(píng)分S≥140，能量E≤-7.0）。
蛋白質(zhì)印跡
細(xì)胞在含1 mmol/L苯甲磺酰氟（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司）的冷凍放射免疫沉淀分析緩沖液中置于冰上30分鐘。在4℃下14000 g離心15 分鐘，收集上清液，用10%凝膠SDS－PAGE法測(cè)定含有40μg蛋白的上清液。電泳后，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（(Sangon Biotech有限公司）上，用5%牛血清白蛋白V（Roche）在Tris緩沖鹽水和吐溫20緩沖液中封閉2小時(shí)，然后在室溫下與合適的一級(jí)抗體孵育3小時(shí)，然后上相應(yīng)的二級(jí)抗體。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光技術(shù)（Amersham Life Science）檢測(cè)印跡上的信號(hào)。
免疫組織化學(xué)染色
收集AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠腸道組織，無(wú)論是否含有BRB花色苷，固定在10%的福爾馬林緩沖液中，并如前所述嵌入石蠟中（35）。組織切片（4μm厚）用抗E-鈣粘蛋白抗體（Santa Cruz生物技術(shù)）進(jìn)行免疫組化染色。流程與先前報(bào)道類(lèi)似（35）。簡(jiǎn)言之，切片脫蠟、復(fù)水，3% H2O2淬滅，10%的正常血清封閉，然后用β-連環(huán)蛋白抗體在4℃孵育過(guò)夜，接著用二級(jí)抗體和親和素-生物素復(fù)合物（ABC試劑盒；Vector Laboratory）孵育。用3’,5’-二氨基聯(lián)苯胺進(jìn)行染色，再用蘇木精進(jìn)行輕微復(fù)染。彩色載玻片的圖像由Aperio Image系統(tǒng)采集。
統(tǒng)計(jì)方法
采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。為了比較組內(nèi)和組間的差異，采用t檢驗(yàn)和方差分析，然后進(jìn)行Fisher最小顯著性差異分析。在P<0.05水平上考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)論
組織microRNA微陣列分析
為了闡明miRNA介導(dǎo)的結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生通路，識(shí)別異常表達(dá)的miRNA是第一步。基于這一點(diǎn)，我們進(jìn)行了組織miRNA微陣列分析，以獲得AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠（無(wú)論是否補(bǔ)充BRB花色苷）結(jié)腸組織中總miRNA表達(dá)特征。兩組結(jié)果的比較表明，通過(guò)給予BRB花色苷，數(shù)個(gè)miRNA的調(diào)節(jié)有差異（圖1（a））。組織陣列的層次聚類(lèi)分析結(jié)果如圖1（b）所示。AOM/DSS誘導(dǎo)組表達(dá)低水平的miR-24-1-5p，但用BRB花色苷喂養(yǎng)9周后，miR-24-1-5p水平顯著上調(diào)，提示miR-24-1-5p可能對(duì)腫瘤形成有抑制作用。這也證實(shí)了BRB花色苷的化學(xué)預(yù)防功能。
圖1 mircoRNA（miRNA）在小鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)差異。（a）上調(diào)的miRNA用紅色表示。（b）組織miRNA陣列。綠色-下調(diào)；紅色-上調(diào)（n=5）。AOM，偶氮甲烷；DSS，葡聚糖硫酸鈉；BRB，黑樹(shù)莓。
miR-24-1-5p在偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織中表達(dá)下調(diào)，在用黑樹(shù)莓花色苷處理的人結(jié)直腸癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)
為了進(jìn)一步評(píng)估小鼠模型微陣列分析結(jié)果，采用定量RT-PCR（qRT-PCR）分析了有與無(wú)BRB花色苷給藥的AOM/DSS誘導(dǎo)組結(jié)腸組織中的miR-24-1-5p表達(dá)。qRT-PCR獲得的miR-24-1-5p的表達(dá)模式與微陣列數(shù)據(jù)一致（圖2（a））。在用不同劑量的BRB花色苷處理后，測(cè)定了幾種人結(jié)直腸癌細(xì)胞系（Caco-2、HCT-116、Lovo、HT29和SW480）中miR-24-1-5p的表達(dá)。BRB花色苷導(dǎo)致miR-24-1-5p水平升高。在BRB花色苷處理的人類(lèi)腫瘤細(xì)胞中，miR-24-1-5p的表達(dá)模式與用BRB花色苷補(bǔ)充飲食喂養(yǎng)的小鼠結(jié)腸組織獲得的miRNA微陣列和qRT-PCR數(shù)據(jù)一致（圖2（b））。
圖2 定量RT-PCR（qRT-PCR）檢測(cè)結(jié)腸組織和結(jié)直腸癌（CRC）細(xì)胞中miR-24-1-5p的表達(dá)。（a）qRT-PCR分析添加或不添加黑樹(shù)莓（BRB）花色苷的偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織中的miR-24-1-5p水平。（b）在不同的CRC細(xì)胞系中，相對(duì)的miR-24-1-5p表達(dá)。單因素方差分析用于比較不同組的人結(jié)直腸癌細(xì)胞系或小鼠結(jié)腸組織。值為平均值（n=5），其標(biāo)準(zhǔn)誤差由豎線表示。與溶劑對(duì)照組比較，平均值有顯著性差異：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。（a）
，對(duì)照；
，AOM+DSS模型；
，AOM+DSS+BRB花色苷。（b）
，對(duì)照；25μg/ml BRB花色苷；
，50μg/ml BRB花色苷。
黑樹(shù)莓花色苷可降低偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠的β-連環(huán)蛋白含量。
為了研究β-連環(huán)蛋白在BRB花色苷原位調(diào)節(jié)的AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠中的作用，我們進(jìn)行了免疫組化染色。與不給予BRB花色苷飲食的AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠相比，給予BRB花色苷飲食的AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠小腸的β-連環(huán)蛋白水平顯著降低（圖3）。
圖3 黑樹(shù)莓花色苷補(bǔ)充劑對(duì)小鼠結(jié)腸組織β-連環(huán)蛋白表達(dá)的影響。用免疫組化染色法（抗β-連環(huán)蛋白抗體1:100稀釋?zhuān)z測(cè)偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)小鼠的腸上皮細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白的原位表達(dá)（分別放大20倍和40倍）。
，對(duì)照組；
，AOM+DSS模型；
，AOM+DSS+BRB花色苷。
恢復(fù)miR-24-1-5p表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖和遷移的影響
為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)miR-24-1-5p的生物學(xué)功能，用miR-24-1-5p轉(zhuǎn)染人HCT-116和Caco-2細(xì)胞，MTT法測(cè)定細(xì)胞的活力。與相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞（圖4（a）和（b））相比，miR-24-1-5p-轉(zhuǎn)染的HCT-116和Caco-2細(xì)胞均表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞活力降低（HCT-116為56%，Caco-2為52%）。這些細(xì)胞也表現(xiàn)出顯著的硬化減少，如傷口愈合試驗(yàn)所示（圖4（c）和（d））。此外，它們表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞遷移和細(xì)胞存活率降低，分別由Transwell分析（圖4（e）和（f））和菌落形成分析（圖4（g）和（h））顯示。綜上所述，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-24-1-5p可顯著降低這些人結(jié)直腸癌細(xì)胞株的增殖、遷移和存活，從而表明miR-24-1-5p可能通過(guò)減少或抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)而在結(jié)直腸癌中起到腫瘤抑制作用。
圖4 miR-24-1-5p抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和形成。用5μg的miR-24-1-5p轉(zhuǎn)染HCT-116和Caco-2細(xì)胞24小時(shí)，然后進(jìn)行以下分析：（a）用定量RT-PCR法測(cè)定miR-24-1-5p的表達(dá)水平。（b）用 3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽分析法測(cè)定細(xì)胞活力。（c，d）通過(guò)傷口愈合試驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞遷移。對(duì)細(xì)胞遷移的抑制作用通過(guò)24小時(shí)傷口面積增加的百分比來(lái)確定，0小時(shí)傷口面積為100%。
，空白載體；
，miR-24-1-5p。（e，f）細(xì)胞侵襲用顯微鏡檢查。（g，h）細(xì)胞群落形成的典型顯微照片和定量分析。采用單因素方差分析比較組內(nèi)和組間的差異，然后進(jìn)行Fisher最小顯著性差異分析。值是平均值（n=3），其標(biāo)準(zhǔn)誤差由豎線表示。與空白載體對(duì)照組相比，平均值有顯著性差異：**P<0.01，***P<0.001。
miR-24-1-5p調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白
利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了miR-24-1-5p可能結(jié)合的靶基因，采用Miranda 3.3a版默認(rèn)參數(shù)和截止值（評(píng)分S≥140，能量E≤-7.0）。考慮到β-連環(huán)蛋白在CRC發(fā)展中的重要作用，選擇β-連環(huán)蛋白作為可能的靶點(diǎn)。在β-連環(huán)蛋白的3′-UTR處檢測(cè)到一個(gè)結(jié)合域，它可能與miR-24-1-5p相互作用（圖5（a））。此外，為了研究miR-24-1-5p對(duì)β-連環(huán)蛋白表達(dá)的影響，過(guò)表達(dá)人HCT-116和Caco-2細(xì)胞中的miR-24-1-5p，用qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)β-連環(huán)蛋白水平的變化。在這兩個(gè)細(xì)胞系中，當(dāng)miR-24-1-5p過(guò)度表達(dá)時(shí)，β-連環(huán)蛋白的蛋白水平顯著降低，而其mRNA水平保持不變（圖5（b）和（c））。
進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)用miR-24-1-5p或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染HCT-116和Caco-2細(xì)胞24小時(shí)，在細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析前，將放線菌酮（10μM）在不同時(shí)間間隔加入細(xì)胞，測(cè)定β-連環(huán)蛋白的蛋白質(zhì)合成率。結(jié)果表明，與對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，miR-24-1-5p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白的蛋白水平明顯降低，提示miR-24-1-5p能促進(jìn)β-連環(huán)蛋白的降解，影響其穩(wěn)定性。結(jié)果還提示，miR-24-1-5p可能通過(guò)直接結(jié)合β-連環(huán)蛋白的3′-UTR來(lái)負(fù)向調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白。
圖5 miR-24-1-5p通過(guò)直接結(jié)合3′-UTR（未翻譯區(qū)域）抑制β-連環(huán)蛋白的表達(dá)。（a）β-連環(huán)蛋白3′-UTR中假定的miR-24-1-5p結(jié)合位點(diǎn)的序列比對(duì)。（b）HCT-116和Caco-2細(xì)胞經(jīng)miR-24-1-5p轉(zhuǎn)染后β-連環(huán)蛋白水平的蛋白質(zhì)印跡分析。（c）HCT-116和Caco-2細(xì)胞經(jīng)miR-24-1-5p轉(zhuǎn)染后β-連環(huán)蛋白水平的定量RT-PCR分析。（d）10μM放線菌酮（CHX）不同時(shí)間處理后β-連環(huán)蛋白水平（0、10、12、14小時(shí)）。采用單因素方差分析比較組內(nèi)和組間的差異，然后進(jìn)行Fisher最小顯著性差異分析。
，空白載體；
，miR-24-1-5p。HA，血凝素。
與Wnt/β-連環(huán)蛋白通路相關(guān)的基因由miR-24-1-5p調(diào)控
還研究了miR-24-1-5p過(guò)度表達(dá)對(duì)β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路下游幾個(gè)靶基因的影響。用蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR檢測(cè)HCT-116和Caco-2細(xì)胞周期蛋白D1、c-Myc和CDK4表達(dá)水平的變化。HCT-116和Caco-2細(xì)胞中這些基因的mRNA和蛋白質(zhì)水平在被miR-24-1-5p轉(zhuǎn)染后24小時(shí)均下降（圖6（a）和（b））。此外，還分析了與Wnt/β-連環(huán)蛋白通路相關(guān)的其他基因，如SFRP2、SFRP5、E-鈣粘蛋白、GSK3-β、P-GSK3-β和Bcl-2。E-鈣粘蛋白、p-GSK3-β和SFRP5的表達(dá)上調(diào)，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，GSK3-β和SFRP2的表達(dá)無(wú)顯著變化（圖6（c））?？傊瑏?lái)自體外人類(lèi)癌細(xì)胞的數(shù)據(jù)表明β-連環(huán)蛋白可能是miR-24-1-5p的直接靶點(diǎn)，miR-24-1-5p的調(diào)節(jié)作用通過(guò)影響β-連環(huán)蛋白下游靶基因表達(dá)來(lái)發(fā)揮。
圖6 miR-24-1-5p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)相關(guān)基因的影響。HCT-116和Caco-2細(xì)胞在5μg miR-24-1-5p轉(zhuǎn)染24h后，細(xì)胞周期蛋白D1、c-Myc 和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶4（CDK4）的mRNA定量RT-PCR（a）或蛋白質(zhì)印跡（b）分析結(jié)果。（c）經(jīng)miR-24-1-5p轉(zhuǎn)染24小時(shí)后HCT-116和Caco-2細(xì)胞中糖原合成酶激酶3β（GSK3-β）、分泌型卷曲相關(guān)蛋白2（SFRP2）、分泌型卷曲相關(guān)蛋白5（SFRP5）、B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、E-鈣粘蛋白和磷酸糖原合成酶激酶3β（p-GSK3-β）蛋白水平的蛋白質(zhì)印跡分析。組內(nèi)和組間差異采用單因素方差分析比較，然后進(jìn)行Fisher最小顯著性分析。與空白載體對(duì)照組相比，平均值有顯著差異：*P<0.05，**P<0.01。
，空白載體；
，miR-24-1-5p。
討論
積累的證據(jù)表明，細(xì)胞中嚴(yán)格調(diào)控的RNA網(wǎng)絡(luò)可能被異常表達(dá)的miRNA破壞，從而引發(fā)癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。miRNA在各種人類(lèi)癌癥中的重要性表明，調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)可能是癌癥化學(xué)預(yù)防和治療的新策略（36）。在本研究中，食用含有BRB花色苷飲食的AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠中，miR-24-1-5p顯著上調(diào)。此外，機(jī)制研究表明，miR-24-1-5p可能起到腫瘤抑制作用，該作用由其在人類(lèi)CRC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)抑制細(xì)胞增殖、遷移、存活以及群落形成的能力產(chǎn)生（圖3）。miR-24-1-5p的腫瘤抑制作用似乎是由對(duì)β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的影響所介導(dǎo)（圖4和5）。
Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路在癌癥中的作用已通過(guò)該信號(hào)通路對(duì)CRC細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、血管生成、遷移和轉(zhuǎn)移的影響得到證實(shí)（37）。β-連環(huán)蛋白及其下游靶基因（包括c-Myc、細(xì)胞周期蛋白D1和CDK4）的異常激活可加速CRC的發(fā)生和發(fā)展。我們的結(jié)果清楚地表明，在人類(lèi)結(jié)直腸癌細(xì)胞中，這些基因可以通過(guò)改變miR-24-1-5p的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)。實(shí)際上，在HCT-116和Caco-2細(xì)胞中miR-24-1-5p的過(guò)表達(dá)下調(diào)了β-連環(huán)蛋白、c-Myc、細(xì)胞周期蛋白D1和CDK4的表達(dá)（圖6）。闡明經(jīng)β-連環(huán)蛋白介導(dǎo)的miR-24-1-5p調(diào)控的腫瘤通路和靶點(diǎn)，將為人類(lèi)結(jié)直腸癌的發(fā)生過(guò)程提供新的認(rèn)識(shí)。不幸的是，由于倫理問(wèn)題，我們無(wú)法從人類(lèi)受試者那里獲得直接證據(jù)來(lái)支持我們的主張。然而，有必要進(jìn)一步研究確定在CRC中靶向miR-24-1-5p的可行性，將其作為臨床水平對(duì)抗CRC的一種經(jīng)濟(jì)有效且簡(jiǎn)單的治療策略。BRB花色苷作為一種CRC的化學(xué)預(yù)防劑已被多次研究。該方向在動(dòng)物模型和臨床病人中得到了廣泛研究。BRB花色苷的化學(xué)預(yù)防作用機(jī)制包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和分化，減少細(xì)胞增殖、炎癥、血管生成和侵襲性（38）。BRB花色苷對(duì)結(jié)直腸癌的化學(xué)預(yù)防作用似乎也涉及腸道微生物群的改變和DNA去甲基化（39）。在本研究中，我們首次證明了BRB花色苷對(duì)CRC的化學(xué)預(yù)防作用也可能涉及到對(duì)miR-24-1-5p的上調(diào)，且我們通過(guò)小鼠模型證明了這一點(diǎn)。
總之，miR-24-1-5p可能作為腫瘤抑制因子，通過(guò)下調(diào)β-連環(huán)蛋白及其下游靶基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)。這可能是BRB花色苷顯示其對(duì)CRC的化學(xué)預(yù)防作用的機(jī)制的一部分。因此，miR-24-1-5p可被認(rèn)為是未來(lái)預(yù)防或治療結(jié)直腸癌的潛在藥物。
作為重要的表觀遺傳調(diào)控因子，microRNA通過(guò)觸發(fā)靶mRNA的降解和/或通過(guò)抑制其翻譯來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)。已報(bào)道在包括結(jié)直腸癌的一些癌癥中存在microRNA表達(dá)失調(diào)。在這項(xiàng)研究中，microRNA陣列差異分析顯示，在用黑樹(shù)莓花色苷喂養(yǎng)9周的偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織中，miR-24-1-5p的表達(dá)顯著增強(qiáng)。在人類(lèi)結(jié)直腸癌細(xì)胞中，miR-24-1-5p的過(guò)度表達(dá)顯著抑制了β-連環(huán)蛋白的表達(dá)，同時(shí)降低了細(xì)胞的增殖、遷移和存活。此外，mir-24-1-5p可以靶向β-連環(huán)蛋白并觸發(fā)β-連環(huán)蛋白及其下游靶基因的負(fù)調(diào)控環(huán)。β-連環(huán)蛋白信號(hào)對(duì)人結(jié)直腸癌的形成和發(fā)展至關(guān)重要。因此，目前的研究發(fā)現(xiàn)，miR-24-1-5p是β-連環(huán)蛋白的有效調(diào)節(jié)因子，這可能為β-連環(huán)蛋白信號(hào)驅(qū)動(dòng)的結(jié)直腸癌提供一種新的化學(xué)預(yù)防和治療策略。
結(jié)直腸癌（CRC）是全球第三大惡性腫瘤，約占所有癌癥發(fā)病率和死亡率的10 %。盡管過(guò)去20年里人們致力于CRC診斷和治療策略，但仍有五分之一的患者被診斷為CRC時(shí)已進(jìn)入晚期，通常采用手術(shù)和輔助化療相結(jié)合的方法進(jìn)行治療（3-5）。大多數(shù)患者發(fā)生化療耐藥，癌癥可能再次發(fā)生在這些患者身上并最終轉(zhuǎn)移（6）。最近一些研究已經(jīng)報(bào)道了microRNA（miRNA）表達(dá)與CRC（7-9）進(jìn)展的顯著關(guān)聯(lián)。因此，在RNA網(wǎng)絡(luò)分析的基礎(chǔ)上，尋找一種可用于預(yù)防或治療結(jié)直腸癌的新靶點(diǎn)是十分必要的。
miRNA是一種長(zhǎng)度為18-22 nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過(guò)結(jié)合mRNA的3′-UTR（未翻譯區(qū)域）來(lái)干擾其翻譯，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，直接降解結(jié)合的mRNA（10,11）。在許多人類(lèi)癌癥中，miRNA的異常表達(dá)可激活腫瘤抑制基因或癌基因。在結(jié)直腸癌中，有幾個(gè)miRNA被鑒定為腫瘤發(fā)育的必要條件。Michael等人（12）首次報(bào)道了人結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)腸直腸粘膜中miRNA的表達(dá)差異，共檢測(cè)到28個(gè)差異表達(dá)的miRNA，包括miR-320、miR-321、miR-200c、miR-223和miR-145。Monzo等人（13）發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p可以靶向E2F轉(zhuǎn)錄因子1，該轉(zhuǎn)錄因子存在于人類(lèi)結(jié)腸早期胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生時(shí)期并調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。其他研究者報(bào)道，miR-34a直接并負(fù)向控制p53的一系列下游靶基因，形成miR-34a-p53的正反饋環(huán)（14）。Bandres等人（15）發(fā)現(xiàn)，miRNA-451可以調(diào)節(jié)遷移抑制因子（MIF）的表達(dá)，從而抑制CRC細(xì)胞的增殖，提高腫瘤對(duì)放療的敏感性。此外，miRNA-320a和miR-139可分別靶向β-連環(huán)蛋白和RAP1B（RAS癌基因家族成員），抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖（16，17）。2001年，Lagos Quintana等人（18）在研究非脊柱動(dòng)物和脊柱動(dòng)物時(shí)首次發(fā)現(xiàn)了miR-24。人的miR-24由miR-24-1和miR-24-2組成，分別位于9號(hào)和19號(hào)染色體上，成熟序列包括miR-24-3p、miR-24-1-5p和miR-24-2-5p（19）。有報(bào)道稱(chēng)，miR-24-1在數(shù)種癌癥組織中表達(dá)異常（20-26）。然而，miR-24-1-5p在CRC中的功能尚不清楚。
黑樹(shù)莓（BRB）屬于莓類(lèi)中的Rubus occidentalis科，富含黃酮類(lèi)和酚酸（27，28）。BRB對(duì)結(jié)直腸癌的化學(xué)預(yù)防作用已被本研究組和其他研究組（29-32）的研究所證實(shí)。然而，很少有研究關(guān)注miRNA與BRB在結(jié)直腸癌中的化學(xué)預(yù)防作用及其潛在機(jī)制的相關(guān)性。
在本研究中，我們假設(shè)miR-24-1-5p在結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，也參與了BRB對(duì)結(jié)直腸癌的化學(xué)預(yù)防作用。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們?cè)谛∈笊线M(jìn)行了一項(xiàng)體內(nèi)研究，并對(duì)人類(lèi)細(xì)胞系進(jìn)行了數(shù)項(xiàng)體外研究，發(fā)現(xiàn)miR-24-1-5p可以作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用，其靶向數(shù)個(gè)CRC相關(guān)通路中的β-連環(huán)蛋白相關(guān)癌基因。我們目前的發(fā)現(xiàn)可能有助于發(fā)展新的診斷和治療策略，用以預(yù)防和治療結(jié)直腸癌。
方法
化合物與試劑
氧化偶氮甲烷（AOM，A5486）購(gòu)自Sigma Aldrich公司，葡聚糖硫酸鈉（DSS，0216011091）購(gòu)自MP公司。建豐自然產(chǎn)品技術(shù)有限公司提供BRB花色苷（純度>90%）。BRB花色苷由三種主要花色苷——矢車(chē)菊素葡萄糖苷、矢車(chē)菊素木糖基蘆丁糖苷和矢車(chē)菊素蕓香糖苷組成，含量分別為2.63、0.73和16.91 mg/g。矢車(chē)菊素桑布雙糖苷的含量不太豐富，我們最近發(fā)表的論文（33）詳細(xì)介紹了這一點(diǎn)。β-連環(huán)蛋白、細(xì)胞周期蛋白D1、c-Myc和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶4（CDK4）從細(xì)胞信號(hào)技術(shù)公司獲得，β-肌動(dòng)蛋白、E-鈣粘蛋白、糖原合酶激酶3β（GSK3-β）、磷酸糖原合酶激酶3β（p-GSK3-β）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（BCL-2）和血凝素從Sangon Biotech有限公司獲得。分泌型卷曲相關(guān)蛋白2（SFRP2）購(gòu)自Abcam公司。從Biorbyt Explore生物試劑公司中購(gòu)得分泌型卷曲相關(guān)蛋白5（SFRP5）。免疫印跡的二級(jí)抗體為辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG，從ComWin生物科技有限公司獲得。
動(dòng)物護(hù)理和實(shí)驗(yàn)方案
5周大的雄性C57BL/6J小鼠（18-20g，本溪長(zhǎng)生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）給予隨意飲水，維持在12小時(shí)光暗循環(huán)下。這些動(dòng)物被關(guān)在籠子里（每籠5只動(dòng)物），房間溫度設(shè)置為21±2.0°C，濕度控制50±5%。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均獲遼寧中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)（中國(guó)，沈陽(yáng)）批準(zhǔn)。
結(jié)腸炎誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌小鼠模型的建立及黑樹(shù)莓花色苷的補(bǔ)充
在1周適應(yīng)期后，小鼠單次腹腔注射AOM（10 mg/kg體重）。1周后，在飲用水中給予2% DSS持續(xù)1周，接著給予正常水持續(xù)2周，該循環(huán)再重復(fù)2次。
小鼠分為三組：一組健康對(duì)照組和兩組AOM/DSS處理組。每組10只。健康對(duì)照組的小鼠沒(méi)有接受任何處理，喂以飼料超過(guò)9周。對(duì)于兩個(gè)AOM/DSS處理組，一組只用飼料喂養(yǎng)，而另一組則用含有7.0μmol/g BRB花色苷的飼料（10%BRB）喂養(yǎng)。添加飼料中BRB花色苷濃度相當(dāng)于10%凍干BRB粉中的花色苷含量，這是基于前人研究（32,34）選定的。飼料和BRB花色苷補(bǔ)充飼料的配方組成如表1所示。實(shí)驗(yàn)中的所有飼料使用前儲(chǔ)存于-20 ℃。
在第9周結(jié)束后，小鼠吸入二氧化碳后頸椎脫臼處死。結(jié)腸組織立即冷凍在液氮中，然后儲(chǔ)存在-80℃下準(zhǔn)備進(jìn)行microRNA陣列分析。
表1 飼料和BRB花色苷補(bǔ)充飼料的配方
MicroRNA微陣列表達(dá)譜與數(shù)據(jù)分析
miRNA表達(dá)譜由Agilent Mouse miRNA（8×60K，設(shè)計(jì)ID:070155；Agilent Technologies公司）生成。總RNA用NanoDrop ND-2000（Thermo Scientific）定量。用Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies公司）評(píng)估RNA完整性?？俁NA去磷酸化、變性后，用花青苷-3-胞苷三磷酸標(biāo)記。純化后，標(biāo)記的RNA與微陣列雜交。清洗后，使用Agilent Scanner G2505C（Agilent Technologies公司）對(duì)陣列進(jìn)行掃描。陣列圖像用Feature Extraction軟件（版本10.7.1.1；Agilent Technologies公司）獲取。使用GeneSpring軟件（版本13.1；Agilent Technologies公司）分析原始數(shù)據(jù)。
RNA提取與定量實(shí)時(shí)PCR
總RNA使用Trizol試劑盒（Comwin Biotech有限公司）從細(xì)胞中分離，并使用miRNA cDNA合成試劑盒（ComWin Biotech有限公司）通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生第一鏈互補(bǔ)DNA（cDNA）編碼的帶poly A尾的miRNA。實(shí)時(shí)PCR（RT-PCR）采用SYBR Green方法以特異性引物進(jìn)行。根據(jù)制造商的說(shuō)明，RT-PCR在Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行擴(kuò)增，并用microRNA實(shí)時(shí)分析試劑盒（ComWin Biotech有限公司）進(jìn)行分析。引物序列為：mmu-miR-24-1-5p：正鏈5′-AGTGCCTACTGAGCTGATATCAGT-3′；hsa-miR-24-1-5p：正鏈5′-GTGCCTACTGAGCTGATATCAGT-3′；β-連環(huán)蛋白：正鏈 5′-GCTGGTGACAGGGAAGACAT-3′，反鏈5′-AGGCAAACCGTGAAAAGATG-3′；細(xì)胞周期蛋白D1：正鏈5′-AACTACCTGGACCGCTTCCT-3′，反鏈 5′-CCACTTGAGCTTGTTCACCA-3′；c-Myc：正鏈5′-TTCGGGTAGTGGAAAACCAG-3′，反鏈5′-CAGCAGCTCGAATTTCTTCC-3′；CDK4：正鏈 5′-ATTGGTGTCGGTGCCTATG-3′，反鏈5′-AACTGTGCTGATGGGAAGG-3′。這些基因的表達(dá)水平按照2–ΔΔCT方法以內(nèi)部對(duì)照（U6：正鏈 5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反鏈5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′或β-肌動(dòng)蛋白：正鏈5′-AGGCAAACCGTGAAAAGATG-3′，反鏈 5′-AGGCAAACCGTGAAAAGATG-3′）正?；?。
（譯者注：正鏈（forward strand），與mRNA序列相同的DNA單鏈，另一條則為反鏈（reverse strand）；互補(bǔ)DNA鏈中攜帶編碼蛋白質(zhì)信息的鏈稱(chēng)為正義鏈（sense strand），又稱(chēng)編碼鏈（coding strand），另一條稱(chēng)為反義鏈（antisense strand），又稱(chēng)模板鏈（template strand）。）
質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染
miR-24-1-5p的成熟序列為UGCCUACUGAGCUGAUAUCAGU。人pri miR-24-1-5p序列構(gòu)建使用如下引物：miR-24-1-5p正鏈， 5′-CCGCTCGAGCAACAGGGTTTTCCAAGTCTAC-3′；miR-24-1-5p反鏈，5′-GGAAGATCTTCACCTAAGTCGGAAATCATGTGGTA-3′。PCR產(chǎn)物用XhoI和BglII 這一對(duì)內(nèi)切酶消化，插入到XhoI-BglII切開(kāi)的pcDNA3-血凝素（質(zhì)粒載體）中。然后用lipofectamine 2000（Invitrogen）將HCT-116和Caco-2細(xì)胞與人pri-miR-24-1-5p一起轉(zhuǎn)染。用空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。構(gòu)建的人pri-miR-24-1-5p經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。
（備注：成熟的miRNAs是由較長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過(guò)一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，初級(jí)轉(zhuǎn)錄物稱(chēng)為pri-miRNA。pri-miRNA長(zhǎng)度從幾百到幾千個(gè)堿基不等，帶有5‘帽子和3’poly A尾巴，以及1到數(shù)個(gè)發(fā)夾徑環(huán)結(jié)構(gòu)。pri-miRNA經(jīng)剪切產(chǎn)生約70個(gè)堿基的miRNA前體，即pre-miRNA。pre-miRNA為單一發(fā)夾結(jié)構(gòu)，5‘帶有磷酸基團(tuán)，3’有兩個(gè)突出堿基，并帶有3‘羥基。pre-miRNA經(jīng)進(jìn)一步剪切，形成長(zhǎng)度約為22個(gè)堿基的單鏈成熟miRNA。）
細(xì)胞培養(yǎng)
人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT-116（CCL-247；美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC，American type culture collection））和Caco-2（北京癌癥研究所細(xì)胞庫(kù)）分別在Dulbecco改進(jìn)的Eagle's培養(yǎng)基和α-最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Hyclone，Thermo Fisher Scientific公司）中培養(yǎng)。這兩種培養(yǎng)基中都添加10%（v/v）胎牛血清（大連美倫生物）、10000 U/ml青霉素G、10 mg/ml鏈霉素，在37℃的5% CO2濕潤(rùn)空氣中孵育。
傷口愈合試驗(yàn)
傷口愈合試驗(yàn)采用匯合度為70%的HCT-116和Caco-2細(xì)胞。首先，用無(wú)菌移液管尖端在細(xì)胞單層上劃一條直線。用PBS洗滌細(xì)胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基。然后用miR-24-1-5p轉(zhuǎn)染，24小時(shí)后，丟棄培養(yǎng)基，用顯微照片計(jì)算劃痕中剩余的間隙。
細(xì)胞增殖和群落形成分析
用 3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）法測(cè)定細(xì)胞活力。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，在miR-24-1-5p轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，用0.5 mg/ml MTT試劑培養(yǎng)Caco-2和HCT-116細(xì)胞4小時(shí)。然后去除培養(yǎng)基，在每個(gè)孔中加入100μl二甲亞砜，以溶解甲贊晶體。在490nm處測(cè)量板的吸光度。為了進(jìn)一步研究miR-24-1-5p在癌細(xì)胞存活中的作用，將細(xì)胞以200/孔接種在六孔板中，培養(yǎng)2周進(jìn)行菌落形成分析。出現(xiàn)的細(xì)胞群落首先用PBS洗滌，然后用甲醇固定，再用0.5%的吉姆薩染液（Giemsa，天青-伊紅）染色。用倒置顯微鏡計(jì)數(shù)每孔中出現(xiàn)的群落數(shù)。
Transwell遷移分析
將Caco-2和HCT-116細(xì)胞接種在Transwell孔的上室，在下室中加入無(wú)血清培養(yǎng)基。24小時(shí)后，用棉簽去除膜頂部的細(xì)胞，然后用4%多聚甲醛固定Transwell孔插入膜。遷移到膜底的細(xì)胞用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司）染色。從每個(gè)插入膜中隨機(jī)選擇10個(gè)域，在20倍放大的顯微鏡下進(jìn)行捕獲。使用Image Pro Plus 6.0對(duì)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行量化。為了計(jì)算遷移指數(shù)，將每個(gè)處理組捕獲的細(xì)胞數(shù)歸一化為對(duì)照組細(xì)胞數(shù)。
microRNA的靶向預(yù)測(cè)
利用Miranda 3.3a版的算法和網(wǎng)站工具（http://www.microrna.org/microrna/home.do）對(duì)miR-24-1-5p的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并給出了默認(rèn)參數(shù)和截止值（評(píng)分S≥140，能量E≤-7.0）。
蛋白質(zhì)印跡
細(xì)胞在含1 mmol/L苯甲磺酰氟（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司）的冷凍放射免疫沉淀分析緩沖液中置于冰上30分鐘。在4℃下14000 g離心15 分鐘，收集上清液，用10%凝膠SDS－PAGE法測(cè)定含有40μg蛋白的上清液。電泳后，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（(Sangon Biotech有限公司）上，用5%牛血清白蛋白V（Roche）在Tris緩沖鹽水和吐溫20緩沖液中封閉2小時(shí)，然后在室溫下與合適的一級(jí)抗體孵育3小時(shí)，然后上相應(yīng)的二級(jí)抗體。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光技術(shù)（Amersham Life Science）檢測(cè)印跡上的信號(hào)。
免疫組織化學(xué)染色
收集AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠腸道組織，無(wú)論是否含有BRB花色苷，固定在10%的福爾馬林緩沖液中，并如前所述嵌入石蠟中（35）。組織切片（4μm厚）用抗E-鈣粘蛋白抗體（Santa Cruz生物技術(shù)）進(jìn)行免疫組化染色。流程與先前報(bào)道類(lèi)似（35）。簡(jiǎn)言之，切片脫蠟、復(fù)水，3% H2O2淬滅，10%的正常血清封閉，然后用β-連環(huán)蛋白抗體在4℃孵育過(guò)夜，接著用二級(jí)抗體和親和素-生物素復(fù)合物（ABC試劑盒；Vector Laboratory）孵育。用3’,5’-二氨基聯(lián)苯胺進(jìn)行染色，再用蘇木精進(jìn)行輕微復(fù)染。彩色載玻片的圖像由Aperio Image系統(tǒng)采集。
統(tǒng)計(jì)方法
采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。為了比較組內(nèi)和組間的差異，采用t檢驗(yàn)和方差分析，然后進(jìn)行Fisher最小顯著性差異分析。在P<0.05水平上考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)論
組織microRNA微陣列分析
為了闡明miRNA介導(dǎo)的結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生通路，識(shí)別異常表達(dá)的miRNA是第一步。基于這一點(diǎn)，我們進(jìn)行了組織miRNA微陣列分析，以獲得AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠（無(wú)論是否補(bǔ)充BRB花色苷）結(jié)腸組織中總miRNA表達(dá)特征。兩組結(jié)果的比較表明，通過(guò)給予BRB花色苷，數(shù)個(gè)miRNA的調(diào)節(jié)有差異（圖1（a））。組織陣列的層次聚類(lèi)分析結(jié)果如圖1（b）所示。AOM/DSS誘導(dǎo)組表達(dá)低水平的miR-24-1-5p，但用BRB花色苷喂養(yǎng)9周后，miR-24-1-5p水平顯著上調(diào)，提示miR-24-1-5p可能對(duì)腫瘤形成有抑制作用。這也證實(shí)了BRB花色苷的化學(xué)預(yù)防功能。
miR-24-1-5p在偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織中表達(dá)下調(diào)，在用黑樹(shù)莓花色苷處理的人結(jié)直腸癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)
為了進(jìn)一步評(píng)估小鼠模型微陣列分析結(jié)果，采用定量RT-PCR（qRT-PCR）分析了有與無(wú)BRB花色苷給藥的AOM/DSS誘導(dǎo)組結(jié)腸組織中的miR-24-1-5p表達(dá)。qRT-PCR獲得的miR-24-1-5p的表達(dá)模式與微陣列數(shù)據(jù)一致（圖2（a））。在用不同劑量的BRB花色苷處理后，測(cè)定了幾種人結(jié)直腸癌細(xì)胞系（Caco-2、HCT-116、Lovo、HT29和SW480）中miR-24-1-5p的表達(dá)。BRB花色苷導(dǎo)致miR-24-1-5p水平升高。在BRB花色苷處理的人類(lèi)腫瘤細(xì)胞中，miR-24-1-5p的表達(dá)模式與用BRB花色苷補(bǔ)充飲食喂養(yǎng)的小鼠結(jié)腸組織獲得的miRNA微陣列和qRT-PCR數(shù)據(jù)一致（圖2（b））。
，對(duì)照；，AOM+DSS模型；，AOM+DSS+BRB花色苷。（b），對(duì)照；25μg/ml BRB花色苷；，50μg/ml BRB花色苷。黑樹(shù)莓花色苷可降低偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠的β-連環(huán)蛋白含量。
為了研究β-連環(huán)蛋白在BRB花色苷原位調(diào)節(jié)的AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠中的作用，我們進(jìn)行了免疫組化染色。與不給予BRB花色苷飲食的AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠相比，給予BRB花色苷飲食的AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠小腸的β-連環(huán)蛋白水平顯著降低（圖3）。
，對(duì)照組；，AOM+DSS模型；，AOM+DSS+BRB花色苷。恢復(fù)miR-24-1-5p表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖和遷移的影響
為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)miR-24-1-5p的生物學(xué)功能，用miR-24-1-5p轉(zhuǎn)染人HCT-116和Caco-2細(xì)胞，MTT法測(cè)定細(xì)胞的活力。與相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞（圖4（a）和（b））相比，miR-24-1-5p-轉(zhuǎn)染的HCT-116和Caco-2細(xì)胞均表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞活力降低（HCT-116為56%，Caco-2為52%）。這些細(xì)胞也表現(xiàn)出顯著的硬化減少，如傷口愈合試驗(yàn)所示（圖4（c）和（d））。此外，它們表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞遷移和細(xì)胞存活率降低，分別由Transwell分析（圖4（e）和（f））和菌落形成分析（圖4（g）和（h））顯示。綜上所述，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-24-1-5p可顯著降低這些人結(jié)直腸癌細(xì)胞株的增殖、遷移和存活，從而表明miR-24-1-5p可能通過(guò)減少或抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)而在結(jié)直腸癌中起到腫瘤抑制作用。
，空白載體；，miR-24-1-5p。（e，f）細(xì)胞侵襲用顯微鏡檢查。（g，h）細(xì)胞群落形成的典型顯微照片和定量分析。采用單因素方差分析比較組內(nèi)和組間的差異，然后進(jìn)行Fisher最小顯著性差異分析。值是平均值（n=3），其標(biāo)準(zhǔn)誤差由豎線表示。與空白載體對(duì)照組相比，平均值有顯著性差異：**P<0.01，***P<0.001。miR-24-1-5p調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白
利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了miR-24-1-5p可能結(jié)合的靶基因，采用Miranda 3.3a版默認(rèn)參數(shù)和截止值（評(píng)分S≥140，能量E≤-7.0）。考慮到β-連環(huán)蛋白在CRC發(fā)展中的重要作用，選擇β-連環(huán)蛋白作為可能的靶點(diǎn)。在β-連環(huán)蛋白的3′-UTR處檢測(cè)到一個(gè)結(jié)合域，它可能與miR-24-1-5p相互作用（圖5（a））。此外，為了研究miR-24-1-5p對(duì)β-連環(huán)蛋白表達(dá)的影響，過(guò)表達(dá)人HCT-116和Caco-2細(xì)胞中的miR-24-1-5p，用qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)β-連環(huán)蛋白水平的變化。在這兩個(gè)細(xì)胞系中，當(dāng)miR-24-1-5p過(guò)度表達(dá)時(shí)，β-連環(huán)蛋白的蛋白水平顯著降低，而其mRNA水平保持不變（圖5（b）和（c））。
進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)用miR-24-1-5p或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染HCT-116和Caco-2細(xì)胞24小時(shí)，在細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析前，將放線菌酮（10μM）在不同時(shí)間間隔加入細(xì)胞，測(cè)定β-連環(huán)蛋白的蛋白質(zhì)合成率。結(jié)果表明，與對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，miR-24-1-5p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白的蛋白水平明顯降低，提示miR-24-1-5p能促進(jìn)β-連環(huán)蛋白的降解，影響其穩(wěn)定性。結(jié)果還提示，miR-24-1-5p可能通過(guò)直接結(jié)合β-連環(huán)蛋白的3′-UTR來(lái)負(fù)向調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白。
，空白載體；，miR-24-1-5p。HA，血凝素。與Wnt/β-連環(huán)蛋白通路相關(guān)的基因由miR-24-1-5p調(diào)控
還研究了miR-24-1-5p過(guò)度表達(dá)對(duì)β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路下游幾個(gè)靶基因的影響。用蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR檢測(cè)HCT-116和Caco-2細(xì)胞周期蛋白D1、c-Myc和CDK4表達(dá)水平的變化。HCT-116和Caco-2細(xì)胞中這些基因的mRNA和蛋白質(zhì)水平在被miR-24-1-5p轉(zhuǎn)染后24小時(shí)均下降（圖6（a）和（b））。此外，還分析了與Wnt/β-連環(huán)蛋白通路相關(guān)的其他基因，如SFRP2、SFRP5、E-鈣粘蛋白、GSK3-β、P-GSK3-β和Bcl-2。E-鈣粘蛋白、p-GSK3-β和SFRP5的表達(dá)上調(diào)，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，GSK3-β和SFRP2的表達(dá)無(wú)顯著變化（圖6（c））?？傊瑏?lái)自體外人類(lèi)癌細(xì)胞的數(shù)據(jù)表明β-連環(huán)蛋白可能是miR-24-1-5p的直接靶點(diǎn)，miR-24-1-5p的調(diào)節(jié)作用通過(guò)影響β-連環(huán)蛋白下游靶基因表達(dá)來(lái)發(fā)揮。
，空白載體；，miR-24-1-5p。討論
積累的證據(jù)表明，細(xì)胞中嚴(yán)格調(diào)控的RNA網(wǎng)絡(luò)可能被異常表達(dá)的miRNA破壞，從而引發(fā)癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。miRNA在各種人類(lèi)癌癥中的重要性表明，調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)可能是癌癥化學(xué)預(yù)防和治療的新策略（36）。在本研究中，食用含有BRB花色苷飲食的AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠中，miR-24-1-5p顯著上調(diào)。此外，機(jī)制研究表明，miR-24-1-5p可能起到腫瘤抑制作用，該作用由其在人類(lèi)CRC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)抑制細(xì)胞增殖、遷移、存活以及群落形成的能力產(chǎn)生（圖3）。miR-24-1-5p的腫瘤抑制作用似乎是由對(duì)β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的影響所介導(dǎo)（圖4和5）。
Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路在癌癥中的作用已通過(guò)該信號(hào)通路對(duì)CRC細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、血管生成、遷移和轉(zhuǎn)移的影響得到證實(shí)（37）。β-連環(huán)蛋白及其下游靶基因（包括c-Myc、細(xì)胞周期蛋白D1和CDK4）的異常激活可加速CRC的發(fā)生和發(fā)展。我們的結(jié)果清楚地表明，在人類(lèi)結(jié)直腸癌細(xì)胞中，這些基因可以通過(guò)改變miR-24-1-5p的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)。實(shí)際上，在HCT-116和Caco-2細(xì)胞中miR-24-1-5p的過(guò)表達(dá)下調(diào)了β-連環(huán)蛋白、c-Myc、細(xì)胞周期蛋白D1和CDK4的表達(dá)（圖6）。闡明經(jīng)β-連環(huán)蛋白介導(dǎo)的miR-24-1-5p調(diào)控的腫瘤通路和靶點(diǎn)，將為人類(lèi)結(jié)直腸癌的發(fā)生過(guò)程提供新的認(rèn)識(shí)。不幸的是，由于倫理問(wèn)題，我們無(wú)法從人類(lèi)受試者那里獲得直接證據(jù)來(lái)支持我們的主張。然而，有必要進(jìn)一步研究確定在CRC中靶向miR-24-1-5p的可行性，將其作為臨床水平對(duì)抗CRC的一種經(jīng)濟(jì)有效且簡(jiǎn)單的治療策略。BRB花色苷作為一種CRC的化學(xué)預(yù)防劑已被多次研究。該方向在動(dòng)物模型和臨床病人中得到了廣泛研究。BRB花色苷的化學(xué)預(yù)防作用機(jī)制包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和分化，減少細(xì)胞增殖、炎癥、血管生成和侵襲性（38）。BRB花色苷對(duì)結(jié)直腸癌的化學(xué)預(yù)防作用似乎也涉及腸道微生物群的改變和DNA去甲基化（39）。在本研究中，我們首次證明了BRB花色苷對(duì)CRC的化學(xué)預(yù)防作用也可能涉及到對(duì)miR-24-1-5p的上調(diào)，且我們通過(guò)小鼠模型證明了這一點(diǎn)。
總之，miR-24-1-5p可能作為腫瘤抑制因子，通過(guò)下調(diào)β-連環(huán)蛋白及其下游靶基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)。這可能是BRB花色苷顯示其對(duì)CRC的化學(xué)預(yù)防作用的機(jī)制的一部分。因此，miR-24-1-5p可被認(rèn)為是未來(lái)預(yù)防或治療結(jié)直腸癌的潛在藥物。
本文由福山生物整理翻譯，轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明出處。
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