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黑樹莓在癌癥預(yù)防中的潛力
發(fā)表于：2019-02-20 作者：admin 來源：本站 點(diǎn)擊量：18514
黑樹莓是一種源自北美的結(jié)黑色果子的樹莓。隨著研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)黑樹莓富含花色苷和鞣花酸，并且這兩種物質(zhì)對健康都有著重要意義，黑樹莓也因此越來越受到歡迎，人們對黑樹莓的需求也不斷增加。黑樹莓的熱門研究方向包括其化學(xué)成分、藥理活性及其在細(xì)胞和分子水平的作用機(jī)制之間的相互作用，并且絕大多數(shù)的研究都集中在化學(xué)預(yù)防和抗癌作用上。本綜述總結(jié)了多年來黑樹莓的化學(xué)成分和抗癌活性的相關(guān)數(shù)據(jù)。
黑樹莓原產(chǎn)東部北美，白皮糙莓生長在北美的西部，因?yàn)樗念伾际呛谏跇漭c白皮糙莓還被叫過同一個名字——黑樹莓。黑樹莓的原產(chǎn)地還包括歐洲的一些國家，如捷克共和國、斯洛伐克、俄羅斯和波蘭。
插田泡，也被稱為韓國黑樹莓，是一種用于制作韓國黑樹莓酒的灌木，原產(chǎn)東亞。目前基于果肉中花色苷成分的含量及DNA的分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)栽培的韓國的插田泡實(shí)際上就是黑樹莓。
直到19世紀(jì)，黑樹莓才被馴化，而自那之后，黑樹莓的商業(yè)生產(chǎn)卻一直在減少。這主要是因?yàn)闆]有可以抗病的黑樹莓品種，而且相對來說大眾也都更喜歡紅樹莓。盡管如此，近年來，黑樹莓的需求也一直在增長，這很大程度上是因?yàn)樵S多研究發(fā)現(xiàn)黑樹莓富含花色苷，并且具有潛在的健康益處。一些在美國市場上流行的黑樹莓品種包括Munger, Bristol, Jewel, MacBlack和Haut。波蘭的一種黑樹莓品種Litacz，也是Bristol通過自然授粉而進(jìn)化的。
雖然有關(guān)紅樹莓的研究很多，但主要都是抗炎及抑菌活性的測定，黑樹莓的相關(guān)研究則更多集中在其體內(nèi)外或體外模型中的抗癌作用。本綜述總結(jié)了黑樹莓這些年來在化學(xué)預(yù)防和抗癌活性上的相關(guān)研究。
據(jù)報道，黑樹莓中花色苷含量是紅樹莓（Rubus idaeus）的5倍多，并且與其他懸鉤子屬種如黑莓、marionberries和波森莓相比，其花色苷含量最高。
黑樹莓中的花色苷主要是矢車菊素-3-O-蕓香糖苷和矢車菊素-3-O-木糖基蕓香糖苷，約占黑樹莓果肉中的80％。矢車菊素-3-接骨木二糖苷和天竺葵素-3-O-蕓香糖苷的含量則較少，分別都是花色苷總量的1％至5％。此外，黑樹莓中還有其他的花色苷，包括矢車菊素、天竺葵素苷以及芍藥苷（表1，見22頁）。不同黑樹莓品種的總花色苷含量可能也會有差異，根據(jù)報道，干的Jewel品種黑樹莓中的花色苷含量為1770mg~100g/100g不等，而干的Litacz品種黑樹莓中的花色苷含量高達(dá)5512mg/100g。
對黑樹莓品種Munger, Bristol, Jewel, MacBlack和Haut的總花色苷含量進(jìn)行了測定，并與幾種雜交黑樹莓品種進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)直接栽種黑樹莓的總花色苷含量處于一個平均范圍，且和嫁接或扦插等繁殖方式所培育的黑樹莓中的總花色苷含量差異很大。據(jù)報道，黑樹莓種群中高花色苷和低花色苷含量相差約兩倍（244.8-541.3mg/100ml果汁），其中，主要兩種花色苷的水平也有顯著性差異。
雖然關(guān)于黑樹莓中鞣花酸成分的具體數(shù)據(jù)非常有限，但鞣花酸確實(shí)是是薔薇科的一大特色組分。據(jù)報道，紅樹莓中的鞣花酸含量可高達(dá)總酚含量的85％，而花色苷含量則僅約為12％。通過比較發(fā)現(xiàn)，黑樹莓中花色苷的濃度比鞣花酸高了四倍，當(dāng)然，這并不是因?yàn)轺坊ㄋ岷康停且驗(yàn)楹跇漭谢ㄉ蘸枯^高。于在波蘭生長的不同品種的紅樹莓和黑樹莓中地榆素H-6含量研究結(jié)果一致，研究發(fā)現(xiàn)，黑樹莓中的地榆素H-6含量為1482.5mg/100g干重，這與其他水果提取物的含量很相似，而紅樹莓中的鞣花酸濃度則要高出3-4倍（5045.2mg/100g干重）。
黑樹莓中的次級代謝物已被確定屬于多酚和簡單酚的其他類，雖然它們的含量明顯比鞣花酸和花色苷都更低，并且包含了好幾種酚類（如表1所示），包括黃烷-3-醇和黃酮醇（主要是槲皮素糖苷）、楊梅黃酮和山奈酚。不同品種的黑樹莓和紅樹莓提取物中的游離鞣花酸的濃度都比較低，為24~50mg/100g干重。
在最近的一項(xiàng)研究中，如表1所示，從黑樹莓中把芪類葡萄糖苷：反式白藜蘆醇苷和二氫查耳酮：根皮苷分離出來了。黑樹莓具有營養(yǎng)價值的其他成分包括維生素C、E，以及高濃度的鈣（Ca）、鉀（K）、銅（Cu）和鐵（Fe）。
雖然急性、短期的炎癥通常對機(jī)體有益，也是正常免疫應(yīng)答的一部分，但持續(xù)的炎癥/氧化環(huán)境會損傷健康細(xì)胞，長時間下去可能會對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能造成重大的危害，包括DNA損傷，腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成，從而促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。ROS產(chǎn)生及清除的平衡是由各種DNA修復(fù)酶以及抗氧化劑維持的，但內(nèi)源性和外源性抗氧化劑被認(rèn)為能更有效地保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。
眾所周知，花色苷具有抗氧化作用，所以已經(jīng)有很多篇報道概述了黑樹莓抗氧化能力的相關(guān)研究，并且有的研究還把黑樹莓與氧化損傷、腫瘤發(fā)生以及幾種化學(xué)預(yù)防聯(lián)系起來。
通過測定黑樹莓品種Jewel以及不同品種的無刺黑莓（Rubus sp.）、紅樹莓（Rubus idaeus L.）和草莓（Fragaria x ananassa D.）的總抗氧化活性（氧自由基吸收容量），發(fā)現(xiàn)，與其他漿果相比，黑樹莓不同成熟過程中的平均氧自由基吸收容量最高。這與其他研究的結(jié)果一致，即與其他種屬的水果如越桔屬、懸鉤子屬、虎耳草科酷栗屬相比，黑樹莓的抗氧化性最高。
在研究清除不同類型的ROS時發(fā)現(xiàn)，黑樹莓是O2•-、H2O2以及OH的最佳抗氧化劑，其清除’O2的能力排名第二。在氧化應(yīng)激條件下，ROS可以導(dǎo)致致癌突變的積累。OH• 導(dǎo)致DNA損傷的產(chǎn)物包括8-羥基鳥苷及其水解產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG），其中，8-OHdG被廣泛用作DNA氧化損傷標(biāo)志物。在MTT分析中發(fā)現(xiàn)，在H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激下，黑樹莓乙醇提取物可以促進(jìn)Caco-2細(xì)胞系的細(xì)胞活力。
經(jīng)研究確定，黑樹莓中主要的酚類抗氧化劑是矢車菊素-3-O-蕓香糖苷和矢車菊素-3-O-木糖基蕓香糖苷。此外，黑樹莓種子提取物中的鞣花酸被發(fā)現(xiàn)具有很強(qiáng)的抗氧化特性，且其含量是葡萄籽中鞣花酸的2倍不止。
黑樹莓的強(qiáng)抗氧化特性通常與其在癌癥等慢性病中的預(yù)防作用有關(guān)。
黑樹莓乙醇提取物可抑制人類CD4+和CD8+ T淋巴細(xì)胞的增殖和活力。它也可以調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子IL-6和IL-2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子STAT3和STAT5的磷酸化和轉(zhuǎn)錄激活。有趣的是，它們還會限制MDSC（髓源性抑制細(xì)胞）的擴(kuò)增，抑制T淋巴細(xì)胞的激活。雖然這似乎與抑制T淋巴細(xì)胞的作用相反，但對抑制腫瘤作用也可以起到有益的作用，如在腫瘤微環(huán)境中，MDSCs可直接通過分泌促進(jìn)腫瘤生長的因子來促進(jìn)血管生成及淋巴管生成。黑樹莓提取物不但可以通過抑制MDSCs導(dǎo)致的腫瘤血管生成，還被發(fā)現(xiàn)可以通過其他抗血管生成的機(jī)制來抑制血管生成，即從源頭上抑制血管生成以及抑制血管原的血管生長，血管生長是通過基于組織的體外纖維蛋白凝膠進(jìn)行測定的。
研究表明，黑樹莓提取物具有化學(xué)預(yù)防作用，能夠抑制BPDE誘導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NFκB、NFAT（活化T細(xì)胞的核因子）以及抑制相關(guān)基因如VEGF（血管內(nèi)皮生長因子）、COX-2（環(huán)氧合酶2）和TNF-α（腫瘤壞死因子）的表達(dá)。已有許多種相關(guān)的假設(shè)機(jī)制來解釋上述黑樹莓的化學(xué)預(yù)防作用。一種是通過阻止MAPKs（絲裂原活化蛋白激酶）和IκBa（NFκB的抑制蛋白，一般以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中）的磷酸化及抑制AP-1和NFκB的活化受損，從而下調(diào)VEGF和COX-2。其他數(shù)據(jù)表明PI-3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制，可能與抑制AP-1和NFκB的活化受損有關(guān)。奇怪的是，依賴于AP-1的iNOS的表達(dá)卻沒有被抑制。這些結(jié)果意味著黑樹莓成分具有靶向作用于不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的潛力，從而發(fā)揮對上皮癌的化學(xué)預(yù)防作用。在后續(xù)研究中，發(fā)現(xiàn)抑制由BPDE誘導(dǎo)的NFκB活化作用的主要成分是矢車菊素-3-O-葡糖苷、-3-O-蕓香糖苷和-3-O-木糖基蕓香糖苷。
在一項(xiàng)SKH-1無毛小鼠的體內(nèi)研究中，局部使用黑樹莓提取物可顯著減少皮膚炎癥及其癌變。在短期模型中，將小鼠暴露于一定劑量的UV-B輻射下，小鼠出現(xiàn)了小范圍的紅斑，局部分別用黑樹莓提取物或賦形劑處理。處理48小時后，用500μg黑樹莓提取物處理的小鼠的炎癥反應(yīng)顯著減少，包括皮膚水腫、中性粒細(xì)胞活化、p53的蛋白質(zhì)表達(dá)水平和DNA損傷標(biāo)志物都顯著減少。在長期模型中，將小鼠暴露于相同劑量輻射，每周三次，持續(xù)25周，同時局部用黑樹莓提取物及賦形劑處理，發(fā)現(xiàn)與用賦形劑處理的小鼠（每只小鼠平均有30個腫瘤，腫瘤的平均大小為30.2 mm2）相比，用黑樹莓提取物處理的小鼠的腫瘤數(shù)及腫瘤大?。恐恍∈笃骄?7個腫瘤，腫瘤的平均大小為10.1 mm2）均有減少。這與腫瘤組織浸潤的CD4+和CD3+ foxp3+T細(xì)胞的水平顯著降低有關(guān)，而腫瘤組織浸潤的CD4+和CD3+ foxp3+T細(xì)胞的水平會促進(jìn)UV-B誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)展。
在人體MCF-7乳腺癌細(xì)胞系的體外研究中，發(fā)現(xiàn)黑樹莓提取物有可能使癌細(xì)胞對輻射損傷更加敏感。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因應(yīng)該是對NFκB的抑制作用，NFκB是癌細(xì)胞的一種輻射防護(hù)劑。
在另一項(xiàng)口腔鱗狀細(xì)胞癌（SCC）的研究中，發(fā)現(xiàn)黑樹莓乙醇提取物有抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制VEGF產(chǎn)生及NOS活性的作用。
為研究黑樹莓抑制口腔腫瘤的作用，采用7,12-二甲基苯基蒽誘導(dǎo)的致癌作用模型在倉鼠頰囊進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。與對照組相比，喂食中有5％黑樹莓粉末的倉鼠頰囊的腫瘤數(shù)量顯著減少，然而，喂食10％黑樹莓粉末抑制腫瘤生長的作用則不如5％的那么好。
在抗癌研究中，給實(shí)驗(yàn)大鼠分別喂食5％和10％的凍干黑樹莓粉，發(fā)現(xiàn)凍干黑樹莓粉可顯著減少病灶形成、腫瘤發(fā)病率及多樣性，從而證明黑樹莓可以抑制癌癥的發(fā)生及發(fā)展。有趣的是，5％劑量的黑樹莓粉似乎比10％的更有效。其抑制病變的作用與在食管中減少NMBA誘導(dǎo)的前致癌物O6-甲基鳥嘌呤加合物中的影響有關(guān)，這說明黑樹莓可影響NMBA的代謝，從而防止DNA的損傷。
后啟動研究表明，黑樹莓除了可以減少NMBA處理的大鼠中腫瘤病灶、數(shù)量及大小，還可把一些食管癌和食道乳頭狀瘤中異常表達(dá)的基因調(diào)節(jié)在正常水平。如表2（見22頁）所示，與草莓的凍干提取物相比，黑樹莓抑制NMBA誘導(dǎo)的DNA加合物形成更有效，同時還可減少腫瘤的發(fā)生率和多樣性。從補(bǔ)充大鼠中獲得了抑制食管組織培養(yǎng)及微粒體NMBA的有效成分，并被鑒定為矢車菊素-3-O-蕓香糖苷、鞣花酸和矢車菊素-3-O-葡糖苷。
在另一項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)黑樹莓提取物包括富含花色苷部分和有機(jī)不溶部分（預(yù)估含有大量單寧）可抑制癌以及癌前病變中的細(xì)胞增殖、炎癥、血管生成，這表明了黑樹莓抑制不同類型的癌癥的作用機(jī)制是相似的。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，含有凍干黑樹莓、黑樹莓的花色苷及原兒茶酸（主要花色苷代謝產(chǎn)物）的飲食均可同等有效地抑制NMBA誘導(dǎo)的食管腫瘤，然而在35周以后的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，還是凍干黑樹莓粉的效果會略微更好一些。
然而，在一項(xiàng)黑樹莓、草莓和藍(lán)莓即不同含量的單寧對大鼠食管癌影響的研究中發(fā)現(xiàn)，漿果部分組防止NMBA誘導(dǎo)ESCC的作用并沒有顯著性差異。這表明黑樹莓中的單寧可能并沒有化學(xué)預(yù)防作用。
對食管鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤進(jìn)展的分子機(jī)制研究顯示，飲食中加入5％黑樹莓粉末可下調(diào)食管癌癌前病變中COX-2、iNOS、PGE2和c-Jun（AP-1蛋白家族成員）的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。黑樹莓提取物也被證明具有抗血管生成特性，可顯著抑制食管癌癌前病變中VEGF的表達(dá)，還可減少微血管密度（MVD），這都與抑制COX-2和iNOS有關(guān)。
此外，黑樹莓粉還能通過降低促炎生物標(biāo)志物COX-2、iNOS、p-NF-κB，可溶性環(huán)氧化物水解酶和細(xì)胞因子正五聚蛋白-3的活性抑制食管內(nèi)皮炎癥，上述的生物標(biāo)志物是由IL-1b和TNF-α介導(dǎo)的。
此外，研究還發(fā)現(xiàn)黑樹莓中的花色苷能抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性及表達(dá)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶對一些人體特定腫瘤包括HTC-116中的DNMT1、DNMT3B以及結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞系中的Caco-2、SW480的異常甲基化具有重要意義。這些結(jié)果表明黑樹莓中的花色苷對全黑樹莓在結(jié)直腸癌中的去甲基化作用是極具意義的。
潰瘍性結(jié)腸炎是一種可顯著增加結(jié)直腸癌風(fēng)險的慢性潰瘍性結(jié)腸炎（UC），科學(xué)家們采用
3％葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的小鼠模型評價凍干黑樹莓的化學(xué)預(yù)防效果。研究發(fā)現(xiàn)，飲食中豐富的黑樹莓粉末可顯著減少DSS引起的損傷包括結(jié)腸縮短及潰瘍，然而，這并沒有影響到氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物（血漿NO和結(jié)腸丙二醛）的水平以及和結(jié)腸DSS損傷有關(guān)的炎性細(xì)胞浸潤。另一方面，7天的黑樹莓粉治療可抑制結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1b、COX-2及IκB-α的磷酸化（IκB-α磷酸化后隨即降解，隨之而來的就是NFκB核因子的激活）。奇怪的是，這項(xiàng)研究的結(jié)果表明黑樹莓的保護(hù)機(jī)制更多與其抗炎特性而不是抗氧化活性相關(guān)。
還有一些其他的大腸癌動物模型運(yùn)用于評價黑樹莓在體內(nèi)的功效?；瘜W(xué)致癌物氧化偶氮甲烷
（AOM）能夠誘發(fā)大鼠結(jié)直腸癌的發(fā)生，該動物模型被廣泛用于一些化學(xué)預(yù)防劑預(yù)防結(jié)腸癌的作用評價。喂食含有2.5％、5％、10％的凍干黑樹莓粉末的大鼠腫瘤多樣性分別降低42％、45％和71％，同時可顯著減少暴露于AOM的大鼠的DNA氧化損傷，降低尿中的DNA氧化損傷生物標(biāo)志物8-OH-Dg的表達(dá)。
兩種基因缺陷小鼠模型APC1638+/-及Muc-/-，可分別自發(fā)發(fā)展成結(jié)直腸癌及結(jié)腸炎，可用于評
價黑樹莓對結(jié)腸癌發(fā)展的影響及其潛在機(jī)制。在兩種模型中，喂飼黑樹莓12個星期可顯著抑制結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生。APC1638+/-小鼠腫瘤發(fā)生率減少45%，單只腫瘤數(shù)量減少60%；Muc-/-小鼠的發(fā)生率和單只腫瘤數(shù)量則都是減少50%。機(jī)理研究結(jié)果表明，黑樹莓可通過抑制β-catenin信號通路（其過度表達(dá)與多種類型的癌癥相關(guān)）抑制APC1638+/-小鼠腫瘤發(fā)展，抑制Muc-/-小鼠腫瘤發(fā)展則是通過減少慢性炎癥。
一項(xiàng)研究為了確定黑樹莓對口腔癌的發(fā)展具有是否保護(hù)作用，將含有凍干黑樹莓的粘膜粘附凝膠局部施用于人類口腔粘膜。上皮內(nèi)瘤樣病變患者易患口腔鱗狀細(xì)胞癌，每日給皮內(nèi)瘤樣病變患者施用黑樹莓凝膠4次，為期6周。6周后，在施用黑樹莓凝膠的患者中觀察到病變組織的退化，在3個腫瘤抑制基因位點(diǎn)：UK4A/ARF、p53和FHIT中觀察到雜合性缺失率在統(tǒng)計學(xué)上顯著降低。此外，還發(fā)現(xiàn)用黑樹莓凝膠治療后可顯著降低病變上皮中COX-2的水平。在研究過程中，一部分患者對黑樹莓凝膠的響應(yīng)很好。病灶上的蛋白質(zhì)譜顯示，這些高度響應(yīng)的患者體內(nèi)的黑樹莓代謝和角質(zhì)形成細(xì)胞分化所需的酶的預(yù)處理水平更高，這表明在黑樹莓治療中，自己體內(nèi)的酶活力也是很重要的。
接下來要介紹的這個課題是對口腔內(nèi)花色苷代謝及其對黑樹莓化學(xué)預(yù)防功效潛在影響的后續(xù)研究。每天給患者局部施用10%黑樹莓，通過患者的漱口液來評估口腔組織、唾液和口腔菌群中花色苷的代謝水平。通過大量的藥代動力學(xué)分析和功能活性測定，證明黑樹莓中的花色苷在唾液中可持續(xù)性存在，并且漂洗黑樹莓外用凝膠時，口腔中的花色苷水平更高，還發(fā)現(xiàn)原兒茶酸（穩(wěn)定的花色苷降解產(chǎn)物）及原兒茶酸葡萄糖苷、葡糖醛酸化的花色苷綴合物（被認(rèn)為是生物活性花色苷代謝物）在唾液中也可持續(xù)存在。這種腸溶性花色苷的循環(huán)過程，很大程度上是被口腔的β-葡萄糖苷酶催化發(fā)生的，并且患者間的個性化也可能影響局部施用黑樹莓化學(xué)療法的效果。
一項(xiàng)研究對結(jié)直腸癌及結(jié)直腸息肉患者進(jìn)行了黑樹莓的干預(yù)試驗(yàn)，患者均是在預(yù)定手術(shù)的前2-4周接受了每天60g干黑樹莓粉的治療。比較治療前后腫瘤/息肉組織的活檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑樹莓粉對結(jié)直腸癌的兩種預(yù)后生物標(biāo)志物有影響：Ki-67和CD105。在活檢標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)，Ki-67蛋白（與細(xì)胞增殖相關(guān)）和CD105（這是TGF-β受體復(fù)合物的一部分，并在血管生成中具有關(guān)鍵作用）的水平在黑樹莓治療后均顯著降低。并且，用TUNEL法檢測DNA片段化結(jié)果顯示，用黑樹莓治療后的腫瘤細(xì)胞凋亡率升高。
在一項(xiàng)為期9個月的針對家族性腺瘤性息肉病高?；颊咴囼?yàn)中，14名患者每天采用兩種不同的黑樹莓粉治療方式，一種是口服黑樹莓粉+BRB直腸栓劑的形式，另一種則是口服安慰劑+BRB直腸栓劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對黑樹莓治療有響應(yīng)的患者息肉負(fù)荷顯著下降，但息肉數(shù)量并沒有下降，同時這些患者還有其他變化：細(xì)胞增殖率下降，DNMT1表達(dá)減少，CDKN2A的甲基化下降。其中，CDKN2A是抑癌基因p16的啟動子基因。有3例患者對黑樹莓的治療無反應(yīng)，他們的腺瘤數(shù)目或分子標(biāo)志物水平基本沒有變化。
在另一項(xiàng)關(guān)于結(jié)直腸癌的研究中，患者每天接受60g黑樹莓粉，為期9周，并抽血檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和血管生成的相關(guān)標(biāo)志物的變化。結(jié)果表明，漿果治療對腺癌及鄰近未分化組織的增殖（Ki67）、凋亡（TUNEL）、血管生成（CD105）都具有積極的作用。同時，患者接受漿果治療10天后，血漿中粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）濃度顯著升高，IL-8濃度顯著降低，其他血漿細(xì)胞因子則無明顯變化。由于IL-8的高水平表達(dá)是腫瘤發(fā)展的一個強(qiáng)有力的預(yù)測因子，因此作者提出IL-8和GM-CSF的變化可以作為結(jié)直腸癌患者消費(fèi)黑樹莓治療反應(yīng)的預(yù)測指標(biāo)。
一項(xiàng)在巴雷特食管的癌前病變患者中進(jìn)行的研究顯示，盡管尿液中檢測的氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物的水平顯著降低，但巴雷特食管病灶的病變長度并沒有顯著改變。作者認(rèn)為，這可能是當(dāng)黑樹莓粉混合水后以懸浮液形式施用時，因?yàn)橥ㄟ^食管速度太快，還不足以讓局部充分吸收活性化合物進(jìn)入病灶。
黑樹莓通過影響致癌物質(zhì)代謝、降低癌前細(xì)胞的生長速度、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、減少組織炎癥和抑制血管生成等機(jī)制對多種類型腫瘤均有一定的抑制作用。動物和體外研究的結(jié)果使得黑樹莓成為腫瘤早期化學(xué)預(yù)防的一種有前景的物質(zhì)，但是，黑樹莓的作用在臨床試驗(yàn)中并沒有得到非常明確的肯定。
花色苷似乎是黑樹莓化學(xué)預(yù)防活性的主要貢獻(xiàn)者，但關(guān)于黑樹莓果肉有效成分的生物利用度和代謝的相關(guān)研究則很少?；ㄉ盏纳锢枚容^低（血漿＜1%），但已有研究發(fā)現(xiàn)在口腔和結(jié)腸組織中存在其天然形式，提示它們可能可以通過消化道與消化道組織相互作用。另一個存在的問題是不同患者對多酚攝入的估計量及其比較不易進(jìn)行，因?yàn)檫@可能存在很大的個體差異性，這種個體差異性與多個因素有關(guān)，如腫瘤部位附近的分子信號、自身體內(nèi)酶的活性和微生物群。
在目前采用的臨床試驗(yàn)方法中也存在一些明顯的不足。這些臨床試驗(yàn)通常是短時間完成的，并且患者人數(shù)較少，這些臨床試驗(yàn)并不能提供足夠的關(guān)于長期改善慢性疾病的數(shù)據(jù)。因此，在黑樹莓化學(xué)預(yù)防研究中需要考慮更多人體長期的臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)中的另一個問題是患者對治療的反應(yīng)，這與患者體內(nèi)生物活性漿果成分的代謝及吸收速率有關(guān)，一些研究人員確定了識別非侵入性生物標(biāo)志物的必要性，這些生物標(biāo)志物可以預(yù)測更有可能從化學(xué)預(yù)防治療中受益的個體。
1. 引 言
薔薇科懸鉤子亞屬屬于懸鉤子屬，包括結(jié)紅色果子的樹莓如最受歡迎的紅樹莓(Rubus idaeus L.)和結(jié)黑色果子的樹莓，包括黑樹莓（Rubus occidentalis L.）、白皮糙莓（Rubus leucodermis Douglasex Torr.& A. Gray）和插田泡（Rubus coreanus Miq）。黑樹莓原產(chǎn)東部北美，白皮糙莓生長在北美的西部，因?yàn)樗念伾际呛谏跇漭c白皮糙莓還被叫過同一個名字——黑樹莓。黑樹莓的原產(chǎn)地還包括歐洲的一些國家，如捷克共和國、斯洛伐克、俄羅斯和波蘭。
插田泡，也被稱為韓國黑樹莓，是一種用于制作韓國黑樹莓酒的灌木，原產(chǎn)東亞。目前基于果肉中花色苷成分的含量及DNA的分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)栽培的韓國的插田泡實(shí)際上就是黑樹莓。
直到19世紀(jì)，黑樹莓才被馴化，而自那之后，黑樹莓的商業(yè)生產(chǎn)卻一直在減少。這主要是因?yàn)闆]有可以抗病的黑樹莓品種，而且相對來說大眾也都更喜歡紅樹莓。盡管如此，近年來，黑樹莓的需求也一直在增長，這很大程度上是因?yàn)樵S多研究發(fā)現(xiàn)黑樹莓富含花色苷，并且具有潛在的健康益處。一些在美國市場上流行的黑樹莓品種包括Munger, Bristol, Jewel, MacBlack和Haut。波蘭的一種黑樹莓品種Litacz，也是Bristol通過自然授粉而進(jìn)化的。
雖然有關(guān)紅樹莓的研究很多，但主要都是抗炎及抑菌活性的測定，黑樹莓的相關(guān)研究則更多集中在其體內(nèi)外或體外模型中的抗癌作用。本綜述總結(jié)了黑樹莓這些年來在化學(xué)預(yù)防和抗癌活性上的相關(guān)研究。
2. 化學(xué)成分
黑樹莓的化學(xué)成分主要通過HPLC檢測來確定，常用的檢測器是UV-vis和ESI/MS。由于其懸鉤子屬物種的特性，研究發(fā)現(xiàn)，黑樹莓中含有多種多酚，尤其是花色苷和鞣花酸。據(jù)報道，黑樹莓中花色苷含量是紅樹莓（Rubus idaeus）的5倍多，并且與其他懸鉤子屬種如黑莓、marionberries和波森莓相比，其花色苷含量最高。
黑樹莓中的花色苷主要是矢車菊素-3-O-蕓香糖苷和矢車菊素-3-O-木糖基蕓香糖苷，約占黑樹莓果肉中的80％。矢車菊素-3-接骨木二糖苷和天竺葵素-3-O-蕓香糖苷的含量則較少，分別都是花色苷總量的1％至5％。此外，黑樹莓中還有其他的花色苷，包括矢車菊素、天竺葵素苷以及芍藥苷（表1，見22頁）。不同黑樹莓品種的總花色苷含量可能也會有差異，根據(jù)報道，干的Jewel品種黑樹莓中的花色苷含量為1770mg~100g/100g不等，而干的Litacz品種黑樹莓中的花色苷含量高達(dá)5512mg/100g。
對黑樹莓品種Munger, Bristol, Jewel, MacBlack和Haut的總花色苷含量進(jìn)行了測定，并與幾種雜交黑樹莓品種進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)直接栽種黑樹莓的總花色苷含量處于一個平均范圍，且和嫁接或扦插等繁殖方式所培育的黑樹莓中的總花色苷含量差異很大。據(jù)報道，黑樹莓種群中高花色苷和低花色苷含量相差約兩倍（244.8-541.3mg/100ml果汁），其中，主要兩種花色苷的水平也有顯著性差異。
雖然關(guān)于黑樹莓中鞣花酸成分的具體數(shù)據(jù)非常有限，但鞣花酸確實(shí)是是薔薇科的一大特色組分。據(jù)報道，紅樹莓中的鞣花酸含量可高達(dá)總酚含量的85％，而花色苷含量則僅約為12％。通過比較發(fā)現(xiàn)，黑樹莓中花色苷的濃度比鞣花酸高了四倍，當(dāng)然，這并不是因?yàn)轺坊ㄋ岷康停且驗(yàn)楹跇漭谢ㄉ蘸枯^高。于在波蘭生長的不同品種的紅樹莓和黑樹莓中地榆素H-6含量研究結(jié)果一致，研究發(fā)現(xiàn)，黑樹莓中的地榆素H-6含量為1482.5mg/100g干重，這與其他水果提取物的含量很相似，而紅樹莓中的鞣花酸濃度則要高出3-4倍（5045.2mg/100g干重）。
黑樹莓中的次級代謝物已被確定屬于多酚和簡單酚的其他類，雖然它們的含量明顯比鞣花酸和花色苷都更低，并且包含了好幾種酚類（如表1所示），包括黃烷-3-醇和黃酮醇（主要是槲皮素糖苷）、楊梅黃酮和山奈酚。不同品種的黑樹莓和紅樹莓提取物中的游離鞣花酸的濃度都比較低，為24~50mg/100g干重。
在最近的一項(xiàng)研究中，如表1所示，從黑樹莓中把芪類葡萄糖苷：反式白藜蘆醇苷和二氫查耳酮：根皮苷分離出來了。黑樹莓具有營養(yǎng)價值的其他成分包括維生素C、E，以及高濃度的鈣（Ca）、鉀（K）、銅（Cu）和鐵（Fe）。
3. 生物學(xué)活性研究
活性氧（ROS）是內(nèi)源代謝反應(yīng)過程中正常的細(xì)胞代謝產(chǎn)物，在應(yīng)對各種環(huán)境條件下的細(xì)胞信號通路中發(fā)揮著重要作用。它們來源于免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞，是炎癥部位釋放的一種可溶性分子，以趨使更多的炎細(xì)胞到達(dá)受損部位。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可以介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，從而導(dǎo)致多種轉(zhuǎn)錄因子的激活，如核因子κB（NF-κB）、激活蛋白1（AP-1）、核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（Nrf2）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3），其中轉(zhuǎn)錄激活因子3可介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)并誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素（IL-1，IL-2，IL-6）、環(huán)氧合酶-2（COX-2）以及一氧化氮合酶（NOS）酶表達(dá)。雖然急性、短期的炎癥通常對機(jī)體有益，也是正常免疫應(yīng)答的一部分，但持續(xù)的炎癥/氧化環(huán)境會損傷健康細(xì)胞，長時間下去可能會對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能造成重大的危害，包括DNA損傷，腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成，從而促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。ROS產(chǎn)生及清除的平衡是由各種DNA修復(fù)酶以及抗氧化劑維持的，但內(nèi)源性和外源性抗氧化劑被認(rèn)為能更有效地保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。
眾所周知，花色苷具有抗氧化作用，所以已經(jīng)有很多篇報道概述了黑樹莓抗氧化能力的相關(guān)研究，并且有的研究還把黑樹莓與氧化損傷、腫瘤發(fā)生以及幾種化學(xué)預(yù)防聯(lián)系起來。
4. 抗氧化活性
黑樹莓的獨(dú)特性在于其高抗氧化能力，并且許多研究都報道，與其他漿果相比，黑樹莓的抗氧化性最強(qiáng)。通過DPPH、FRAP、ABTS方法測定抗氧化能力時，黑樹莓乙醇提取物被證明具有最高的抗氧化活性。通過測定黑樹莓品種Jewel以及不同品種的無刺黑莓（Rubus sp.）、紅樹莓（Rubus idaeus L.）和草莓（Fragaria x ananassa D.）的總抗氧化活性（氧自由基吸收容量），發(fā)現(xiàn)，與其他漿果相比，黑樹莓不同成熟過程中的平均氧自由基吸收容量最高。這與其他研究的結(jié)果一致，即與其他種屬的水果如越桔屬、懸鉤子屬、虎耳草科酷栗屬相比，黑樹莓的抗氧化性最高。
在研究清除不同類型的ROS時發(fā)現(xiàn)，黑樹莓是O2•-、H2O2以及OH的最佳抗氧化劑，其清除’O2的能力排名第二。在氧化應(yīng)激條件下，ROS可以導(dǎo)致致癌突變的積累。OH• 導(dǎo)致DNA損傷的產(chǎn)物包括8-羥基鳥苷及其水解產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG），其中，8-OHdG被廣泛用作DNA氧化損傷標(biāo)志物。在MTT分析中發(fā)現(xiàn)，在H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激下，黑樹莓乙醇提取物可以促進(jìn)Caco-2細(xì)胞系的細(xì)胞活力。
經(jīng)研究確定，黑樹莓中主要的酚類抗氧化劑是矢車菊素-3-O-蕓香糖苷和矢車菊素-3-O-木糖基蕓香糖苷。此外，黑樹莓種子提取物中的鞣花酸被發(fā)現(xiàn)具有很強(qiáng)的抗氧化特性，且其含量是葡萄籽中鞣花酸的2倍不止。
黑樹莓的強(qiáng)抗氧化特性通常與其在癌癥等慢性病中的預(yù)防作用有關(guān)。
5. 黑樹莓與癌癥的關(guān)系
研究發(fā)現(xiàn)，黑樹莓可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，這與慢性炎癥及相關(guān)體外腫瘤進(jìn)展都有一定的關(guān)系。此外，各成熟階段的水果可通過減少一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）的產(chǎn)生來減少促炎癥過程。黑樹莓乙醇提取物可抑制人類CD4+和CD8+ T淋巴細(xì)胞的增殖和活力。它也可以調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子IL-6和IL-2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子STAT3和STAT5的磷酸化和轉(zhuǎn)錄激活。有趣的是，它們還會限制MDSC（髓源性抑制細(xì)胞）的擴(kuò)增，抑制T淋巴細(xì)胞的激活。雖然這似乎與抑制T淋巴細(xì)胞的作用相反，但對抑制腫瘤作用也可以起到有益的作用，如在腫瘤微環(huán)境中，MDSCs可直接通過分泌促進(jìn)腫瘤生長的因子來促進(jìn)血管生成及淋巴管生成。黑樹莓提取物不但可以通過抑制MDSCs導(dǎo)致的腫瘤血管生成，還被發(fā)現(xiàn)可以通過其他抗血管生成的機(jī)制來抑制血管生成，即從源頭上抑制血管生成以及抑制血管原的血管生長，血管生長是通過基于組織的體外纖維蛋白凝膠進(jìn)行測定的。
5.1. 上皮癌
致癌物BPDE（苯并[α]芘-7,8-二醇-9,10-環(huán)氧化物）可引起小鼠上皮CI41細(xì)胞系增殖，而相關(guān)的報道表明，黑樹莓可抑制癌細(xì)胞的增殖。研究表明，黑樹莓提取物具有化學(xué)預(yù)防作用，能夠抑制BPDE誘導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NFκB、NFAT（活化T細(xì)胞的核因子）以及抑制相關(guān)基因如VEGF（血管內(nèi)皮生長因子）、COX-2（環(huán)氧合酶2）和TNF-α（腫瘤壞死因子）的表達(dá)。已有許多種相關(guān)的假設(shè)機(jī)制來解釋上述黑樹莓的化學(xué)預(yù)防作用。一種是通過阻止MAPKs（絲裂原活化蛋白激酶）和IκBa（NFκB的抑制蛋白，一般以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中）的磷酸化及抑制AP-1和NFκB的活化受損，從而下調(diào)VEGF和COX-2。其他數(shù)據(jù)表明PI-3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制，可能與抑制AP-1和NFκB的活化受損有關(guān)。奇怪的是，依賴于AP-1的iNOS的表達(dá)卻沒有被抑制。這些結(jié)果意味著黑樹莓成分具有靶向作用于不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的潛力，從而發(fā)揮對上皮癌的化學(xué)預(yù)防作用。在后續(xù)研究中，發(fā)現(xiàn)抑制由BPDE誘導(dǎo)的NFκB活化作用的主要成分是矢車菊素-3-O-葡糖苷、-3-O-蕓香糖苷和-3-O-木糖基蕓香糖苷。
在一項(xiàng)SKH-1無毛小鼠的體內(nèi)研究中，局部使用黑樹莓提取物可顯著減少皮膚炎癥及其癌變。在短期模型中，將小鼠暴露于一定劑量的UV-B輻射下，小鼠出現(xiàn)了小范圍的紅斑，局部分別用黑樹莓提取物或賦形劑處理。處理48小時后，用500μg黑樹莓提取物處理的小鼠的炎癥反應(yīng)顯著減少，包括皮膚水腫、中性粒細(xì)胞活化、p53的蛋白質(zhì)表達(dá)水平和DNA損傷標(biāo)志物都顯著減少。在長期模型中，將小鼠暴露于相同劑量輻射，每周三次，持續(xù)25周，同時局部用黑樹莓提取物及賦形劑處理，發(fā)現(xiàn)與用賦形劑處理的小鼠（每只小鼠平均有30個腫瘤，腫瘤的平均大小為30.2 mm2）相比，用黑樹莓提取物處理的小鼠的腫瘤數(shù)及腫瘤大?。恐恍∈笃骄?7個腫瘤，腫瘤的平均大小為10.1 mm2）均有減少。這與腫瘤組織浸潤的CD4+和CD3+ foxp3+T細(xì)胞的水平顯著降低有關(guān)，而腫瘤組織浸潤的CD4+和CD3+ foxp3+T細(xì)胞的水平會促進(jìn)UV-B誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)展。
5.2. 乳腺癌
在一個有關(guān)黑樹莓對乳腺腫瘤作用的飲食管理活動報告中發(fā)現(xiàn)，與喂食標(biāo)準(zhǔn)飲食的大鼠相比，喂食了黑樹莓或鞣花酸的大鼠中的腫瘤體積和多樣性都減小了。這個報告中所用的大鼠屬于ACI品系，乳腺腫瘤是由雌激素誘導(dǎo)的。并且，黑樹莓提取物和鞣花酸在顯著減少腫瘤體積和多樣性方面具有類似的療效。此外，黑樹莓可以有效下調(diào)雌激素受體ERα的表達(dá)。在人體MCF-7乳腺癌細(xì)胞系的體外研究中，發(fā)現(xiàn)黑樹莓提取物有可能使癌細(xì)胞對輻射損傷更加敏感。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因應(yīng)該是對NFκB的抑制作用，NFκB是癌細(xì)胞的一種輻射防護(hù)劑。
5.3. 口腔癌
在正常的、惡化前的及惡化的人口腔細(xì)胞上對黑樹莓提取物的化學(xué)預(yù)防作用進(jìn)行評估。黑樹莓乙醇提取物可抑制惡性腫瘤細(xì)胞及癌變前細(xì)胞的生長，且對正常細(xì)胞沒有影響。并且發(fā)現(xiàn)鞣花酸、阿魏酸和β-谷甾醇對這些細(xì)胞也有同樣的效果，唯一的區(qū)別就是鞣花酸會抑制正常細(xì)胞的生長。鞣花酸的這種抑制作用可歸因于其對細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（Cdk）的影響，Cdk是一種在信號通路中可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程的蛋白。在另一項(xiàng)口腔鱗狀細(xì)胞癌（SCC）的研究中，發(fā)現(xiàn)黑樹莓乙醇提取物有抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制VEGF產(chǎn)生及NOS活性的作用。
為研究黑樹莓抑制口腔腫瘤的作用，采用7,12-二甲基苯基蒽誘導(dǎo)的致癌作用模型在倉鼠頰囊進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。與對照組相比，喂食中有5％黑樹莓粉末的倉鼠頰囊的腫瘤數(shù)量顯著減少，然而，喂食10％黑樹莓粉末抑制腫瘤生長的作用則不如5％的那么好。
5.4. 食道癌
研究黑樹莓的作用大多采用N-亞硝基甲基芐胺（NMBA）誘導(dǎo)ESCC（食管鱗狀細(xì)胞癌）的大鼠模型。在抗癌研究中，給實(shí)驗(yàn)大鼠分別喂食5％和10％的凍干黑樹莓粉，發(fā)現(xiàn)凍干黑樹莓粉可顯著減少病灶形成、腫瘤發(fā)病率及多樣性，從而證明黑樹莓可以抑制癌癥的發(fā)生及發(fā)展。有趣的是，5％劑量的黑樹莓粉似乎比10％的更有效。其抑制病變的作用與在食管中減少NMBA誘導(dǎo)的前致癌物O6-甲基鳥嘌呤加合物中的影響有關(guān)，這說明黑樹莓可影響NMBA的代謝，從而防止DNA的損傷。
后啟動研究表明，黑樹莓除了可以減少NMBA處理的大鼠中腫瘤病灶、數(shù)量及大小，還可把一些食管癌和食道乳頭狀瘤中異常表達(dá)的基因調(diào)節(jié)在正常水平。如表2（見22頁）所示，與草莓的凍干提取物相比，黑樹莓抑制NMBA誘導(dǎo)的DNA加合物形成更有效，同時還可減少腫瘤的發(fā)生率和多樣性。從補(bǔ)充大鼠中獲得了抑制食管組織培養(yǎng)及微粒體NMBA的有效成分，并被鑒定為矢車菊素-3-O-蕓香糖苷、鞣花酸和矢車菊素-3-O-葡糖苷。
在另一項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)黑樹莓提取物包括富含花色苷部分和有機(jī)不溶部分（預(yù)估含有大量單寧）可抑制癌以及癌前病變中的細(xì)胞增殖、炎癥、血管生成，這表明了黑樹莓抑制不同類型的癌癥的作用機(jī)制是相似的。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，含有凍干黑樹莓、黑樹莓的花色苷及原兒茶酸（主要花色苷代謝產(chǎn)物）的飲食均可同等有效地抑制NMBA誘導(dǎo)的食管腫瘤，然而在35周以后的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，還是凍干黑樹莓粉的效果會略微更好一些。
然而，在一項(xiàng)黑樹莓、草莓和藍(lán)莓即不同含量的單寧對大鼠食管癌影響的研究中發(fā)現(xiàn)，漿果部分組防止NMBA誘導(dǎo)ESCC的作用并沒有顯著性差異。這表明黑樹莓中的單寧可能并沒有化學(xué)預(yù)防作用。
對食管鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤進(jìn)展的分子機(jī)制研究顯示，飲食中加入5％黑樹莓粉末可下調(diào)食管癌癌前病變中COX-2、iNOS、PGE2和c-Jun（AP-1蛋白家族成員）的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。黑樹莓提取物也被證明具有抗血管生成特性，可顯著抑制食管癌癌前病變中VEGF的表達(dá)，還可減少微血管密度（MVD），這都與抑制COX-2和iNOS有關(guān)。
此外，黑樹莓粉還能通過降低促炎生物標(biāo)志物COX-2、iNOS、p-NF-κB，可溶性環(huán)氧化物水解酶和細(xì)胞因子正五聚蛋白-3的活性抑制食管內(nèi)皮炎癥，上述的生物標(biāo)志物是由IL-1b和TNF-α介導(dǎo)的。
5.5. 結(jié)直腸癌
關(guān)于黑樹莓對COX-2表達(dá)而影響HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞的報道并不少。在幾種漿果提取物對抗HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞凋亡活性的研究中，黑樹莓提取物是有顯著促凋亡活性作用的兩種漿果之一（另一種是草莓），且其誘導(dǎo)細(xì)胞的效果是未經(jīng)處理對照組的3倍。其他有關(guān)HT-29細(xì)胞抗增殖的報道中顯示，雖然黑樹莓提取物抑制癌細(xì)胞增殖存在劑量依賴性，但其抑制增殖的效果與總酚及總花色苷含量并沒有相關(guān)性。為了進(jìn)一步探討這個問題，采用了基于1H NMR多變量統(tǒng)計模型的代謝組學(xué)研究來鑒定天然黑樹莓提取物中具有抗增殖活性的成分。發(fā)現(xiàn)，具有抗增殖活性的主要成分是矢車菊素-3-O-木糖基蕓香糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷。然而，該模型數(shù)據(jù)還指出，黑樹莓的抗增殖功效并非直接與花色苷含量相關(guān)。這和之前的研究報告一致，花色苷可對癌細(xì)胞起到最大的作用，然而總花色苷含量的提高或種類分布的改變可能都不會提高提取物的活性。黑樹莓中的非花色苷成分雖然只占了總酚含量非常小的比例，但對黑樹莓提取物的抗增殖活性也非常重要，這些成分包括水楊酸衍生物、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-蕓香糖苷、對香豆酸、表兒茶素、甲基鞣花酸衍生物和檸檬酸衍生物。此外，研究還發(fā)現(xiàn)黑樹莓中的花色苷能抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性及表達(dá)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶對一些人體特定腫瘤包括HTC-116中的DNMT1、DNMT3B以及結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞系中的Caco-2、SW480的異常甲基化具有重要意義。這些結(jié)果表明黑樹莓中的花色苷對全黑樹莓在結(jié)直腸癌中的去甲基化作用是極具意義的。
潰瘍性結(jié)腸炎是一種可顯著增加結(jié)直腸癌風(fēng)險的慢性潰瘍性結(jié)腸炎（UC），科學(xué)家們采用
3％葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的小鼠模型評價凍干黑樹莓的化學(xué)預(yù)防效果。研究發(fā)現(xiàn)，飲食中豐富的黑樹莓粉末可顯著減少DSS引起的損傷包括結(jié)腸縮短及潰瘍，然而，這并沒有影響到氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物（血漿NO和結(jié)腸丙二醛）的水平以及和結(jié)腸DSS損傷有關(guān)的炎性細(xì)胞浸潤。另一方面，7天的黑樹莓粉治療可抑制結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1b、COX-2及IκB-α的磷酸化（IκB-α磷酸化后隨即降解，隨之而來的就是NFκB核因子的激活）。奇怪的是，這項(xiàng)研究的結(jié)果表明黑樹莓的保護(hù)機(jī)制更多與其抗炎特性而不是抗氧化活性相關(guān)。
還有一些其他的大腸癌動物模型運(yùn)用于評價黑樹莓在體內(nèi)的功效?；瘜W(xué)致癌物氧化偶氮甲烷
（AOM）能夠誘發(fā)大鼠結(jié)直腸癌的發(fā)生，該動物模型被廣泛用于一些化學(xué)預(yù)防劑預(yù)防結(jié)腸癌的作用評價。喂食含有2.5％、5％、10％的凍干黑樹莓粉末的大鼠腫瘤多樣性分別降低42％、45％和71％，同時可顯著減少暴露于AOM的大鼠的DNA氧化損傷，降低尿中的DNA氧化損傷生物標(biāo)志物8-OH-Dg的表達(dá)。
兩種基因缺陷小鼠模型APC1638+/-及Muc-/-，可分別自發(fā)發(fā)展成結(jié)直腸癌及結(jié)腸炎，可用于評
價黑樹莓對結(jié)腸癌發(fā)展的影響及其潛在機(jī)制。在兩種模型中，喂飼黑樹莓12個星期可顯著抑制結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生。APC1638+/-小鼠腫瘤發(fā)生率減少45%，單只腫瘤數(shù)量減少60%；Muc-/-小鼠的發(fā)生率和單只腫瘤數(shù)量則都是減少50%。機(jī)理研究結(jié)果表明，黑樹莓可通過抑制β-catenin信號通路（其過度表達(dá)與多種類型的癌癥相關(guān)）抑制APC1638+/-小鼠腫瘤發(fā)展，抑制Muc-/-小鼠腫瘤發(fā)展則是通過減少慢性炎癥。
6. 黑樹莓果肉的早期化學(xué)預(yù)防臨床試驗(yàn)
黑樹莓是基于食物的癌癥預(yù)防途徑，科學(xué)們已經(jīng)做出了相當(dāng)大的努力來評估黑樹莓粉作為化學(xué)預(yù)防劑的效用。黑樹莓在最小或無毒性的條件下限制了癌前細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性癌細(xì)胞，這種特性使其極有希望成為早期化學(xué)預(yù)防劑。一項(xiàng)研究為了確定黑樹莓對口腔癌的發(fā)展具有是否保護(hù)作用，將含有凍干黑樹莓的粘膜粘附凝膠局部施用于人類口腔粘膜。上皮內(nèi)瘤樣病變患者易患口腔鱗狀細(xì)胞癌，每日給皮內(nèi)瘤樣病變患者施用黑樹莓凝膠4次，為期6周。6周后，在施用黑樹莓凝膠的患者中觀察到病變組織的退化，在3個腫瘤抑制基因位點(diǎn)：UK4A/ARF、p53和FHIT中觀察到雜合性缺失率在統(tǒng)計學(xué)上顯著降低。此外，還發(fā)現(xiàn)用黑樹莓凝膠治療后可顯著降低病變上皮中COX-2的水平。在研究過程中，一部分患者對黑樹莓凝膠的響應(yīng)很好。病灶上的蛋白質(zhì)譜顯示，這些高度響應(yīng)的患者體內(nèi)的黑樹莓代謝和角質(zhì)形成細(xì)胞分化所需的酶的預(yù)處理水平更高，這表明在黑樹莓治療中，自己體內(nèi)的酶活力也是很重要的。
接下來要介紹的這個課題是對口腔內(nèi)花色苷代謝及其對黑樹莓化學(xué)預(yù)防功效潛在影響的后續(xù)研究。每天給患者局部施用10%黑樹莓，通過患者的漱口液來評估口腔組織、唾液和口腔菌群中花色苷的代謝水平。通過大量的藥代動力學(xué)分析和功能活性測定，證明黑樹莓中的花色苷在唾液中可持續(xù)性存在，并且漂洗黑樹莓外用凝膠時，口腔中的花色苷水平更高，還發(fā)現(xiàn)原兒茶酸（穩(wěn)定的花色苷降解產(chǎn)物）及原兒茶酸葡萄糖苷、葡糖醛酸化的花色苷綴合物（被認(rèn)為是生物活性花色苷代謝物）在唾液中也可持續(xù)存在。這種腸溶性花色苷的循環(huán)過程，很大程度上是被口腔的β-葡萄糖苷酶催化發(fā)生的，并且患者間的個性化也可能影響局部施用黑樹莓化學(xué)療法的效果。
一項(xiàng)研究對結(jié)直腸癌及結(jié)直腸息肉患者進(jìn)行了黑樹莓的干預(yù)試驗(yàn)，患者均是在預(yù)定手術(shù)的前2-4周接受了每天60g干黑樹莓粉的治療。比較治療前后腫瘤/息肉組織的活檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑樹莓粉對結(jié)直腸癌的兩種預(yù)后生物標(biāo)志物有影響：Ki-67和CD105。在活檢標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)，Ki-67蛋白（與細(xì)胞增殖相關(guān)）和CD105（這是TGF-β受體復(fù)合物的一部分，并在血管生成中具有關(guān)鍵作用）的水平在黑樹莓治療后均顯著降低。并且，用TUNEL法檢測DNA片段化結(jié)果顯示，用黑樹莓治療后的腫瘤細(xì)胞凋亡率升高。
在一項(xiàng)為期9個月的針對家族性腺瘤性息肉病高?；颊咴囼?yàn)中，14名患者每天采用兩種不同的黑樹莓粉治療方式，一種是口服黑樹莓粉+BRB直腸栓劑的形式，另一種則是口服安慰劑+BRB直腸栓劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對黑樹莓治療有響應(yīng)的患者息肉負(fù)荷顯著下降，但息肉數(shù)量并沒有下降，同時這些患者還有其他變化：細(xì)胞增殖率下降，DNMT1表達(dá)減少，CDKN2A的甲基化下降。其中，CDKN2A是抑癌基因p16的啟動子基因。有3例患者對黑樹莓的治療無反應(yīng)，他們的腺瘤數(shù)目或分子標(biāo)志物水平基本沒有變化。
在另一項(xiàng)關(guān)于結(jié)直腸癌的研究中，患者每天接受60g黑樹莓粉，為期9周，并抽血檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和血管生成的相關(guān)標(biāo)志物的變化。結(jié)果表明，漿果治療對腺癌及鄰近未分化組織的增殖（Ki67）、凋亡（TUNEL）、血管生成（CD105）都具有積極的作用。同時，患者接受漿果治療10天后，血漿中粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）濃度顯著升高，IL-8濃度顯著降低，其他血漿細(xì)胞因子則無明顯變化。由于IL-8的高水平表達(dá)是腫瘤發(fā)展的一個強(qiáng)有力的預(yù)測因子，因此作者提出IL-8和GM-CSF的變化可以作為結(jié)直腸癌患者消費(fèi)黑樹莓治療反應(yīng)的預(yù)測指標(biāo)。
一項(xiàng)在巴雷特食管的癌前病變患者中進(jìn)行的研究顯示，盡管尿液中檢測的氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物的水平顯著降低，但巴雷特食管病灶的病變長度并沒有顯著改變。作者認(rèn)為，這可能是當(dāng)黑樹莓粉混合水后以懸浮液形式施用時，因?yàn)橥ㄟ^食管速度太快，還不足以讓局部充分吸收活性化合物進(jìn)入病灶。
7.總 結(jié)
黑樹莓具有獨(dú)特的多酚成分，主要由花色苷和鞣花單寧組成。黑樹莓的果肉具有很高的抗氧化性，且發(fā)現(xiàn)其在分子水平上可減少與癌癥和炎癥相關(guān)的過程。黑樹莓通過影響致癌物質(zhì)代謝、降低癌前細(xì)胞的生長速度、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、減少組織炎癥和抑制血管生成等機(jī)制對多種類型腫瘤均有一定的抑制作用。動物和體外研究的結(jié)果使得黑樹莓成為腫瘤早期化學(xué)預(yù)防的一種有前景的物質(zhì)，但是，黑樹莓的作用在臨床試驗(yàn)中并沒有得到非常明確的肯定。
花色苷似乎是黑樹莓化學(xué)預(yù)防活性的主要貢獻(xiàn)者，但關(guān)于黑樹莓果肉有效成分的生物利用度和代謝的相關(guān)研究則很少?；ㄉ盏纳锢枚容^低（血漿＜1%），但已有研究發(fā)現(xiàn)在口腔和結(jié)腸組織中存在其天然形式，提示它們可能可以通過消化道與消化道組織相互作用。另一個存在的問題是不同患者對多酚攝入的估計量及其比較不易進(jìn)行，因?yàn)檫@可能存在很大的個體差異性，這種個體差異性與多個因素有關(guān)，如腫瘤部位附近的分子信號、自身體內(nèi)酶的活性和微生物群。
在目前采用的臨床試驗(yàn)方法中也存在一些明顯的不足。這些臨床試驗(yàn)通常是短時間完成的，并且患者人數(shù)較少，這些臨床試驗(yàn)并不能提供足夠的關(guān)于長期改善慢性疾病的數(shù)據(jù)。因此，在黑樹莓化學(xué)預(yù)防研究中需要考慮更多人體長期的臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)中的另一個問題是患者對治療的反應(yīng)，這與患者體內(nèi)生物活性漿果成分的代謝及吸收速率有關(guān)，一些研究人員確定了識別非侵入性生物標(biāo)志物的必要性，這些生物標(biāo)志物可以預(yù)測更有可能從化學(xué)預(yù)防治療中受益的個體。
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