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黑樹莓對(duì)人體結(jié)直腸癌遺傳和表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)志物的調(diào)控：I期先導(dǎo)研究
發(fā)表于：2019-02-19 作者：admin 來源：本站 點(diǎn)擊量：7944
目的：本研究考察了黑樹莓對(duì)人類結(jié)直腸腫瘤發(fā)展的生物標(biāo)志物的影響，包括相關(guān)腫瘤抑制基因的甲基化、細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成和Wnt通路基因表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：口服黑樹莓粉末（每天60g）前后，分別從20名患者毗鄰正常組織和結(jié)直腸腺瘤組織取樣檢查，持續(xù)9周。對(duì)5個(gè)腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化定量，測量DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）以及與細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的基因的蛋白表達(dá)。
結(jié)果：三種Wnt抑制劑SFRP2、SFRP5、WIF1—— Wnt通路的上游基因，以及進(jìn)展調(diào)節(jié)因子PAX6a的甲基化，在接受黑樹莓治療平均4周的病人的正常組織和結(jié)直腸腫瘤中得到了黑樹莓直接的保護(hù)調(diào)節(jié)作用；但該作用并沒有在接受黑樹莓治療1-9周的20個(gè)所有病人身上呈現(xiàn)。這與DNMT1的表達(dá)降低有關(guān)。BRBs以保護(hù)方式調(diào)節(jié)與Wnt通路、增殖、凋亡和血管發(fā)生相關(guān)的基因的表達(dá)。
結(jié)論：這些數(shù)據(jù)提供了BRBs具備使腫瘤抑制基因去甲基化和調(diào)節(jié)人結(jié)直腸腫瘤發(fā)展的其它生物標(biāo)志物的能力的證據(jù)。盡管基因的去甲基化不不是在所有接受黑樹莓治療的患者的結(jié)腸直腸組織中都能發(fā)生，但是具有第二終點(diǎn)的陽性結(jié)果表明，對(duì)于BRBs預(yù)防人類結(jié)腸直腸癌的更多的研究是有必要的。
引言
結(jié)直腸癌是美國男性和女性中發(fā)生率排行第三的癌癥。估計(jì)在2009年將有49920人死于結(jié)直腸癌，大約占癌癥患者死亡數(shù)的9%。在過去二十年中，男性和女性結(jié)直腸癌的死亡率都有所下降，這反映了發(fā)病率下降和疾病早期篩查的增加。這種疾病的5年存活率為64％，并且在確診后10年繼續(xù)下降至57％。對(duì)于診斷時(shí)具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，5年存活率僅為10％。因此，預(yù)防結(jié)腸直腸癌仍然是一個(gè)重要的目標(biāo)，化學(xué)預(yù)防是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的一種方法。
我們研究已經(jīng)表明，在36周的試驗(yàn)中，將含2.5％，5％和10％黑樹莓粉的合成飲食施用于氧化偶氮甲烷（AOM）處理的Fischer 344（F-344）大鼠導(dǎo)致相對(duì)于僅AOM組，腫瘤數(shù)量分別平均降低42％、45％、71%（P<0.05）。 我們還發(fā)現(xiàn)這些相同組中氧化性DNA加合物，8-羥基-20-脫氧鳥苷（8-OHdG）在尿液中水平顯著降低，表明漿果有減少氧化應(yīng)激的能力。BRBs在大鼠結(jié)腸中減少AOM誘導(dǎo)的腫瘤的機(jī)制還沒有研究。然而，在使用亞硝胺誘導(dǎo)的食管鱗狀細(xì)胞癌（SCC）的大鼠模型的研究中，發(fā)現(xiàn)BRB能減少增殖、炎癥和血管生成，并刺激癌前細(xì)胞和組織的凋亡和分化，導(dǎo)致腫瘤發(fā)展減少。與這些細(xì)胞功能相關(guān)的基因也得到了BRBs的保護(hù)。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的DNA甲基化由一系列高度相關(guān)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT1，DNMT3a和DNMT3b）調(diào)節(jié)，其介導(dǎo)甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移至二核苷酸序列CpG中胞嘧啶堿基的5號(hào)位。DNMT1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中充當(dāng)維持DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，并且負(fù)責(zé)在細(xì)胞周期的S期間精確地復(fù)制基因組DNA甲基化模式。相反，DNA的從頭甲基化被認(rèn)為由具有維持和從頭DNA甲基化活性的DNMT3a和DNMT3b酶進(jìn)行。然而，兩組酶顯示在體外表現(xiàn)出一定水平的維持和從頭甲基化，這表明DNMT的這種分類可能被過度簡化。確認(rèn)DNA甲基化在腫瘤發(fā)生中的重要性，研究顯示所有3種DNMT在幾種腫瘤類型中過度表達(dá)，包括結(jié)腸和直腸、膀胱和腎的腫瘤。當(dāng)DNMT1和DNMT3b在結(jié)腸癌細(xì)胞中被敲除時(shí)，腫瘤抑制基因的甲基化或諸如p16基因幾乎完全消除，并且基因重新表達(dá)。因此，DNMT的抑制可導(dǎo)致沉默基因的去甲基化和再活化。DNMT的腫瘤抑制基因的異常甲基化可能是化學(xué)預(yù)防的有希望的目標(biāo)。 DNMT抑制劑目前正在開發(fā)作為癌癥的潛在治療劑。
異常Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt）通路發(fā)生在約85%的散發(fā)性結(jié)腸直腸癌中，并且主要?dú)w因于Apc基因的突變。最近的研究結(jié)果表明Wnt通路在細(xì)胞增殖，分化和干細(xì)胞維持中的重要作用。由于失調(diào)的基因甲基化導(dǎo)致的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的破壞也是人結(jié)腸直腸癌中的常見事件，例如，Wnt負(fù)調(diào)節(jié)因子，分泌的卷曲相關(guān)蛋白2和5（SFRP2和SFRP5）、Wnt抑制因子1（WIF1）的頻繁甲基化。已在異常隱窩灶（ACF）和原發(fā)性結(jié)腸癌細(xì)胞中檢測到SFRP基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化。SFRP在結(jié)腸癌細(xì)胞中的重新表達(dá)阻斷Wnt信號(hào)傳導(dǎo)并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。重要的是，這些事件發(fā)生在結(jié)腸癌細(xì)胞中表現(xiàn)出β-連接蛋白突變，它是Wnt通路中的下游基因。據(jù)報(bào)道在結(jié)腸癌細(xì)胞中p16、CDKN2A—— 一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子、PAX6a—— 一種發(fā)展調(diào)節(jié)因子的沉默，與啟動(dòng)子高甲基化相關(guān)。與DNA堿基的突變變化不同，腫瘤抑制基因的DNA甲基化模式的潛在可逆性表明這些是預(yù)防和/或治療結(jié)腸直腸癌的可行靶標(biāo)。
這項(xiàng)研究的目的是調(diào)查短期BRBs食療對(duì)Wnt抑制劑——SFRP2，SFRP5和WIF1，以及p16和PAX6a的影響，并在人類結(jié)腸直腸癌組織中調(diào)節(jié)DNMT家族酶。漿果對(duì)Wnt通路中下游基因的蛋白表達(dá)的影響，即β-連接蛋白、E-鈣粘蛋白、c-Myc、細(xì)胞增殖標(biāo)志物（Ki-67）、凋亡（TUNEL）、血管生成（CD-105）也都是考察對(duì)象。我們的研究結(jié)果表明，每天口服BRBs持續(xù)平均約4周，在人結(jié)直腸組織中會(huì)產(chǎn)生多表觀遺傳和細(xì)胞生物標(biāo)志物保護(hù)調(diào)節(jié)。這些效應(yīng)好像是結(jié)腸直腸組織局部吸收漿果中的活性物質(zhì)而發(fā)生的。
材料和方法
臨床試驗(yàn)
本實(shí)驗(yàn)中評(píng)估BRBs對(duì)結(jié)腸直腸癌發(fā)展生物標(biāo)志物的影響是由俄亥俄州立大學(xué)綜合癌癥中心的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)和得克薩斯大學(xué)圣安東尼奧分校批準(zhǔn)的。在參與試驗(yàn)之前，從所有患者手中獲得書面知情同意書。該試驗(yàn)中的大多數(shù)患者是被診斷患有結(jié)腸直腸癌的人，并且被送到奧約州立大學(xué)詹姆斯癌癥醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)。因此，為了符合該試驗(yàn)的條件，他們必須同意進(jìn)行第二次結(jié)腸鏡檢查或乙狀結(jié)腸鏡檢查（取決于腫瘤位置）以獲得基線結(jié)腸直腸腫瘤和相鄰的正常組織用于研究。
A：入選標(biāo)準(zhǔn)
試驗(yàn)中的患者有以下情況之一：
i）具有早期結(jié)腸直腸癌（原發(fā)性或復(fù)發(fā)性）的病理診斷的患者，其在結(jié)腸或直腸中具有原發(fā)性損傷，并且被認(rèn)為是選擇性結(jié)腸直腸手術(shù)的候選者。
ii）診斷為IV期結(jié)直腸癌而在肝或腹部具有轉(zhuǎn)移性損害（癌癥病變）的患者也是合格的，條件是原發(fā)性損傷存在于結(jié)腸或直腸中，并且計(jì)劃手術(shù)切除結(jié)直腸病變。
iii）由于大小或其他原因（例如接受抗凝治療），需要進(jìn)行重復(fù)結(jié)腸鏡檢查或乙狀結(jié)腸鏡檢查或手術(shù)切除而無法通過初始結(jié)腸鏡或乙狀結(jié)腸鏡切除的具有結(jié)腸息肉或腺瘤的病理診斷的患者。
iv）外科醫(yī)生慎重判斷認(rèn)為結(jié)直腸惡性腫瘤高可能性的患者，具有諸如貧血，直腸出血，體重減輕，腸運(yùn)動(dòng)習(xí)慣變化，結(jié)腸直腸腫塊的X射線證據(jù)等歷史記錄，這些患者符合要求。
v）如果沒有阻塞性病變或阻塞性癥狀，直腸癌患者在進(jìn)行放化療或手術(shù)前是合格的。
B：排除標(biāo)準(zhǔn)
從試驗(yàn)中排除的患者具有以下之一：
i）阻塞或出血的臨床癥狀，并考慮立即手術(shù)。
ii）直腸癌或阻塞性病變的候選患者，需立即新的輔助性化/放療治療或手術(shù)。
iii）目前正在接受化療或放射治療的患者（自最后一次化療治療后大于4周和放射治療后大于3周）。
iv）服用非甾體抗炎藥（NSAIDs）的患者，由于其臨床癥狀不能停藥。
v）懷孕或哺乳期患者。
vi）具有不受控的、未補(bǔ)償?shù)男呐K，肺或肝臟疾病，或不受控制的傳染病或糖尿病。
黑樹莓
從俄亥俄農(nóng)場購買新鮮冷凍的BRBs（Jewel品種，2004年收獲），并冷凍運(yùn)送到伊利諾斯州莫門斯的范德魯南農(nóng)場，如所述進(jìn)行冷凍干燥。BRBs的營養(yǎng)物分析和包裝詳見補(bǔ)充方法。
黑莓用量管理
一劑20g冷凍干燥的漿果粉末與約100mL水混合，每天口服3次（總共60g /d）持續(xù)1-9周。每天定期服用漿果粉3次，間隔6小時(shí)。60克漿果粉每天接近1.3磅新鮮BRB，相當(dāng)于7％嚙齒動(dòng)物樹莓粉飲食。發(fā)現(xiàn)BRB粉末在大鼠飲食中以2.5％至10％的濃度提供時(shí)，對(duì)大鼠結(jié)腸具有化學(xué)預(yù)防作用。
漿果處理前和漿液處理期間的評(píng)估
起初，給所有患者進(jìn)行身體檢查，在此期間獲得他們的醫(yī)療/手術(shù)史，并且完成了乳酸脫氫酶（LDH），癌胚抗原（CEA），完全血細(xì)胞計(jì)數(shù)（CBC）和完全代謝組的實(shí)驗(yàn)室測試。然后，他們參加了一次24小時(shí)的口頭食物召回，以便在用漿果粉治療之前建立富含酚類食物（包括漿果產(chǎn)品）的消費(fèi)模式。在漿果治療期間，每周評(píng)估患者一次依從性和任何不良事件。在試驗(yàn)期間，要求患者避免使用除黑莓粉之外的漿果類型。
組織和尿液收集
所有入選試驗(yàn)的患者在進(jìn)入試驗(yàn)前都診斷為結(jié)腸直腸癌。 因?yàn)橛糜诔跏荚\斷的組織不可用于研究，所以有必要在漿果治療患者之前獲得另外的組織標(biāo)本。最初，患者簽署了同意書，之后他們停止使用NSAIDs。大約5天后，從結(jié)直腸癌患者體內(nèi)取三個(gè)活體樣本，每一個(gè)毗鄰于正常組織（距離腫瘤組織小于2nm的位置）和腫瘤組織。將每份活體樣本的一半置于10％福爾馬林緩沖液中，另一半在液氮中冷凍?；颊咴诓杉M織活檢后約24小時(shí)開始每天服用BRBs粉末，并直到手術(shù)去除腫瘤前12-36小時(shí)。在手術(shù)時(shí)，從每個(gè)患者體內(nèi)取出毗鄰正常和腫瘤組織的另外3個(gè)活體樣本，并如預(yù)處理活檢所述那樣放置在緩沖的福爾馬林中或冷凍。所有組織標(biāo)本由醫(yī)學(xué)病理學(xué)家W. Frankel博士在組織病理學(xué)上分類為正?；蚰[瘤組織。所有腫瘤均為腺瘤。
在基線水平和漿果處理后收集了治療前和治療后的尿液樣本（每個(gè)約50mL）。 為了確保漿果花色苷的穩(wěn)定性，將樣本加入5％三氟乙酸降低PH至酸性后保存在-80℃。
測量結(jié)直腸組織和尿中的漿果花色苷
在補(bǔ)充方法中詳述了樣品制備和HPLC-MS / MS分析和花青素的定量。
DNA甲基化的分析
A. DNA提取和亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。相鄰的正常和腫瘤組織用于提取基因組DNA，如補(bǔ)充方法中所述。
B. 質(zhì)量序列。高通量MassARRAY用于定量p16，PAX6a，SFRP2，SFRP5和WIF1的CpG島的甲基化水平，如補(bǔ)充方法中所詳述。
C. 焦磷酸測序。使用LINE-1重復(fù)元件亞硫酸氫鹽/焦磷酸測序來評(píng)估整體的甲基化水平，如補(bǔ)充方法中所詳述。
免疫組織化學(xué)染色和計(jì)算機(jī)輔助圖像分析
免疫組織化學(xué)染色程序和β-連環(huán)蛋白，E-鈣粘蛋白，c-Myc，Ki-67，TUNEL，p16，CD105或DNMT1的染色定量在補(bǔ)充方法中詳述。
統(tǒng)計(jì)分析
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：口服黑樹莓粉末（每天60g）前后，分別從20名患者毗鄰正常組織和結(jié)直腸腺瘤組織取樣檢查，持續(xù)9周。對(duì)5個(gè)腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化定量，測量DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）以及與細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的基因的蛋白表達(dá)。
結(jié)果：三種Wnt抑制劑SFRP2、SFRP5、WIF1—— Wnt通路的上游基因，以及進(jìn)展調(diào)節(jié)因子PAX6a的甲基化，在接受黑樹莓治療平均4周的病人的正常組織和結(jié)直腸腫瘤中得到了黑樹莓直接的保護(hù)調(diào)節(jié)作用；但該作用并沒有在接受黑樹莓治療1-9周的20個(gè)所有病人身上呈現(xiàn)。這與DNMT1的表達(dá)降低有關(guān)。BRBs以保護(hù)方式調(diào)節(jié)與Wnt通路、增殖、凋亡和血管發(fā)生相關(guān)的基因的表達(dá)。
結(jié)論：這些數(shù)據(jù)提供了BRBs具備使腫瘤抑制基因去甲基化和調(diào)節(jié)人結(jié)直腸腫瘤發(fā)展的其它生物標(biāo)志物的能力的證據(jù)。盡管基因的去甲基化不不是在所有接受黑樹莓治療的患者的結(jié)腸直腸組織中都能發(fā)生，但是具有第二終點(diǎn)的陽性結(jié)果表明，對(duì)于BRBs預(yù)防人類結(jié)腸直腸癌的更多的研究是有必要的。
引言
結(jié)直腸癌是美國男性和女性中發(fā)生率排行第三的癌癥。估計(jì)在2009年將有49920人死于結(jié)直腸癌，大約占癌癥患者死亡數(shù)的9%。在過去二十年中，男性和女性結(jié)直腸癌的死亡率都有所下降，這反映了發(fā)病率下降和疾病早期篩查的增加。這種疾病的5年存活率為64％，并且在確診后10年繼續(xù)下降至57％。對(duì)于診斷時(shí)具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，5年存活率僅為10％。因此，預(yù)防結(jié)腸直腸癌仍然是一個(gè)重要的目標(biāo)，化學(xué)預(yù)防是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的一種方法。
我們研究已經(jīng)表明，在36周的試驗(yàn)中，將含2.5％，5％和10％黑樹莓粉的合成飲食施用于氧化偶氮甲烷（AOM）處理的Fischer 344（F-344）大鼠導(dǎo)致相對(duì)于僅AOM組，腫瘤數(shù)量分別平均降低42％、45％、71%（P<0.05）。 我們還發(fā)現(xiàn)這些相同組中氧化性DNA加合物，8-羥基-20-脫氧鳥苷（8-OHdG）在尿液中水平顯著降低，表明漿果有減少氧化應(yīng)激的能力。BRBs在大鼠結(jié)腸中減少AOM誘導(dǎo)的腫瘤的機(jī)制還沒有研究。然而，在使用亞硝胺誘導(dǎo)的食管鱗狀細(xì)胞癌（SCC）的大鼠模型的研究中，發(fā)現(xiàn)BRB能減少增殖、炎癥和血管生成，并刺激癌前細(xì)胞和組織的凋亡和分化，導(dǎo)致腫瘤發(fā)展減少。與這些細(xì)胞功能相關(guān)的基因也得到了BRBs的保護(hù)。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的DNA甲基化由一系列高度相關(guān)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT1，DNMT3a和DNMT3b）調(diào)節(jié)，其介導(dǎo)甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移至二核苷酸序列CpG中胞嘧啶堿基的5號(hào)位。DNMT1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中充當(dāng)維持DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，并且負(fù)責(zé)在細(xì)胞周期的S期間精確地復(fù)制基因組DNA甲基化模式。相反，DNA的從頭甲基化被認(rèn)為由具有維持和從頭DNA甲基化活性的DNMT3a和DNMT3b酶進(jìn)行。然而，兩組酶顯示在體外表現(xiàn)出一定水平的維持和從頭甲基化，這表明DNMT的這種分類可能被過度簡化。確認(rèn)DNA甲基化在腫瘤發(fā)生中的重要性，研究顯示所有3種DNMT在幾種腫瘤類型中過度表達(dá)，包括結(jié)腸和直腸、膀胱和腎的腫瘤。當(dāng)DNMT1和DNMT3b在結(jié)腸癌細(xì)胞中被敲除時(shí)，腫瘤抑制基因的甲基化或諸如p16基因幾乎完全消除，并且基因重新表達(dá)。因此，DNMT的抑制可導(dǎo)致沉默基因的去甲基化和再活化。DNMT的腫瘤抑制基因的異常甲基化可能是化學(xué)預(yù)防的有希望的目標(biāo)。 DNMT抑制劑目前正在開發(fā)作為癌癥的潛在治療劑。
異常Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt）通路發(fā)生在約85%的散發(fā)性結(jié)腸直腸癌中，并且主要?dú)w因于Apc基因的突變。最近的研究結(jié)果表明Wnt通路在細(xì)胞增殖，分化和干細(xì)胞維持中的重要作用。由于失調(diào)的基因甲基化導(dǎo)致的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的破壞也是人結(jié)腸直腸癌中的常見事件，例如，Wnt負(fù)調(diào)節(jié)因子，分泌的卷曲相關(guān)蛋白2和5（SFRP2和SFRP5）、Wnt抑制因子1（WIF1）的頻繁甲基化。已在異常隱窩灶（ACF）和原發(fā)性結(jié)腸癌細(xì)胞中檢測到SFRP基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化。SFRP在結(jié)腸癌細(xì)胞中的重新表達(dá)阻斷Wnt信號(hào)傳導(dǎo)并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。重要的是，這些事件發(fā)生在結(jié)腸癌細(xì)胞中表現(xiàn)出β-連接蛋白突變，它是Wnt通路中的下游基因。據(jù)報(bào)道在結(jié)腸癌細(xì)胞中p16、CDKN2A—— 一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子、PAX6a—— 一種發(fā)展調(diào)節(jié)因子的沉默，與啟動(dòng)子高甲基化相關(guān)。與DNA堿基的突變變化不同，腫瘤抑制基因的DNA甲基化模式的潛在可逆性表明這些是預(yù)防和/或治療結(jié)腸直腸癌的可行靶標(biāo)。
這項(xiàng)研究的目的是調(diào)查短期BRBs食療對(duì)Wnt抑制劑——SFRP2，SFRP5和WIF1，以及p16和PAX6a的影響，并在人類結(jié)腸直腸癌組織中調(diào)節(jié)DNMT家族酶。漿果對(duì)Wnt通路中下游基因的蛋白表達(dá)的影響，即β-連接蛋白、E-鈣粘蛋白、c-Myc、細(xì)胞增殖標(biāo)志物（Ki-67）、凋亡（TUNEL）、血管生成（CD-105）也都是考察對(duì)象。我們的研究結(jié)果表明，每天口服BRBs持續(xù)平均約4周，在人結(jié)直腸組織中會(huì)產(chǎn)生多表觀遺傳和細(xì)胞生物標(biāo)志物保護(hù)調(diào)節(jié)。這些效應(yīng)好像是結(jié)腸直腸組織局部吸收漿果中的活性物質(zhì)而發(fā)生的。
材料和方法
臨床試驗(yàn)
本實(shí)驗(yàn)中評(píng)估BRBs對(duì)結(jié)腸直腸癌發(fā)展生物標(biāo)志物的影響是由俄亥俄州立大學(xué)綜合癌癥中心的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)和得克薩斯大學(xué)圣安東尼奧分校批準(zhǔn)的。在參與試驗(yàn)之前，從所有患者手中獲得書面知情同意書。該試驗(yàn)中的大多數(shù)患者是被診斷患有結(jié)腸直腸癌的人，并且被送到奧約州立大學(xué)詹姆斯癌癥醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)。因此，為了符合該試驗(yàn)的條件，他們必須同意進(jìn)行第二次結(jié)腸鏡檢查或乙狀結(jié)腸鏡檢查（取決于腫瘤位置）以獲得基線結(jié)腸直腸腫瘤和相鄰的正常組織用于研究。
A：入選標(biāo)準(zhǔn)
試驗(yàn)中的患者有以下情況之一：
i）具有早期結(jié)腸直腸癌（原發(fā)性或復(fù)發(fā)性）的病理診斷的患者，其在結(jié)腸或直腸中具有原發(fā)性損傷，并且被認(rèn)為是選擇性結(jié)腸直腸手術(shù)的候選者。
ii）診斷為IV期結(jié)直腸癌而在肝或腹部具有轉(zhuǎn)移性損害（癌癥病變）的患者也是合格的，條件是原發(fā)性損傷存在于結(jié)腸或直腸中，并且計(jì)劃手術(shù)切除結(jié)直腸病變。
iii）由于大小或其他原因（例如接受抗凝治療），需要進(jìn)行重復(fù)結(jié)腸鏡檢查或乙狀結(jié)腸鏡檢查或手術(shù)切除而無法通過初始結(jié)腸鏡或乙狀結(jié)腸鏡切除的具有結(jié)腸息肉或腺瘤的病理診斷的患者。
iv）外科醫(yī)生慎重判斷認(rèn)為結(jié)直腸惡性腫瘤高可能性的患者，具有諸如貧血，直腸出血，體重減輕，腸運(yùn)動(dòng)習(xí)慣變化，結(jié)腸直腸腫塊的X射線證據(jù)等歷史記錄，這些患者符合要求。
v）如果沒有阻塞性病變或阻塞性癥狀，直腸癌患者在進(jìn)行放化療或手術(shù)前是合格的。
B：排除標(biāo)準(zhǔn)
從試驗(yàn)中排除的患者具有以下之一：
i）阻塞或出血的臨床癥狀，并考慮立即手術(shù)。
ii）直腸癌或阻塞性病變的候選患者，需立即新的輔助性化/放療治療或手術(shù)。
iii）目前正在接受化療或放射治療的患者（自最后一次化療治療后大于4周和放射治療后大于3周）。
iv）服用非甾體抗炎藥（NSAIDs）的患者，由于其臨床癥狀不能停藥。
v）懷孕或哺乳期患者。
vi）具有不受控的、未補(bǔ)償?shù)男呐K，肺或肝臟疾病，或不受控制的傳染病或糖尿病。
黑樹莓
從俄亥俄農(nóng)場購買新鮮冷凍的BRBs（Jewel品種，2004年收獲），并冷凍運(yùn)送到伊利諾斯州莫門斯的范德魯南農(nóng)場，如所述進(jìn)行冷凍干燥。BRBs的營養(yǎng)物分析和包裝詳見補(bǔ)充方法。
黑莓用量管理
一劑20g冷凍干燥的漿果粉末與約100mL水混合，每天口服3次（總共60g /d）持續(xù)1-9周。每天定期服用漿果粉3次，間隔6小時(shí)。60克漿果粉每天接近1.3磅新鮮BRB，相當(dāng)于7％嚙齒動(dòng)物樹莓粉飲食。發(fā)現(xiàn)BRB粉末在大鼠飲食中以2.5％至10％的濃度提供時(shí)，對(duì)大鼠結(jié)腸具有化學(xué)預(yù)防作用。
漿果處理前和漿液處理期間的評(píng)估
起初，給所有患者進(jìn)行身體檢查，在此期間獲得他們的醫(yī)療/手術(shù)史，并且完成了乳酸脫氫酶（LDH），癌胚抗原（CEA），完全血細(xì)胞計(jì)數(shù)（CBC）和完全代謝組的實(shí)驗(yàn)室測試。然后，他們參加了一次24小時(shí)的口頭食物召回，以便在用漿果粉治療之前建立富含酚類食物（包括漿果產(chǎn)品）的消費(fèi)模式。在漿果治療期間，每周評(píng)估患者一次依從性和任何不良事件。在試驗(yàn)期間，要求患者避免使用除黑莓粉之外的漿果類型。
組織和尿液收集
所有入選試驗(yàn)的患者在進(jìn)入試驗(yàn)前都診斷為結(jié)腸直腸癌。 因?yàn)橛糜诔跏荚\斷的組織不可用于研究，所以有必要在漿果治療患者之前獲得另外的組織標(biāo)本。最初，患者簽署了同意書，之后他們停止使用NSAIDs。大約5天后，從結(jié)直腸癌患者體內(nèi)取三個(gè)活體樣本，每一個(gè)毗鄰于正常組織（距離腫瘤組織小于2nm的位置）和腫瘤組織。將每份活體樣本的一半置于10％福爾馬林緩沖液中，另一半在液氮中冷凍?；颊咴诓杉M織活檢后約24小時(shí)開始每天服用BRBs粉末，并直到手術(shù)去除腫瘤前12-36小時(shí)。在手術(shù)時(shí)，從每個(gè)患者體內(nèi)取出毗鄰正常和腫瘤組織的另外3個(gè)活體樣本，并如預(yù)處理活檢所述那樣放置在緩沖的福爾馬林中或冷凍。所有組織標(biāo)本由醫(yī)學(xué)病理學(xué)家W. Frankel博士在組織病理學(xué)上分類為正?；蚰[瘤組織。所有腫瘤均為腺瘤。
在基線水平和漿果處理后收集了治療前和治療后的尿液樣本（每個(gè)約50mL）。 為了確保漿果花色苷的穩(wěn)定性，將樣本加入5％三氟乙酸降低PH至酸性后保存在-80℃。
測量結(jié)直腸組織和尿中的漿果花色苷
在補(bǔ)充方法中詳述了樣品制備和HPLC-MS / MS分析和花青素的定量。
DNA甲基化的分析
A. DNA提取和亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。相鄰的正常和腫瘤組織用于提取基因組DNA，如補(bǔ)充方法中所述。
B. 質(zhì)量序列。高通量MassARRAY用于定量p16，PAX6a，SFRP2，SFRP5和WIF1的CpG島的甲基化水平，如補(bǔ)充方法中所詳述。
C. 焦磷酸測序。使用LINE-1重復(fù)元件亞硫酸氫鹽/焦磷酸測序來評(píng)估整體的甲基化水平，如補(bǔ)充方法中所詳述。
免疫組織化學(xué)染色和計(jì)算機(jī)輔助圖像分析
免疫組織化學(xué)染色程序和β-連環(huán)蛋白，E-鈣粘蛋白，c-Myc，Ki-67，TUNEL，p16，CD105或DNMT1的染色定量在補(bǔ)充方法中詳述。
統(tǒng)計(jì)分析
通過確定漿果治療前后和每個(gè)相對(duì)于基線的變量的百分比改變，來定量甲基化和免疫組織化學(xué)染色數(shù)據(jù)。通過Student’s t-檢驗(yàn)比較治療前后平均值、百分比變化和花青素水平的差異。所有分析均為雙側(cè)的，小于0.05的P值被認(rèn)為是顯著的。使用線性回歸確定甲基化的百分比改變和DNMT1表達(dá)百分比改變、漿果劑量和年齡變化之間的相關(guān)性。
結(jié)果
患者特征
20名患者參與試驗(yàn)，其特征總結(jié)在表1中。17名患者來于俄亥俄州立大學(xué)，3名來自圣安東尼奧得克薩斯大學(xué)。20例患者中有17例為男性，平均年齡為59歲。6名患者有結(jié)腸癌（30％），另14名（70％）患有直腸癌。兩名患者有轉(zhuǎn)移性疾病。
漿果治療和依從性
患者口服樹莓粉治療1~9周?；颊邔?duì)漿果治療的依從性非常好，基于返回的空袋和自我報(bào)告，每個(gè)患者都服用了規(guī)定日劑量的90%以上。漿果粉末通常耐受性良好，7名患者出現(xiàn)胃腸道的輕度干擾，即腹瀉和便秘，在2-3天內(nèi)消退。在研究期間，BRB治療不改變患者LDH，CBC，CEA和代謝特征
分析尿液和結(jié)直腸組織中花青素
漿果治療前任何患者的尿液中都不存在花青素，20名患者漿果治療后尿液中檢測到4種花青素（補(bǔ)充表S1）。4種花青素的范圍在56.2~1822 pmol/ml之間。20名患者中的18個(gè)結(jié)直腸組織中也檢測到4種花青素，然而，量遠(yuǎn)低于尿液中的量，范圍在1.7~2011.5 fmol/mg 組織。（補(bǔ)充表S1）。毗鄰正常組織中花青素含量299.9±754.9 fmol/mg，腫瘤組織55.4±60.8 fmol/mg（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）；相鄰正常組織中的花青素水平與腫瘤組織中的花青素水平?jīng)]有顯著差異（P = 0.21）。
BRBs對(duì)腫瘤抑制基因啟動(dòng)子去甲基化和DNMT1蛋白表達(dá)的影響
來自所有20個(gè)患者的相鄰正常和結(jié)腸直腸腫瘤組織的聯(lián)合甲基化數(shù)據(jù)的初步分析表明，BRB治療不同時(shí)間段（1~9周;平均=3周）未能對(duì)SFRP2、PAX6a、p16、SFRP5和WIF1的啟動(dòng)子甲基化產(chǎn)生顯著影響，也未能對(duì)結(jié)腸直腸腫瘤（腺癌）組織中的LINE-1重復(fù)元件產(chǎn)生顯著影響（圖1）。事實(shí)上，觀察到的唯一顯著效應(yīng)是在毗鄰正常組織中SFRP2和SFRP5啟動(dòng)子甲基化減少。從圖1顯而易見的是，漿果治療對(duì)毗鄰正常和腫瘤組織中的基因的啟動(dòng)子甲基化的影響從一個(gè)患者到另一個(gè)患者是非常不同的。
然而，當(dāng)患者基于下述方式分組時(shí)，觀察到了這些基因啟動(dòng)子甲基化的顯著差異：（a）攝入的樹莓總量，（b）DNMT1蛋白表達(dá)的變化程度。來自毗鄰正常組織的分析的數(shù)據(jù)顯示在圖2中。N/H是指從接受平均83個(gè)漿果劑量（~4周的治療）的患者體內(nèi)取得的毗鄰正常組織。N/L是指從接受平均52個(gè)漿果劑量（~2周的治療）的患者體內(nèi)取得的毗鄰正常組織。圖2顯示與N/L組織相比，N/H組織中SFRP2和PAX6a腫瘤抑制基因以及DNMT1蛋白表達(dá)相對(duì)基線，甲基化百分比顯著降低。標(biāo)記為“全部”的框表示，N/H組對(duì)比N/L組，所有5種腫瘤抑制基因（SFRP2，PAX6a，p16，SFRP5和WIF1）組合的甲基化水平降低。
圖3顯示出了來自接受不同劑量漿果的患者的結(jié)腸直腸腺癌的分析數(shù)據(jù)。T/H是指從接受平均85個(gè)漿果劑量（~4周的治療）的患者體內(nèi)取得的腺癌。T/L是指從接受平均53個(gè)漿果劑量（~2周治療）的患者體內(nèi)取得的腺癌。在T/H組腫瘤相對(duì)與T/L組腫瘤中，觀察到SFRP2，PAX6a和WIF1基因的甲基化變化以及DNMT1蛋白表達(dá)對(duì)于基線的百分比顯著降低。當(dāng)將來自所有5種抑制基因的啟動(dòng)子甲基化數(shù)據(jù)組合時(shí)，T/H腫瘤數(shù)據(jù)與T/L腫瘤數(shù)據(jù)有著顯著不同。這些結(jié)果表明腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子甲基化和DNMT1蛋白表達(dá)的變化程度受到攝入的BRB粉末的總劑量的影響。
結(jié)果
患者特征
20名患者參與試驗(yàn)，其特征總結(jié)在表1中。17名患者來于俄亥俄州立大學(xué)，3名來自圣安東尼奧得克薩斯大學(xué)。20例患者中有17例為男性，平均年齡為59歲。6名患者有結(jié)腸癌（30％），另14名（70％）患有直腸癌。兩名患者有轉(zhuǎn)移性疾病。
漿果治療和依從性
患者口服樹莓粉治療1~9周?；颊邔?duì)漿果治療的依從性非常好，基于返回的空袋和自我報(bào)告，每個(gè)患者都服用了規(guī)定日劑量的90%以上。漿果粉末通常耐受性良好，7名患者出現(xiàn)胃腸道的輕度干擾，即腹瀉和便秘，在2-3天內(nèi)消退。在研究期間，BRB治療不改變患者LDH，CBC，CEA和代謝特征
分析尿液和結(jié)直腸組織中花青素
漿果治療前任何患者的尿液中都不存在花青素，20名患者漿果治療后尿液中檢測到4種花青素（補(bǔ)充表S1）。4種花青素的范圍在56.2~1822 pmol/ml之間。20名患者中的18個(gè)結(jié)直腸組織中也檢測到4種花青素，然而，量遠(yuǎn)低于尿液中的量，范圍在1.7~2011.5 fmol/mg 組織。（補(bǔ)充表S1）。毗鄰正常組織中花青素含量299.9±754.9 fmol/mg，腫瘤組織55.4±60.8 fmol/mg（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）；相鄰正常組織中的花青素水平與腫瘤組織中的花青素水平?jīng)]有顯著差異（P = 0.21）。
BRBs對(duì)腫瘤抑制基因啟動(dòng)子去甲基化和DNMT1蛋白表達(dá)的影響
來自所有20個(gè)患者的相鄰正常和結(jié)腸直腸腫瘤組織的聯(lián)合甲基化數(shù)據(jù)的初步分析表明，BRB治療不同時(shí)間段（1~9周;平均=3周）未能對(duì)SFRP2、PAX6a、p16、SFRP5和WIF1的啟動(dòng)子甲基化產(chǎn)生顯著影響，也未能對(duì)結(jié)腸直腸腫瘤（腺癌）組織中的LINE-1重復(fù)元件產(chǎn)生顯著影響（圖1）。事實(shí)上，觀察到的唯一顯著效應(yīng)是在毗鄰正常組織中SFRP2和SFRP5啟動(dòng)子甲基化減少。從圖1顯而易見的是，漿果治療對(duì)毗鄰正常和腫瘤組織中的基因的啟動(dòng)子甲基化的影響從一個(gè)患者到另一個(gè)患者是非常不同的。
然而，當(dāng)患者基于下述方式分組時(shí)，觀察到了這些基因啟動(dòng)子甲基化的顯著差異：（a）攝入的樹莓總量，（b）DNMT1蛋白表達(dá)的變化程度。來自毗鄰正常組織的分析的數(shù)據(jù)顯示在圖2中。N/H是指從接受平均83個(gè)漿果劑量（~4周的治療）的患者體內(nèi)取得的毗鄰正常組織。N/L是指從接受平均52個(gè)漿果劑量（~2周的治療）的患者體內(nèi)取得的毗鄰正常組織。圖2顯示與N/L組織相比，N/H組織中SFRP2和PAX6a腫瘤抑制基因以及DNMT1蛋白表達(dá)相對(duì)基線，甲基化百分比顯著降低。標(biāo)記為“全部”的框表示，N/H組對(duì)比N/L組，所有5種腫瘤抑制基因（SFRP2，PAX6a，p16，SFRP5和WIF1）組合的甲基化水平降低。
圖3顯示出了來自接受不同劑量漿果的患者的結(jié)腸直腸腺癌的分析數(shù)據(jù)。T/H是指從接受平均85個(gè)漿果劑量（~4周的治療）的患者體內(nèi)取得的腺癌。T/L是指從接受平均53個(gè)漿果劑量（~2周治療）的患者體內(nèi)取得的腺癌。在T/H組腫瘤相對(duì)與T/L組腫瘤中，觀察到SFRP2，PAX6a和WIF1基因的甲基化變化以及DNMT1蛋白表達(dá)對(duì)于基線的百分比顯著降低。當(dāng)將來自所有5種抑制基因的啟動(dòng)子甲基化數(shù)據(jù)組合時(shí)，T/H腫瘤數(shù)據(jù)與T/L腫瘤數(shù)據(jù)有著顯著不同。這些結(jié)果表明腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子甲基化和DNMT1蛋白表達(dá)的變化程度受到攝入的BRB粉末的總劑量的影響。
在圖2B和3B的熱圖中，綠色和紅色分別描繪了甲基化的減少和增加。當(dāng)比較這些數(shù)字時(shí)，如綠色相對(duì)量所顯示的證據(jù)，毗鄰的正常結(jié)直腸組織通常比結(jié)直腸腺癌組織對(duì)漿果誘導(dǎo)的啟動(dòng)子去甲基化的相應(yīng)更有利。此外，DNMT1蛋白表達(dá)和啟動(dòng)子甲基化的變化之間存在正相關(guān)（圖4A，P=0.006，R2=0.181）。一般來說，用BRBs治療~4周（高劑量），不是~2周（低劑量），能導(dǎo)致毗鄰正常和腺瘤組織中啟動(dòng)子甲基化減少，如圖4B所示（P=0.035，R2=0.118）。通過LINE-1重復(fù)元件亞硫酸氫鹽/焦磷酸測序測定的高劑量組和低劑量組并沒有引起毗鄰正常組織或結(jié)直腸腫瘤組織全甲基化水平相對(duì)基線的顯著變化（圖4c）。用高劑量或低劑量漿果（補(bǔ)充圖S1A）治療的患者的年齡沒有顯著差異，漿果誘導(dǎo)的啟動(dòng)子甲基化變化非年齡依賴（補(bǔ)充圖S1B）。
結(jié)直腸組織對(duì)樹莓粉治療的應(yīng)答不同
由于口服時(shí)暴露于BRBs化合物的情況，結(jié)腸組織可能不同于直腸組織，故我們相信毗鄰的正常和結(jié)腸腫瘤組織對(duì)漿果治療帶來的去甲基化的應(yīng)答效應(yīng)可能不同于毗鄰的正常和直腸腫瘤組織。圖4D描繪了高劑量治療組（N/H）和低劑量治療組（N/L）在毗鄰的正常結(jié)直腸組織中的所有5種腫瘤抑制基因（SFRP2，PAX6a，p16，SFRP5和WIF1）組合中，甲基化水平相對(duì)于基線的變化百分比。當(dāng)比較兩個(gè)劑量組的毗鄰正常組織時(shí)，高劑量治療組相對(duì)于低劑量治療組，僅直腸組織中的甲基化變化是顯著不同的（圖4D，P = 0.011）。使用腫瘤標(biāo)本獲得相似的結(jié)果，T/H治療組直腸腫瘤的甲基化水平變化與T/L組顯著不同（圖4E，P <0.0001）。 有趣的是，位于結(jié)腸中的T / L組腫瘤對(duì)BRB的響應(yīng)比直腸中的更好。
BRBs對(duì)Wnt信號(hào)，細(xì)胞增殖，凋亡，血管生成和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的作用
使用定量免疫組化測量毗鄰正常和結(jié)直腸腫瘤組織蛋白的表達(dá)：包括同Wnt途徑相關(guān)的三種蛋白（β-連環(huán)蛋白，E-鈣粘蛋白，c-Myc）；同細(xì)胞增殖（Ki-67）相關(guān)的蛋白；同細(xì)胞凋亡（TUNEL）、血管生成（CD105）、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)（p16）相關(guān)的蛋白。這些蛋白質(zhì)的代表性染色顯示在圖5A中。來自所有20名患者的BRBs治療1-9周前后的數(shù)據(jù)組合表明，漿果保護(hù)性調(diào)節(jié)結(jié)直腸腫瘤組織中的β-連環(huán)蛋白、Ki-67、TUNEL、CD105和DNMT1，以及毗鄰正常組織中的CD105和DNMT1（圖5B）。
把這些組織生物標(biāo)志物的效用作為攝入總劑量的函數(shù)來評(píng)價(jià)BRB時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們也是有效的。在毗鄰正常組織中，高劑量（N/H；~4周治療）與低劑量（N/L；~2周）相比，漿果治療后導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白表達(dá)的減少、E-鈣粘蛋白表達(dá)的增加（圖6A，P<0.05）。與N/L組相比，在N/H組伴隨著Ki-67蛋白表達(dá)的降低、TUNEL染色的增加（P <0.05）。在N/H和N/L兩組中，CD105降低、p16增加，但組間差異不顯著（P> 0.05）。
在結(jié)直腸腺癌中，相對(duì)于T/L組織，BRBs治療導(dǎo)致T/H組織中β-catenin、Ki-67和CD105蛋白的表達(dá)百分比相對(duì)于基線顯著降低，而TUNEL和p16的表達(dá)增加（圖6B）。同樣，這些數(shù)據(jù)表明對(duì)BRB的應(yīng)答與累積漿果劑量有關(guān)。
由于口服時(shí)暴露于BRBs化合物的情況，結(jié)腸組織可能不同于直腸組織，故我們相信毗鄰的正常和結(jié)腸腫瘤組織對(duì)漿果治療帶來的去甲基化的應(yīng)答效應(yīng)可能不同于毗鄰的正常和直腸腫瘤組織。圖4D描繪了高劑量治療組（N/H）和低劑量治療組（N/L）在毗鄰的正常結(jié)直腸組織中的所有5種腫瘤抑制基因（SFRP2，PAX6a，p16，SFRP5和WIF1）組合中，甲基化水平相對(duì)于基線的變化百分比。當(dāng)比較兩個(gè)劑量組的毗鄰正常組織時(shí)，高劑量治療組相對(duì)于低劑量治療組，僅直腸組織中的甲基化變化是顯著不同的（圖4D，P = 0.011）。使用腫瘤標(biāo)本獲得相似的結(jié)果，T/H治療組直腸腫瘤的甲基化水平變化與T/L組顯著不同（圖4E，P <0.0001）。 有趣的是，位于結(jié)腸中的T / L組腫瘤對(duì)BRB的響應(yīng)比直腸中的更好。
BRBs對(duì)Wnt信號(hào)，細(xì)胞增殖，凋亡，血管生成和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的作用
使用定量免疫組化測量毗鄰正常和結(jié)直腸腫瘤組織蛋白的表達(dá)：包括同Wnt途徑相關(guān)的三種蛋白（β-連環(huán)蛋白，E-鈣粘蛋白，c-Myc）；同細(xì)胞增殖（Ki-67）相關(guān)的蛋白；同細(xì)胞凋亡（TUNEL）、血管生成（CD105）、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)（p16）相關(guān)的蛋白。這些蛋白質(zhì)的代表性染色顯示在圖5A中。來自所有20名患者的BRBs治療1-9周前后的數(shù)據(jù)組合表明，漿果保護(hù)性調(diào)節(jié)結(jié)直腸腫瘤組織中的β-連環(huán)蛋白、Ki-67、TUNEL、CD105和DNMT1，以及毗鄰正常組織中的CD105和DNMT1（圖5B）。
把這些組織生物標(biāo)志物的效用作為攝入總劑量的函數(shù)來評(píng)價(jià)BRB時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們也是有效的。在毗鄰正常組織中，高劑量（N/H；~4周治療）與低劑量（N/L；~2周）相比，漿果治療后導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白表達(dá)的減少、E-鈣粘蛋白表達(dá)的增加（圖6A，P<0.05）。與N/L組相比，在N/H組伴隨著Ki-67蛋白表達(dá)的降低、TUNEL染色的增加（P <0.05）。在N/H和N/L兩組中，CD105降低、p16增加，但組間差異不顯著（P> 0.05）。
在結(jié)直腸腺癌中，相對(duì)于T/L組織，BRBs治療導(dǎo)致T/H組織中β-catenin、Ki-67和CD105蛋白的表達(dá)百分比相對(duì)于基線顯著降低，而TUNEL和p16的表達(dá)增加（圖6B）。同樣，這些數(shù)據(jù)表明對(duì)BRB的應(yīng)答與累積漿果劑量有關(guān)。
討論
該研究的結(jié)果表明，用BRBs治療的結(jié)腸直腸癌患者后，導(dǎo)致結(jié)直腸腺癌和毗鄰正常組織中的遺傳和表觀遺傳生物標(biāo)志物的陽性調(diào)節(jié)。分析生物標(biāo)志物如Ki-67，TUNEL，β-catenin，CD105和DNMT1的免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)表明，這些標(biāo)志物在BRBs治療后的所有20名患者的組織中被保護(hù)性調(diào)節(jié)。相比之下，DNA甲基化標(biāo)記物的陽性調(diào)節(jié)僅發(fā)生在用BRB治療平均4周（高劑量）的患者的組織中，表明漿果治療必須發(fā)生更長的時(shí)間段才起效。這些差異的原因可能與以下事實(shí)有關(guān)：包含多種細(xì)胞類型的全組織標(biāo)本被用于甲基化研究，而免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)主要來自對(duì)上皮的分析。因此，如果漿果的影響在上皮中比在其他組織（例如基質(zhì)）中更明顯，則可以預(yù)期使用免疫組織化學(xué)標(biāo)記更容易地檢測漿果效應(yīng)。還有可能的是，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶如DNMT1的抑制可能僅發(fā)生在用漿果長時(shí)間治療后。這些觀察表明BRBs在長期的II和III臨床試驗(yàn)條件下，可能有效調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子甲基化，此時(shí)可能需要漿果治療幾個(gè)月到幾年時(shí)間。還應(yīng)指出，雖然我們盡力平等地招募男人和女人參加我們的實(shí)驗(yàn)，但我們發(fā)現(xiàn)男人更樂意參與。然而，我們將作出更多努力，以減少今后實(shí)驗(yàn)中的性別不平衡。
目前的研究結(jié)果表明：拋除其它作用機(jī)理，BRBs可能具有抑制DNA甲基化的潛力。當(dāng)以高的日劑量向人口服給藥時(shí)，BRB引起很小或沒有毒性，這使得它非常適合用作化學(xué)預(yù)防。此外最近研究得出，在家族性腺瘤性息肉病患者當(dāng)中口服施用BRBs粉末（60g/d，相當(dāng)于約1.3磅新鮮漿果）9個(gè)月，僅在一些患者中產(chǎn)生輕微的胃腸道紊亂，在2 -3天后消除。
該研究的結(jié)果表明，用BRBs治療的結(jié)腸直腸癌患者后，導(dǎo)致結(jié)直腸腺癌和毗鄰正常組織中的遺傳和表觀遺傳生物標(biāo)志物的陽性調(diào)節(jié)。分析生物標(biāo)志物如Ki-67，TUNEL，β-catenin，CD105和DNMT1的免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)表明，這些標(biāo)志物在BRBs治療后的所有20名患者的組織中被保護(hù)性調(diào)節(jié)。相比之下，DNA甲基化標(biāo)記物的陽性調(diào)節(jié)僅發(fā)生在用BRB治療平均4周（高劑量）的患者的組織中，表明漿果治療必須發(fā)生更長的時(shí)間段才起效。這些差異的原因可能與以下事實(shí)有關(guān)：包含多種細(xì)胞類型的全組織標(biāo)本被用于甲基化研究，而免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)主要來自對(duì)上皮的分析。因此，如果漿果的影響在上皮中比在其他組織（例如基質(zhì)）中更明顯，則可以預(yù)期使用免疫組織化學(xué)標(biāo)記更容易地檢測漿果效應(yīng)。還有可能的是，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶如DNMT1的抑制可能僅發(fā)生在用漿果長時(shí)間治療后。這些觀察表明BRBs在長期的II和III臨床試驗(yàn)條件下，可能有效調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子甲基化，此時(shí)可能需要漿果治療幾個(gè)月到幾年時(shí)間。還應(yīng)指出，雖然我們盡力平等地招募男人和女人參加我們的實(shí)驗(yàn)，但我們發(fā)現(xiàn)男人更樂意參與。然而，我們將作出更多努力，以減少今后實(shí)驗(yàn)中的性別不平衡。
目前的研究結(jié)果表明：拋除其它作用機(jī)理，BRBs可能具有抑制DNA甲基化的潛力。當(dāng)以高的日劑量向人口服給藥時(shí)，BRB引起很小或沒有毒性，這使得它非常適合用作化學(xué)預(yù)防。此外最近研究得出，在家族性腺瘤性息肉病患者當(dāng)中口服施用BRBs粉末（60g/d，相當(dāng)于約1.3磅新鮮漿果）9個(gè)月，僅在一些患者中產(chǎn)生輕微的胃腸道紊亂，在2 -3天后消除。
雖然全DNA低甲基化同癌癥細(xì)胞中導(dǎo)致染色質(zhì)不穩(wěn)定的染色質(zhì)重組和核解體密切關(guān)聯(lián)，但全DNA低甲基化在動(dòng)物體的影響一直有爭議。例如，與動(dòng)物體腸腫瘤發(fā)生的總體抑制相反，低甲基化導(dǎo)致多灶性肝腫瘤的發(fā)展。這些結(jié)果清楚地證明DNA低甲基化對(duì)腸和肝癌產(chǎn)生的相反作用。在人類中，一項(xiàng)研究癌癥細(xì)胞系全低甲基化，包括乳腺癌，中樞神經(jīng)系統(tǒng)，結(jié)腸，白血病，肝，肺，卵巢和前列腺的研究結(jié)果顯示，85％的測試細(xì)胞系（51/60）都是低甲基化的。有意思的是，當(dāng)結(jié)直腸癌與其毗鄰組織比較時(shí)，結(jié)直腸癌細(xì)胞全甲基化是高度可變的，可以增加、不變或降低；在具有微衛(wèi)星不穩(wěn)定的癌癥中全低甲基化部分逆轉(zhuǎn)，這也許反應(yīng)了癌癥進(jìn)展有其它路徑。因此，全DNA低甲基化在癌癥中的概念可能太過簡化；致癌作用中全DNA甲基化模式的改變是由于器官和腫瘤類型的特異性。DNA甲基化抑制劑引起啟動(dòng)子和全局重復(fù)序列中的低甲基化，因此它們發(fā)揮治療活性。
此外，根據(jù)Issa（人名）的研究，盡管腫瘤抑制基因的去甲基化可能具有有益的作用，癌基因的甲基化降低可導(dǎo)致它們的再活化和隨后的不良作用。然而，低甲基化劑的治療效果這可能是基于這樣的事實(shí)：比起正常成熟細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞更依賴于基因沉默以保持其表型。因此，降低甲基化的總體效果似乎是積極的。此外，甲基化是年齡相關(guān)的，并且年齡相關(guān)的甲基化似乎是基因和組織特異性的。然而，一些基因（例如p16、SFRP2、與DNA修復(fù)相關(guān)基因）的甲基化不受年齡的影響；而是它們的甲基化水平隨著癌癥進(jìn)展而增加。結(jié)直腸癌尤其如此。
在本研究中，BRBs對(duì)SFRP2、SFRP5、WIF1、p16和PAX6a基因的啟動(dòng)子甲基化顯示不同的影響。例如，盡管BRB降低了N/H相對(duì)N/L組中SFRP2和PAX6a基因的甲基化（圖2），但是它們對(duì)同組中其他3種基因的甲基化沒有影響。因此，看來BRBs對(duì)不同基因的甲基化的作用表現(xiàn)出一些選擇性；但是，數(shù)據(jù)是初步的，且該作用的機(jī)制是未知的。
BRBs對(duì)基因去甲基化的影響可能是通過將漿果活性化合物局部吸收到結(jié)直腸組織中。這通過在漿果治療后的結(jié)直腸組織中BRB花青素的檢測（盡管處于低水平）來證明?；诨ㄇ嗨氐幕ㄇ嗨氐拇x物包括原兒茶酸（細(xì)胞培養(yǎng)中的主要降解產(chǎn)物），以及2,4-二羥基苯甲酸和2,4,6-三羥基苯甲酸。該研究報(bào)道了50mM的原兒茶酸發(fā)揮抗氧化活性，而不是其他兩個(gè)代謝產(chǎn)物。我們正在確定這些代謝物是否可以在動(dòng)物和人類的血液中檢測到?；颊呓Y(jié)直腸組織中檢出的花色素含量變化巨大（1.7~2011.5 fmol/mg），這可能是由于患者術(shù)前（12~36h）最后一次給藥是在不同時(shí)間。因此，生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)不能與花青素水平相關(guān)。藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，在口服施用漿果粉末后，BRB花青素分別在1和4小時(shí)時(shí)在血液和尿液中達(dá)到峰值水平。因此，可以預(yù)期在手術(shù)前長達(dá)12-36小時(shí)食用漿果的患者結(jié)直腸組織中花色素水平的大差異。
致癌作用的“場效應(yīng)”模型表明，與腫瘤毗鄰的細(xì)胞至少存在腫瘤本身中存在的一些遺傳改變。事實(shí)上，毗鄰正常組織中的表觀遺傳改變與人類結(jié)腸和乳腺中的癌癥進(jìn)展相關(guān)。然而，如圖1,2,5和6所示，BRB帶來腫瘤抑制基因的去甲基化和相鄰“正常”結(jié)直腸組織中的細(xì)胞增殖和凋亡生物標(biāo)志物的保護(hù)性調(diào)節(jié)，其可以很好地將這些組織恢復(fù)到更高程度的“正常”。
總之，我們的研究結(jié)果表明BRBs保護(hù)性調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌患者組織中基因和表觀遺傳的生物標(biāo)志物。漿果似乎對(duì)Wnt通路上游腫瘤抑制基因（SFRP2和WIF1）去甲基化，并保護(hù)性調(diào)節(jié)Wnt通路下游的基因（b-連環(huán)蛋白，E-鈣粘蛋白）的表達(dá)?；蛉ゼ谆赡苁荄NMT1抑制的結(jié)果，雖然其他甲基轉(zhuǎn)移酶也可能受到影響。結(jié)腸和直腸組織對(duì)漿果治療表現(xiàn)出不同響應(yīng)；特別是直腸癌患者短期服用BRBs（~2周）已經(jīng)降低了應(yīng)答。這表明長期服用漿果治療結(jié)直腸癌患者可能是有益的。它還顯示了，如果開發(fā)用于將漿果局部遞送至直腸組織的方法，則BRB可能在直腸腫瘤患者中更有效。
雖然BRBs對(duì)腫瘤抑制基因去甲基化的能力得到數(shù)據(jù)的支持，初級(jí)終點(diǎn)的事實(shí)；即20名患者組織去甲基化總體上并不是陽性，意味著需要謹(jǐn)慎解釋數(shù)據(jù)。此外，鑒于甲基化不是結(jié)直腸癌化學(xué)預(yù)防的有效終點(diǎn)，必須謹(jǐn)慎地推斷這些結(jié)果。雖然我們不推薦漿果用于癌癥治療，當(dāng)然不能代替標(biāo)準(zhǔn)的治療方法，但是它們可以被考慮與其它治療方式（例如化療，免疫療，放射療和/或手術(shù)）組合使用?；蛘撸_定在結(jié)直腸癌治療后常規(guī)地進(jìn)行BRBs的飲食消費(fèi)是否降低復(fù)發(fā)性疾病的風(fēng)險(xiǎn)將是十分有趣的。
致謝
我們感謝Sara Olivarri幫助患者在德克薩斯大學(xué)圣安東尼奧大學(xué)進(jìn)行試驗(yàn)，我們還感謝俄亥俄州立大學(xué)的綜合癌癥中心組織采購共享資源（CCCTPSR）處理這項(xiàng)研究的標(biāo)本。最后，我們感謝所有患者參與此試驗(yàn)。
原文鏈接：
http://clincancerres.aacrjournals.org/content/17/3/598.full-text.pdf
此外，根據(jù)Issa（人名）的研究，盡管腫瘤抑制基因的去甲基化可能具有有益的作用，癌基因的甲基化降低可導(dǎo)致它們的再活化和隨后的不良作用。然而，低甲基化劑的治療效果這可能是基于這樣的事實(shí)：比起正常成熟細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞更依賴于基因沉默以保持其表型。因此，降低甲基化的總體效果似乎是積極的。此外，甲基化是年齡相關(guān)的，并且年齡相關(guān)的甲基化似乎是基因和組織特異性的。然而，一些基因（例如p16、SFRP2、與DNA修復(fù)相關(guān)基因）的甲基化不受年齡的影響；而是它們的甲基化水平隨著癌癥進(jìn)展而增加。結(jié)直腸癌尤其如此。
在本研究中，BRBs對(duì)SFRP2、SFRP5、WIF1、p16和PAX6a基因的啟動(dòng)子甲基化顯示不同的影響。例如，盡管BRB降低了N/H相對(duì)N/L組中SFRP2和PAX6a基因的甲基化（圖2），但是它們對(duì)同組中其他3種基因的甲基化沒有影響。因此，看來BRBs對(duì)不同基因的甲基化的作用表現(xiàn)出一些選擇性；但是，數(shù)據(jù)是初步的，且該作用的機(jī)制是未知的。
BRBs對(duì)基因去甲基化的影響可能是通過將漿果活性化合物局部吸收到結(jié)直腸組織中。這通過在漿果治療后的結(jié)直腸組織中BRB花青素的檢測（盡管處于低水平）來證明?；诨ㄇ嗨氐幕ㄇ嗨氐拇x物包括原兒茶酸（細(xì)胞培養(yǎng)中的主要降解產(chǎn)物），以及2,4-二羥基苯甲酸和2,4,6-三羥基苯甲酸。該研究報(bào)道了50mM的原兒茶酸發(fā)揮抗氧化活性，而不是其他兩個(gè)代謝產(chǎn)物。我們正在確定這些代謝物是否可以在動(dòng)物和人類的血液中檢測到?；颊呓Y(jié)直腸組織中檢出的花色素含量變化巨大（1.7~2011.5 fmol/mg），這可能是由于患者術(shù)前（12~36h）最后一次給藥是在不同時(shí)間。因此，生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)不能與花青素水平相關(guān)。藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，在口服施用漿果粉末后，BRB花青素分別在1和4小時(shí)時(shí)在血液和尿液中達(dá)到峰值水平。因此，可以預(yù)期在手術(shù)前長達(dá)12-36小時(shí)食用漿果的患者結(jié)直腸組織中花色素水平的大差異。
致癌作用的“場效應(yīng)”模型表明，與腫瘤毗鄰的細(xì)胞至少存在腫瘤本身中存在的一些遺傳改變。事實(shí)上，毗鄰正常組織中的表觀遺傳改變與人類結(jié)腸和乳腺中的癌癥進(jìn)展相關(guān)。然而，如圖1,2,5和6所示，BRB帶來腫瘤抑制基因的去甲基化和相鄰“正常”結(jié)直腸組織中的細(xì)胞增殖和凋亡生物標(biāo)志物的保護(hù)性調(diào)節(jié)，其可以很好地將這些組織恢復(fù)到更高程度的“正常”。
總之，我們的研究結(jié)果表明BRBs保護(hù)性調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌患者組織中基因和表觀遺傳的生物標(biāo)志物。漿果似乎對(duì)Wnt通路上游腫瘤抑制基因（SFRP2和WIF1）去甲基化，并保護(hù)性調(diào)節(jié)Wnt通路下游的基因（b-連環(huán)蛋白，E-鈣粘蛋白）的表達(dá)?；蛉ゼ谆赡苁荄NMT1抑制的結(jié)果，雖然其他甲基轉(zhuǎn)移酶也可能受到影響。結(jié)腸和直腸組織對(duì)漿果治療表現(xiàn)出不同響應(yīng)；特別是直腸癌患者短期服用BRBs（~2周）已經(jīng)降低了應(yīng)答。這表明長期服用漿果治療結(jié)直腸癌患者可能是有益的。它還顯示了，如果開發(fā)用于將漿果局部遞送至直腸組織的方法，則BRB可能在直腸腫瘤患者中更有效。
雖然BRBs對(duì)腫瘤抑制基因去甲基化的能力得到數(shù)據(jù)的支持，初級(jí)終點(diǎn)的事實(shí)；即20名患者組織去甲基化總體上并不是陽性，意味著需要謹(jǐn)慎解釋數(shù)據(jù)。此外，鑒于甲基化不是結(jié)直腸癌化學(xué)預(yù)防的有效終點(diǎn)，必須謹(jǐn)慎地推斷這些結(jié)果。雖然我們不推薦漿果用于癌癥治療，當(dāng)然不能代替標(biāo)準(zhǔn)的治療方法，但是它們可以被考慮與其它治療方式（例如化療，免疫療，放射療和/或手術(shù)）組合使用?；蛘撸_定在結(jié)直腸癌治療后常規(guī)地進(jìn)行BRBs的飲食消費(fèi)是否降低復(fù)發(fā)性疾病的風(fēng)險(xiǎn)將是十分有趣的。
致謝
我們感謝Sara Olivarri幫助患者在德克薩斯大學(xué)圣安東尼奧大學(xué)進(jìn)行試驗(yàn)，我們還感謝俄亥俄州立大學(xué)的綜合癌癥中心組織采購共享資源（CCCTPSR）處理這項(xiàng)研究的標(biāo)本。最后，我們感謝所有患者參與此試驗(yàn)。
原文鏈接：
http://clincancerres.aacrjournals.org/content/17/3/598.full-text.pdf
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