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黑樹(shù)莓花青素靶向調(diào)控miR-338-5p/SIRT1 相關(guān)信號(hào)通路對(duì)結(jié)直腸癌的化學(xué)預(yù)防作用
發(fā)表于：2019-01-02 作者：admin 來(lái)源：本站 點(diǎn)擊量：19080
郭 君 1，毛麗萍1，李倩倩1，張秋華2，李曉龍3，畢秀麗1*
1. 遼寧大學(xué)生命科學(xué)院生物技術(shù)系，遼寧沈陽(yáng) 110036
2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理系，遼寧 沈陽(yáng) 110847
3. 深圳福山生物科技有限公司，廣東深圳 518000
摘 要：
目的：研究 miR-338-5p/SIRT1 相關(guān)信號(hào)通路在黑樹(shù)莓花青素化學(xué)預(yù)防結(jié)直腸癌中的作用。方法：小鼠分為健康對(duì)照組，氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠模型組，AOM/DSS 誘導(dǎo)聯(lián)合黑樹(shù)莓花青素處理組。利用miRNA 基因芯片篩選差異表達(dá)miRNAs，選miR-338-5p，采用RT-qPCR 確認(rèn)miR-338-5p 在小鼠結(jié)腸組織及在人結(jié)直腸癌細(xì)胞株Caco-2、LoVo、HCT-116、HT29、SW480 中的mRNA 表達(dá)，生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-338-5p和SIRT1 靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。Western blotting 檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中SIRT1 蛋白及其下游mTOR 等信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果：miRNA 基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)飲食的模型小鼠相比，喂食添加黑樹(shù)莓花青素的模型小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中miR-338-5p表達(dá)量顯著減少，進(jìn)一步研究幾種結(jié)腸癌細(xì)胞系，確認(rèn)了miR-338-5p 表達(dá)趨勢(shì)；黑樹(shù)莓花青素處理結(jié)直腸癌細(xì)胞，miR-338-5p的表達(dá)能夠顯著降低。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-338-5p 和SIRT1 存在靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)黑樹(shù)莓花青素可以促進(jìn)腸上皮細(xì)胞SIRT1 蛋白的表達(dá)，并對(duì)其下游mTOR 等相關(guān)信號(hào)通路分子蛋白水平具有調(diào)控作用。結(jié)論：黑樹(shù)莓花青素可能通過(guò)靶向調(diào)控miR-338-5p/SIRT1 相關(guān)信號(hào)通路而發(fā)揮對(duì)結(jié)直腸癌的化學(xué)預(yù)防作用，進(jìn)而為結(jié)直腸癌提供新的化學(xué)預(yù)防策略。
目的：研究 miR-338-5p/SIRT1 相關(guān)信號(hào)通路在黑樹(shù)莓花青素化學(xué)預(yù)防結(jié)直腸癌中的作用。方法：小鼠分為健康對(duì)照組，氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠模型組，AOM/DSS 誘導(dǎo)聯(lián)合黑樹(shù)莓花青素處理組。利用miRNA 基因芯片篩選差異表達(dá)miRNAs，選miR-338-5p，采用RT-qPCR 確認(rèn)miR-338-5p 在小鼠結(jié)腸組織及在人結(jié)直腸癌細(xì)胞株Caco-2、LoVo、HCT-116、HT29、SW480 中的mRNA 表達(dá)，生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-338-5p和SIRT1 靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。Western blotting 檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中SIRT1 蛋白及其下游mTOR 等信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果：miRNA 基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)飲食的模型小鼠相比，喂食添加黑樹(shù)莓花青素的模型小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中miR-338-5p表達(dá)量顯著減少，進(jìn)一步研究幾種結(jié)腸癌細(xì)胞系，確認(rèn)了miR-338-5p 表達(dá)趨勢(shì)；黑樹(shù)莓花青素處理結(jié)直腸癌細(xì)胞，miR-338-5p的表達(dá)能夠顯著降低。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-338-5p 和SIRT1 存在靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)黑樹(shù)莓花青素可以促進(jìn)腸上皮細(xì)胞SIRT1 蛋白的表達(dá)，并對(duì)其下游mTOR 等相關(guān)信號(hào)通路分子蛋白水平具有調(diào)控作用。結(jié)論：黑樹(shù)莓花青素可能通過(guò)靶向調(diào)控miR-338-5p/SIRT1 相關(guān)信號(hào)通路而發(fā)揮對(duì)結(jié)直腸癌的化學(xué)預(yù)防作用，進(jìn)而為結(jié)直腸癌提供新的化學(xué)預(yù)防策略。
關(guān)鍵詞：黑樹(shù)莓；花青素；結(jié)直腸癌；miR-338-5p；SIRT1；化學(xué)預(yù)防
中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253 - 2670(2018)04 - 0853 - 06
微小 RNA（micro RNAs，miRNAs）是在動(dòng)植物中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)大小為19～25 bp 非蛋白質(zhì)編碼的小分子RNA 家族。通過(guò)與靶基因mRNA 作用，使其在轉(zhuǎn)錄后的翻譯過(guò)程被抑制或直接被降解致其蛋白表達(dá)水平降低，從而參與多種生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡以及代謝等[1-3]。miRNAs也可以發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用參與人體多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。結(jié)腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在歐美國(guó)家報(bào)告的發(fā)病率最高，其發(fā)病率在我國(guó)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，多個(gè)miRNAs 在結(jié)直腸癌中表達(dá)異常，在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。過(guò)表達(dá)miR-155-5p 可增加結(jié)腸癌增殖和侵襲能力[4]。miR-433 通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌中的結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（MACC1）來(lái)降低細(xì)胞活力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5]。miR-338-5p 為miR-338 的亞型之一，miR-338 及其亞型在胃癌[6-7]和神經(jīng)母細(xì)胞瘤[8]中表達(dá)下調(diào)，在宮頸癌[9]和胰腺癌[10]中高表達(dá)，在結(jié)直腸癌中，Sun 等[11]發(fā)現(xiàn)miR-338-3p 低表達(dá)，通過(guò)作用于SMO（smoothened，一種原癌基因）抑制結(jié)直腸癌的細(xì)胞增殖。在肝癌中，有研究發(fā)現(xiàn)miR-338-5p 表達(dá)上調(diào)，可以作為肝細(xì)胞癌生物標(biāo)記物[12]。但是miR-338-5p 在結(jié)直腸癌中的研究較少。
黑樹(shù)莓（black raspberry，BRB）屬薔薇科勾懸子屬漿果，是北美膳食中食用量較大的水果，在我國(guó)其作為水果也越來(lái)越多的受到人們的喜愛(ài)。研究證明黑樹(shù)莓中含有大量的活性物質(zhì)，如酚酸類、黃酮類、原花青素和鞣質(zhì)等酚類化合物[13]。酚類化合物已被證實(shí)具有促進(jìn)脂類代謝及自由基清除等生理作用，人們已經(jīng)獲得證據(jù)表明酚類化合物在預(yù)防人類某些疾病方面有一定功效，如預(yù)防心腦血管疾病、癌癥等方面[14]。前期研究證明黑樹(shù)莓中原花青素和鞣花酸類含量豐富，對(duì)于癌癥的預(yù)防有很好的作用，尤其對(duì)結(jié)直腸癌[15-16]、食管癌[17]等有一定的預(yù)防及治療作用。但是黑樹(shù)莓能否通過(guò)影響miRNAs 表達(dá)發(fā)揮對(duì)結(jié)直腸癌的預(yù)防作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用化學(xué)致癌物氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸鈉（DSS）聯(lián)合誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠模型，飲食給予黑樹(shù)莓花青素，考察黑樹(shù)莓花青素對(duì)結(jié)腸組織和結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)異常的miRNAs 的影響，選定miR-338-5p 進(jìn)行后續(xù)研究，初步探索miR-338-5p 在結(jié)直腸癌化學(xué)預(yù)防中的作用機(jī)制。此研究將為黑樹(shù)莓的腫瘤化學(xué)預(yù)防作用和作用機(jī)制提供新的理論依據(jù)，miR-338-5p 的研究有望成為結(jié)直腸癌的化學(xué)預(yù)防新靶點(diǎn)。
1 材料
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
C57 小鼠雄性，體質(zhì)量18～22 g，遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限責(zé)任公司，合格證號(hào)SCXK-（遼）-2015-0001。
1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
10 代以內(nèi)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株Caco-2、LoVo、HCT-116、HT29、SW480，來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院北京協(xié)和腫瘤醫(yī)院。
1.3 主要試劑
MiRNA cDNA Synthesis Ki（t CW2141，25Rxns）、miRNA Real-Time PCR Assay Kit （ CW2142 ，100Rxns）購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Anti-SIRT1 抗體（D121218-0200）、Anti-SIRT3 抗體（D221219-0200）、Anti-HIF-1α 抗體（D262108-0010）購(gòu)自上海生工生物有限公司；Anti-β-actin 抗體（AB10024 ） 購(gòu)自BBI 公司；Anti-VEGF 抗體（GTX102643）購(gòu)自GeneteX 公司；Anti-E-cadherin抗體（3195s）購(gòu)自Cell Signaling Technology 公司；Anti-mTOR 抗體（BS3611）購(gòu)自Bioword Technology公司；Trizol（B900044-100）購(gòu)自BBI 公司；RIPA裂解液（R0010）購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；AOM（A5486）和DSS（42867）購(gòu)自Sigma 公司。
1.4 主要儀器
Applied Biosystems 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；化學(xué)發(fā)光儀購(gòu)自以色列DNR公司。
2 方法
2.1 黑樹(shù)莓花青素的提取
黑樹(shù)莓花青素由天津尖峰天然產(chǎn)物提取有限責(zé)任公司提?。ㄅ?hào)20130901），質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞90%。提取步驟簡(jiǎn)述如下：冷凍干燥的黑樹(shù)莓凍干粉在35 ℃用乙醇-水（75∶25）萃取3 h，得到粗酚提取液。將所得提取物濾過(guò)，色譜分離，經(jīng)Sephadex 進(jìn)一步色譜，通過(guò)制備型HPLC 純化得到提純的黑樹(shù)莓花青素。
2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備
C57 小鼠（18～22 g），適應(yīng)1 周后，開(kāi)始造模，首先在第1、8 天小鼠單次ip AOM（10 mg/kg），然后2% DSS 攝水進(jìn)行3 個(gè)循環(huán)，即1、4、7 周分別給予2% DSS 攝水，其他時(shí)間均為正常飲水，實(shí)驗(yàn)周期為12 周，檢測(cè)小鼠腸中的腫瘤情況以確認(rèn)模型是否成功。該研究由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。模型成功小鼠分2 組，模型組為AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌小鼠（10 只），給予正常飼料；黑樹(shù)莓花青素組為AOM/DSS 誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌小鼠（10 只），自造模開(kāi)始給予含7.0 μmol/g 黑樹(shù)莓花青素飼料，直到造模結(jié)束；另取正常喂養(yǎng)狀況良好的C57 小鼠（7 只），給予正常飼料為對(duì)照組。在第12周造模結(jié)束，將小鼠斷頸處死，另取結(jié)腸組織、提取上皮細(xì)胞−80 ℃保存。7.0 μmol/g 黑樹(shù)莓花青素劑量的選擇參照前期研究中10%黑樹(shù)莓凍干粉的劑量，結(jié)合花青素的提取比例計(jì)算而來(lái)[16]。
2.3 人結(jié)直腸癌細(xì)胞處理、收集
Caco-2、LoVo、HCT-116、HT29、SW480 細(xì)胞復(fù)蘇，待細(xì)胞生長(zhǎng)到90%貼壁時(shí)取約2×105 個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板，每孔補(bǔ)充培養(yǎng)基至2 mL。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組，黑樹(shù)莓花青素低劑量（25 μg/mL）組和高劑量（50μg/mL）組，藥物處理細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞備用。
2.4 miRNA 基因芯片檢測(cè)
取結(jié)腸組織進(jìn)行 Agilent Mouse miRNA（8*60K，Design ID：070155）芯片檢測(cè)，完成10 個(gè)樣本檢測(cè)和分析。樣品總RNA 利用NanoDrop ND-2000（ Thermo Scientific 公司） 定量并經(jīng)AgilentBioanalyzer 2100（Agilent Technologies）檢測(cè)RNA完整性。RNA 質(zhì)檢合格后，對(duì)樣本進(jìn)行標(biāo)記、芯片的雜交以及洗脫等處理，此步驟是參照芯片標(biāo)準(zhǔn)流程嚴(yán)格操控的。第1 步：將總RNA 去磷酸化，變性后進(jìn)一步用Cyanine-3-CTP（Cy3）標(biāo)記。第2 步：將標(biāo)記好的RNA 純化后與芯片雜交，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C（Agilent Technologies 公司）掃描得到原始圖像。第3 步：采用Feature Extraction軟件（version10.7.1.1，Agilent Technologies 公司）處理原始圖像提取原始數(shù)據(jù)。接著利用Genespring軟件（version13.1，Agilent Technologies 公司）進(jìn)行quantile 標(biāo)準(zhǔn)化和后續(xù)處理。最后，對(duì)差異miRNAs進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類，利用熱圖的形式展示差異miRNAs 在不同樣本間的表達(dá)模式。上述miRNA基因芯片檢測(cè)分析由上海歐意公司完成。
2.5 實(shí) 時(shí) 熒光定量PCR （ RT-qPCR ） 檢測(cè)miR-338-5p 的表達(dá)量
RT-qPCR 檢測(cè)組織和細(xì)胞miR-338-5p 的表達(dá)量，組織及細(xì)胞用Trizol 試劑提取總RNA，參照micro RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)行逆轉(zhuǎn)錄，RT-qPCR 反應(yīng)采用SYBR 染料法，選用U6 作為內(nèi)參基因，反應(yīng)條件：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40 個(gè)循環(huán)。采用2−ΔΔCt 法計(jì)算miR-338-5p 相對(duì)表達(dá)量，mmu-miR-338-5p 引物序列：5’-GAACAATATCCTGGTGCTGAGTG-3’；hsamiR-338-5p 引物序列：5’-TGAACAATATCCTGGTGCTGAGTG-3’。
2.6 生物信息學(xué)分析miR-338-5p 的靶基因
利 用 TargetScan （ http://www.targetscan.org/vert_71/）、miRanda（http://www.microrna.org/microrna/home.do）在線軟件分析miR-338-5p 和沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）的靶向關(guān)系。
2.7 Western blotting 檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)
蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)腸癌組織上皮細(xì)胞SIRT1蛋白及其下游mTOR 等相關(guān)信號(hào)通路分子蛋白。結(jié)腸組織上皮細(xì)胞，加入RIPA 裂解液和PMSF 蛋白酶抑制劑提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白含量。20 μg總蛋白上樣，12% SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗、二抗，凝膠成像系統(tǒng)拍照、分析。
2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較采用t檢驗(yàn)及方差分析，Image J 和Graphpad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)做圖。
3 結(jié)果
3.1 miRNA 基因芯片結(jié)果
從小鼠結(jié)腸組織miRNA 基因芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組和黑樹(shù)莓花青素組的小鼠結(jié)腸組織中所有miRNAs 表達(dá)特征共發(fā)現(xiàn)6 個(gè)差異表達(dá)miRNAs（差異倍數(shù)＞2.5），將差異表達(dá)miRNAs 聚類分析。miR-338-5p 在模型組小鼠中高水平表達(dá)，在給予黑樹(shù)莓花青素飲食12 周后，其表達(dá)水平顯著下調(diào)（圖1），提示miR-338-5p 在黑樹(shù)莓花青素抑制腫瘤形成和化學(xué)預(yù)防中可能發(fā)揮作用。
3.2 小鼠結(jié)腸組織和結(jié)直腸癌細(xì)胞系miR-338-5p表達(dá)量
為了進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA 基因芯片結(jié)果。通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織和結(jié)直腸癌細(xì)胞系中miR-338-5p 的表達(dá)量變化。同對(duì)照組比較，模型組小鼠組織中miR-338-5p 顯著上調(diào)；喂食黑樹(shù)莓花青素組小鼠組織中miR-338-5p 顯著下調(diào)（圖2-A）。體外細(xì)胞水平，黑樹(shù)莓花青素處理后結(jié)直腸癌細(xì)胞miR-338-5p 表達(dá)量同樣下調(diào)（圖2-B），與基因芯片結(jié)果相符。提示miR-338-5p 表達(dá)參與了黑樹(shù)莓花青素結(jié)直腸腫瘤的化學(xué)預(yù)防作用。
圖 1 小鼠結(jié)腸組織miRNA 芯片聚類分析模型組和黑樹(shù)莓花青素組差異表達(dá) miRNAs
3.3 生物統(tǒng)計(jì)軟件預(yù)測(cè)SIRT1 基因是MiR-338-5p的靶基因
進(jìn) 一 步 利用生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測(cè)，miR-338-5p 的種子區(qū)域和SIRT1 基因3’UTR 存在互補(bǔ)配對(duì)的序列（圖3），因此生物信息學(xué)分析認(rèn)為SIRT1 可能是miR-338-5p 的靶基因。
3.4 小鼠結(jié)腸組織上皮細(xì)胞SIRT1 蛋白及mTOR等相關(guān)信號(hào)通路分子檢測(cè)
進(jìn)一步對(duì)上述生物信息分析預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，考察了SIRT1 蛋白及其介導(dǎo)的下游信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)。結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，黑樹(shù)莓花青素組SIRT1 蛋白、E-cadherin 蛋白表達(dá)升高，下游相關(guān)信號(hào)通路相關(guān)分子mTOR、SIRT3、HIF-1α的表達(dá)下降。SIRT1 抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展，SIRT1 表達(dá)上調(diào)抑制mTOR 蛋白表達(dá)[18]。mTOR 可以從轉(zhuǎn)錄水平激活HIF-1α 的表達(dá)，所以相應(yīng)的HIF-1α表達(dá)下調(diào)[19]。HIF-1α 可以通過(guò)控制VEGF 的編碼基因來(lái)調(diào)節(jié)VEGF 的表達(dá)，HIF-1α 表達(dá)受抑制，相應(yīng)VEGF 的表達(dá)也受抑制[20]。所以，當(dāng)前研究提示黑樹(shù)莓花青素可以通過(guò)影響miR-338-5p，進(jìn)而調(diào)控SIRT1蛋白的表達(dá)，調(diào)控結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。
3.5 黑樹(shù)莓花青素在結(jié)直腸癌中發(fā)揮化學(xué)預(yù)防作用的機(jī)制
經(jīng)過(guò)上述實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，推測(cè)在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中，黑樹(shù)莓花青素能通過(guò)多重作用激活SIRT1 及其介導(dǎo)的下游相關(guān)信號(hào)通路分子來(lái)發(fā)揮對(duì)結(jié)直腸癌的化學(xué)預(yù)防作用。在此過(guò)程中miR-338-5p 作為黑樹(shù)莓和SIRT1 相關(guān)信號(hào)通路的中間信使，傳遞黑樹(shù)莓花青素化學(xué)預(yù)防作用，并通過(guò)自身的靶向功能，作用于SIRT1 相關(guān)信號(hào)通路（圖5）。
經(jīng)過(guò)上述實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，推測(cè)在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中，黑樹(shù)莓花青素能通過(guò)多重作用激活SIRT1 及其介導(dǎo)的下游相關(guān)信號(hào)通路分子來(lái)發(fā)揮對(duì)結(jié)直腸癌的化學(xué)預(yù)防作用。在此過(guò)程中miR-338-5p 作為黑樹(shù)莓和SIRT1 相關(guān)信號(hào)通路的中間信使，傳遞黑樹(shù)莓花青素化學(xué)預(yù)防作用，并通過(guò)自身的靶向功能，作用于SIRT1 相關(guān)信號(hào)通路（圖5）。
4 討論
酚類化合物是植物體極為重要的次生代謝產(chǎn)物，由于酚類物質(zhì)在預(yù)防疾病方面的發(fā)現(xiàn)，作為化學(xué)預(yù)防劑廣泛應(yīng)用，劉秀芳等[21]研究證明了茶多酚抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)。杏仁中鞣花酸含量豐富，鞣花酸在諸多物質(zhì)中顯示出具有抗癌性，通過(guò)影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖[22-23]。黑樹(shù)莓中原花青素和鞣花酸類含量豐富，在前期的研究中發(fā)現(xiàn)黑樹(shù)莓花青素能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，遷移，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[24]。本研究中，小鼠組織miRNA基因芯片研究結(jié)果及體外細(xì)胞體系深入機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)：黑樹(shù)莓花青素能通過(guò)下調(diào)miR-338-5p，從而激活miR-338-5p 的靶蛋白SIRT1 及其介導(dǎo)的下游相關(guān)信號(hào)通路分子，來(lái)發(fā)揮對(duì)結(jié)直腸癌的化學(xué)預(yù)防作用。
本研究中發(fā)現(xiàn)利用RT-qPCR 檢測(cè)miR-338-5p在結(jié)直腸癌組織相比于正常組織表達(dá)量升高，miR-338-5p 作為癌基因發(fā)揮作用，同時(shí)生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-338-5p 與SIRT1 可能是有靶向關(guān)系的。SIRT-1 是NAD＋依賴性III 類組蛋白脫乙酰酶的成員，其參與多種病理生理過(guò)程，例如抗炎，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝，抗癌發(fā)生[25-27]。SIRT1 使β-catenin 脫乙?；?，從而抑制β-catenin 的激活轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞增殖[28]。SIRT3 的作用與SIRT1 相反。SIRT1的升高會(huì)降低mTOR 表達(dá)量[16]。mTOR 可以從轉(zhuǎn)錄水平激活HIF-1α 的表達(dá)[17]。HIF-1α 在結(jié)直腸癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的發(fā)生中的表達(dá)，HIF-1α 通過(guò)控制VEGF 的編碼基因從而來(lái)控制VEGF 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)血管生成[18]。SIRT1 能夠抑制結(jié)直腸癌的發(fā)展和進(jìn)展。本研究中相比于AOM/DSS 模型組，黑樹(shù)莓組結(jié)直腸組織中SIRT1 蛋白表達(dá)量提高，下游mTOR 等信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量也發(fā)生變化，黑樹(shù)莓能通過(guò)某種方式調(diào)控SIRT1 信號(hào)通路，而且黑樹(shù)莓降低miR-338-5p 表達(dá)同時(shí)提高SIRT1 蛋白表達(dá)，同樣證實(shí)miR-338-5p 與SIRT1 可能是有靶向關(guān)系的。
綜上所述，黑樹(shù)莓花青素能通過(guò)調(diào)控miR-338-5p/SIRT1 信號(hào)通路影響結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，從而發(fā)揮對(duì)結(jié)直腸癌的化學(xué)預(yù)防作用，上述研究結(jié)果為結(jié)腸直腸癌提供新的化學(xué)預(yù)防和治療策略。
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