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癌癥預(yù)防的完全食物途徑：以漿果為例

發(fā)表于：2019-01-15   作者：admin   來源：本站   點擊量：22047

摘要  在過去的二十多年中，Gary D. Stoner實驗室一直在評估利用黑樹莓進(jìn)行基于食物的癌癥預(yù)防途徑。黑樹莓含有多種具有潛在化學(xué)預(yù)防作用的化合物，包括維生素A、C、E，硒，鈣，以及大量或復(fù)雜或簡單的多酚類物質(zhì)，包括花青素，鞣花，槲皮素，阿魏酸和香豆酸，各種類胡蘿卜素，β-谷甾醇等激素。臨床前研究表明，黑樹莓凍干粉末可以抑制動物的口腔，食道，結(jié)腸和乳腺中腫瘤發(fā)生發(fā)展。在人體實驗中，黑樹莓凍干粉末對口腔，食道和結(jié)腸的癌前病變具有預(yù)防作用，且其劑量水平僅引起少量或不引起毒性。黑樹莓預(yù)防癌癥的機理可能包括抑制細(xì)胞增殖、炎癥和血管生成，并且促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡、黏附和分化。分子生物學(xué)研究表明，黑樹莓保護(hù)性地調(diào)控了多個和上述細(xì)胞功能相關(guān)的基因表達(dá)。對黑樹莓不同組分的生物活性分析顯示其化學(xué)預(yù)防作用主要來自其中的多酚類物質(zhì)和纖維素。
 
關(guān)鍵詞  化學(xué)預(yù)防 漿果 口腔 食道 結(jié)腸 動物 人類
 
1 前言
幾千年來，人類依靠植物成分及其衍生物預(yù)防和治療包括癌癥的各種疾病。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)證據(jù)推動了大量流行病學(xué)研究，以證實特定植物衍生物是否具有預(yù)防疾病發(fā)生的作用。在這些研究中，可能最具有說服力的結(jié)果就是蔬菜和水果對人類多種癌癥的保護(hù)作用。目前，實驗研究已經(jīng)證實超過1000種來自蔬菜和水果的單體化合物在體外和動物模型上具有化學(xué)預(yù)防的作用。事實上，大多數(shù)化學(xué)預(yù)防實驗是用單體化合物進(jìn)行的，包括各種營養(yǎng)物質(zhì)和非營養(yǎng)性的植物化學(xué)成分。最有效的化學(xué)預(yù)防劑通常通過影響廣泛的細(xì)胞功能來發(fā)揮保護(hù)作用，比如細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥、血管生成、黏附、分化以及多種影響上述細(xì)胞功能的信號通路。但即使是具有廣泛基礎(chǔ)的化學(xué)預(yù)防劑，在自發(fā)的或者致癌物誘發(fā)的癌癥動物模型中抑制程度也很少超過50%-60%。因此，理性設(shè)計的組合途徑成為癌癥化學(xué)預(yù)防的重要策略。
 
從80年代初開始，Gary Stoner實驗室投入了相當(dāng)大的精力去研發(fā)單體化合物預(yù)防癌癥，特別是非營養(yǎng)性的植物化學(xué)物質(zhì)如鞣花酸和苯乙基異硫氰酸鹽。這兩種化合物在體外和動物體內(nèi)多個器官上起到化學(xué)預(yù)防作用。然而最近，他們致力于研究凍干的可食用漿果類預(yù)防癌癥。這一研究興趣起源于早期的鞣花酸研究，鞣花酸存在于漿果類的果肉和種子中，而果汁中并沒有這種物質(zhì)。漿果類重量的80%-90%都是水，因此如果去掉漿果中的水分將會10倍濃縮鞣花酸和漿果包含的任何其他化學(xué)預(yù)防成分。黑樹莓所含的鞣花酸量比所分析的其他漿果更多，因此他們選擇黑樹莓進(jìn)行研究。（圖一）
 
 
圖一：左邊是收獲前一周未成熟的樹莓。收獲后這些漿果將變成黑色。右邊是黑樹莓凍干粉。
 
接下來的章節(jié)將描述他們評價黑樹莓化學(xué)預(yù)防潛力的方法途徑。很大程度上這是他們2009年發(fā)表在Cancer Prevention Research上文章的更新。
 
2 評價漿果粉化學(xué)預(yù)防潛力的策略
他們提出了一個漸進(jìn)方法來評價漿果粉的化學(xué)預(yù)防作用。他們的試驗方法類似于Kelloff等描述的評價單體化合物的臨床前和臨床試驗。與Kelloff等的試驗策略的主要不同在于起始步驟，Kelloff等使用的是合成或者分離得到的單體化合物，Stoner等采用包含多種化合物的標(biāo)準(zhǔn)漿果粉。這種方法可以很容易的應(yīng)用于評價來源于其他食品的粉末。事實上，正是關(guān)于其他食品如茶葉、西蘭花、番茄汁、大豆、大蒜、甜菜根等預(yù)防癌癥的報道，促使Stoner等去檢測漿果粉末化學(xué)預(yù)防作用。以下將總結(jié)漿果和漿果成分用于預(yù)防癌癥的具體研發(fā)步驟。
 
2.1 漿果粉末標(biāo)準(zhǔn)化
早期研究顯示，在俄亥俄州不同的農(nóng)場獲得的黑樹莓中鞣花酸和花青素含量相差2-4倍之多。為了使變異系數(shù)最小，他們僅從俄亥俄州南部一個農(nóng)場或者俄勒岡州中心的一個農(nóng)場獲取漿果。大多數(shù)研究都是關(guān)于Jewel和Bristol兩種黑樹莓（西方懸鉤子屬植物），是因為與其它商業(yè)可獲得的漿果相比，它們的花青素和鞣花單寧含量最高且具有較高的抗氧化活性。黑樹莓成熟后采用機械化采摘，用水徹底清洗，隨后冷凍運載到伊利諾斯州（俄亥俄州漿果）或者俄勒岡州冷凍干燥，再研磨成粉，或者通過加壓過濾篩除凍干樹莓中的種子。漿果粉末凍干樣品貯存于-20℃直到用于實驗。為了標(biāo)準(zhǔn)化，每批粉末都定量分析了隨機選擇的20+營養(yǎng)成分和非營養(yǎng)性成分，包括潛在的化學(xué)預(yù)防成分。
 
最近的事件再次突出了人食品安全的重要性。因此，建議分析每一批漿果凍干粉是否存在微生物和有害化學(xué)品（化學(xué)農(nóng)藥，除草劑，殺菌劑）污染。這些分析需要大約100 g干粉，由商業(yè)化公司進(jìn)行。另外，為了阻止?fàn)I養(yǎng)和非營養(yǎng)成分降解以及細(xì)菌生長，在應(yīng)用于動物和人類臨床試驗之前，漿果粉末應(yīng)被儲存于-20℃或者溫度更低的密封袋中。最近他們發(fā)現(xiàn)，儲存在-20℃密封袋10年的黑樹莓粉末中的四種花青素僅減少了20%（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。
 
2.2嚙齒類動物毒性試驗
理想的化學(xué)預(yù)防藥劑應(yīng)該在無毒或很少毒性的濃度下展現(xiàn)出化學(xué)預(yù)防功效。Stoner等用添加了2.5%、5.0%、10%重量比黑樹莓粉的合成飼料（AIN-76A）飼喂大鼠長達(dá)9個月，這些劑量相當(dāng)于大約人類每天食用0.9-1.8盎司黑樹莓粉（根據(jù)體表面積換算）。
 
組織病理研究表明攝入黑樹莓粉9個月在動物的主要器官中不產(chǎn)生毒性效應(yīng)，黑樹莓補充組和對照組在體重、攝食量和血細(xì)胞計數(shù)等方面也沒有顯著差異。另一個意想不到的益處是大鼠漿果飲食組減少了血液總膽固醇含量10%。
 
2.3 體內(nèi)致癌物誘發(fā)的癌癥和自發(fā)性癌癥的抑制機制研究
表2概述了黑樹莓在動物模型上阻止致癌物誘發(fā)的或自發(fā)性癌癥的眾多試驗結(jié)果。AIN-76A飼料中加入2.5%，5.0%，10%的黑樹莓粉降低了致癌物誘發(fā)的敘利亞金黃倉鼠頰囊腫瘤、F344大鼠食管和腸道腫瘤、ACI大鼠乳腺癌。食物中10%黑樹莓抑制了Apc1638+/-小鼠自發(fā)性小腸癌和Muc2-/-小鼠小腸和結(jié)腸癌。最后，一種富集了花青素的黑樹莓提取物可以抑制UVB導(dǎo)致的SKH-1小鼠皮膚癌。這些研究中，測定腫瘤抑制活性的最有效指標(biāo)是腫瘤發(fā)生的數(shù)量。根據(jù)給予致癌物和漿果飼料的時間順序，抑制發(fā)生腫瘤數(shù)量的效果一般在30%-75%之間。無論是在致癌物處理之前、之中或之后給予黑樹莓飼料都可以達(dá)到優(yōu)化的抑癌效果，表明長期食用漿果可以對人類起到最大限度的化學(xué)預(yù)防作用。漿果不能100%抑制腫瘤發(fā)生，提示黑樹莓中的抑制成分或者他們的代謝產(chǎn)物不能被完全吸收，比如說花青素和鞣花單寧。另外，漿果化合物可能不足以影響所有的重要致癌信號通路。
 
多數(shù)研究利用黑樹莓抑制NMBA所致F344大鼠食管癌來在體內(nèi)闡明漿果化學(xué)預(yù)防的細(xì)胞和分子機制。黑樹莓影響增殖、凋亡、炎癥、血管生成和分化等細(xì)胞過程（圖三）。運用實時熒光定量PCR、Western blot和定量免疫組化技術(shù)，發(fā)現(xiàn)黑樹莓對NMBA導(dǎo)致的多種與這些細(xì)胞過程相關(guān)的基因失調(diào)有保護(hù)性調(diào)節(jié)作用。另外，一項早期的基因芯片研究發(fā)現(xiàn)黑樹莓使大鼠食管癌起始階段的2261個NMBA所致失?；蛑械?62個恢復(fù)到接近正常。這些恢復(fù)基因與包括致癌物代謝的多種細(xì)胞功能相關(guān)，提示黑樹莓活性成分可能在基因組范圍調(diào)控參與食道癌發(fā)生的基因。另一項近期的基因芯片研究鑒定了在大鼠食管癌發(fā)生晚期受黑樹莓保護(hù)性調(diào)控的若干基因。黑樹莓使被NMBA擾亂的大鼠癌前食管中4807個基因中的626個、食道乳頭狀瘤中17846個基因中的625個恢復(fù)到正常的基因表達(dá)量。在食道癌前病變和食道乳頭狀瘤中，黑樹莓調(diào)節(jié)的基因表達(dá)與碳水化合物和脂類代謝、細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥、以及花生四烯酸代謝的環(huán)氧酶和脂肪氧合酶通路有關(guān)。有趣的是，黑樹莓還可以調(diào)控與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的金屬蛋白酶。因此，黑樹莓可以在食道癌形成的起始和最后階段引起全基因組的影響。
 
對黑樹莓在無NMBA處理的對照組食道中基因表達(dá)的影響同樣進(jìn)行了基因芯片研究。5%黑樹莓處理大鼠3個星期僅改變了對照組食道中36個基因的表達(dá)水平（24個上調(diào)，12個下調(diào)）。上調(diào)的基因中與細(xì)胞基質(zhì)、信號級聯(lián)反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞凋亡和代謝，以及比較出人意料的細(xì)胞收縮有關(guān)。下調(diào)的基因涉及到細(xì)胞調(diào)控、信號傳導(dǎo)和代謝。組織病理學(xué)分析表明，漿果類對食道形態(tài)很少或沒有影響。因此黑樹莓獨立飼喂對大鼠食道僅有輕微的影響。
 
兩種結(jié)腸癌小鼠模型被用于評價黑樹莓對結(jié)腸癌發(fā)展的影響以及潛在的機制。飼喂黑樹莓12個星期可以在兩種模型中顯著抑制小腸腫瘤的發(fā)生。APC1638+/-小鼠腫瘤發(fā)生率減少45%，單只腫瘤數(shù)量減少60%；Muc-/-小鼠則都是減少50%。機理研究結(jié)果表明，黑樹莓通過抑制β-catenin信號通路抑制APC1638+/-小鼠腫瘤發(fā)展，而通過減少慢性炎癥抑制Muc-/-小鼠腫瘤發(fā)展。黑樹莓在兩種小鼠模型中都減少小腸細(xì)胞增殖，同時黏膜分化都沒有受到影響。另外一項研究利用3%葡聚糖硫酸鈉(DSS)造成小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，而10%黑樹莓飼料顯著減少DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸上皮損傷，并抑制了多個促炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）。黑樹莓組結(jié)腸環(huán)氧化酶-2（COX-2）水平也被抑制，血漿前列腺素E2隨之減少。這些結(jié)果表明，黑樹莓對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸損傷具有較強的抗炎作用。建議應(yīng)評價黑樹莓對人類潰瘍性結(jié)腸炎的潛在影響。
 
2.4 人類I期臨床試驗
基于令人鼓舞的臨床前研究結(jié)果啟動了黑樹莓臨床試驗，其中幾個試驗已經(jīng)完成。一項I期試驗評價了黑樹莓粉末的安全性和耐受性（每天45g用水調(diào)制成糊狀物，連續(xù)7天），并檢測了11名健康參與者的尿液和血漿中花青素和鞣花酸。這個劑量相當(dāng)于每天食用16盎司（1磅）新鮮黑樹莓。所有的參與者在試驗期間不攝入酚類物質(zhì)（不食用茶、咖啡、酒精飲料、蔬菜和水果）。之所以采用粉末而不是新鮮黑樹莓有以下兩個原因：（1）1磅新鮮黑樹莓的量很大，每天食用存在一定問題，特別是有的人不能忍受黑樹莓種子；（2）新鮮黑樹莓僅能在每年的1-2個月中購買，而高質(zhì)量的黑樹莓粉末可以全年食用。因此，黑樹莓粉末用于日常的化學(xué)預(yù)防更可行。人類I期臨床試驗結(jié)果顯示，黑樹莓粉末具有較好的耐受性，11個受試者中有4人有發(fā)病率較低的輕微或中度便秘?；ㄇ嗨睾枉坊ㄋ岬淖畲鬂舛瘸霈F(xiàn)時間為血漿1-2小時，尿液0.5-4小時。與在大鼠中類似，根據(jù)血漿中自由花青素和鞣花酸的測定結(jié)果，它們在人體中的的總吸收率小于1%。然而，這些化合物的攝入很可能被低估了，因為沒有檢測血漿中這些化合物的代謝產(chǎn)物以及與蛋白質(zhì)相結(jié)合的化合物。在隨后的Barrett食管患者口服黑樹莓粉的試驗中（32或者45g/天，連續(xù)6個月），15%的患者報告了偶爾腹瀉、便秘、上腹部痛的臨床癥狀，但癥狀不嚴(yán)重，并且所有的患者都從始至終連續(xù)服用了黑樹莓粉。在連續(xù)服用黑樹莓粉（60 g/天（20 g/3x/天））9個月的家族性腺瘤性息肉?。‵AP）患者Ib期臨床試驗中也觀察到類似的胃腸道影響。所有的臨床數(shù)據(jù)顯示，人體對每天至少45g-60g、連續(xù)9個月服用黑樹莓粉有較好的耐受性。
 
2.5 漿果配方先導(dǎo)臨床試驗
已在具有相對較高癌癥風(fēng)險的人群中進(jìn)行了一系列先導(dǎo)臨床試驗以確定黑樹莓粉化學(xué)預(yù)防作用（表三）。這些試驗是基于自身對照的（即每個患者做他自己的對照組），受試者相對較少（14-20名），時間相對較短（1-9個月），主要檢測黑樹莓粉對異常增生病變和相關(guān)生物標(biāo)志物的影響。但家族性腺瘤性息肉病受試者有一半是口服安慰劑粉末（安慰劑對照），而在中國的75個食管非典型增生患者則是口服草莓粉而非黑樹莓粉。用草莓治療的原因如下：（1）是中國主要的漿果類；（2）中國政府不愿允許黑樹莓粉入境，擔(dān)心其中可能有活的種子；（3）草莓粉比黑樹莓便宜。先導(dǎo)試驗可以以較低的時間和經(jīng)費成本評估漿果是否再特定人群隊列中有效且是否適合進(jìn)入隨機安慰劑對照的II期和III期試驗，這些先導(dǎo)試驗的結(jié)果如下：
 
2.5.1 巴雷斯特食管
一項化學(xué)預(yù)防試驗分析了20個巴雷斯特食管患者?；颊呙刻炜诜?2g（女性）或45g（男性）黑樹莓粉糊狀物，連續(xù)6個月。干預(yù)前后分別對巴雷斯特食管病灶進(jìn)行組織活檢。結(jié)果顯示，漿果類對巴雷斯特食管病灶本身的細(xì)胞增殖和凋亡的生物標(biāo)志物影響很??；然而，漿果可以降低尿液中氧化應(yīng)激的兩個生物標(biāo)志物（8-Iso-PGF2和8-OHdG）。這可能是因為，黑樹莓粉糊狀物通過巴雷斯特食管病灶的時間太短，以至于其活性成分來不及進(jìn)入病灶組織。
 
2.5.2 食管增生
在中國食管鱗狀細(xì)胞癌高危地區(qū)的一項隨機非對照II期試驗分析了草莓凍干粉在食管非典型增生患者中的作用。75位患者隨機分為兩組，一組每天口服30g草莓凍干粉（37人），另外一組每天口服60g草莓凍干粉（38人），連續(xù)6個月。這些粉末用水混合后，鼓勵患者在一小時內(nèi)慢慢飲用。非典型增生的病理分級是試驗的首要指標(biāo)。30 g/天的劑量沒有顯著影響組織學(xué)及其他測量指標(biāo)，然而60 g/天的劑量顯著降低了大約80%中度非典型增生的病理分級（P<0.0001）。但是所評價的中度非典型增生樣本數(shù)量太少以至于不能得到確切結(jié)論。草莓凍干粉耐受良好，沒有毒性效應(yīng)或者不良事件的發(fā)生。高劑量草莓凍干粉減少了62.9%的COX-2蛋白表達(dá)量（P<0.001），79.5%的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）（P<0.001），62.6%的磷酸化NFκB-p65（P<0.001，73.2%的磷酸化S6蛋白（P<0.001）。高劑量草莓凍干粉也顯著抑制了Ki-67標(biāo)記指數(shù)達(dá)37.9% （P=0.023）。這些實際的試驗結(jié)果是令人鼓舞的，尤其是以前在中國試驗的若干干預(yù)食管非典型增生的藥劑都是無效的。
 
2.5.3 結(jié)直腸癌
一項臨床研究納入了20位結(jié)直腸癌的患者，以確定口服黑樹莓粉是否對腫瘤組織中特定生物標(biāo)志物如增殖（Ki-67）、凋亡（TUNEL）、血管生成（CD105）、Wnt信號通路基因表達(dá)（c-Myc、β-catenin、E-cadherin）、腫瘤抑制基因甲基化（P16、PAX6a、SFRP2、SFRP5、WIF1）有作用?；颊呙刻炜诜跇漭?0g（20g/3x/d），持續(xù)1-9周，并在服用黑樹莓前和手術(shù)切除腫瘤時取樣活檢。定量免疫組化結(jié)果表明，口服黑樹莓粉至少4周對Wnt通路、細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成相關(guān)基因表達(dá)具有保護(hù)性調(diào)控，但僅細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki-67的減少具有顯著意義（P<0.05）。三種Wnt通路上游的抑制基因（SFRP2，SFRP5，WIF1）和調(diào)控發(fā)育的PAX6a的甲基化狀態(tài)都收到黑樹莓的保護(hù)性調(diào)節(jié)作用。這可以與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1（DNMT1）表達(dá)量減少聯(lián)系起來，它是一種在哺乳動物細(xì)胞中保持DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的酶。這些結(jié)果表明，黑樹莓在治療結(jié)腸直腸癌上可能是有效的，特別是與日常的放化療和外科手術(shù)聯(lián)用。
 
2.5.4家族性腺瘤性息肉?。‵AP）患者
家族性腺瘤性息肉?。‵AP）是一種遺傳的結(jié)直腸癌綜合征，它以結(jié)腸息肉和終身接近100%的患結(jié)腸癌風(fēng)險為特征。腹部融合回腸直腸的結(jié)腸切除術(shù)或者回腸袋肛門吻合術(shù)結(jié)腸切除術(shù)都是傳統(tǒng)的結(jié)腸息肉病治療措施。終身的直腸內(nèi)窺鏡監(jiān)視是必要的息肉病復(fù)發(fā)管理策略。不排除息肉病和直腸癌不受控制的發(fā)展，如果不受控制發(fā)展則可能需要進(jìn)行直腸切除手術(shù)。
 
非甾體類抗炎藥（NSAIDs）在20年前被首次報道可以引起家族性腺瘤性息肉病患者腸息肉退化。然而非選擇性NSAIDs如舒林酸有胃腸毒性，促進(jìn)了選擇性COX-2抑制劑的發(fā)展。塞來昔布和羅非考西在隨機對照臨床試驗中被證明可以誘導(dǎo)家族性腺瘤性息肉病患者的結(jié)腸腺瘤退化，且塞來昔布已被美國FDA批準(zhǔn)作為內(nèi)窺鏡管理策略的輔助手段。不幸的是，心腦血管和栓塞性疾病風(fēng)險的增加導(dǎo)致羅非考西從市場撤回，而這對塞來昔布仍然是一個問題。
 
因為在臨床上沒有表現(xiàn)出毒性，Stoner等決定評價黑樹莓抑制家族性腺瘤性息肉病患者直腸息肉的能力。受試者被隨機分為兩組，第一組：每天3次每次口服20g安慰劑粉末懸浮液，睡前加上兩個漿果栓劑。第二組：每天3次每次口服20g黑樹莓粉末，睡前加上兩個漿果栓劑（圖4）。每個直腸栓劑包含730mg黑樹莓。治療為期9個月，每次觀察計數(shù)直腸息肉的大小和數(shù)量。起始時取不超過兩個直腸息肉用于生物標(biāo)志物組織活檢，在九個月時計數(shù)并切除所有的直腸息肉。圖五展示了這項研究的結(jié)果（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。每組有兩名患者因為插入栓劑導(dǎo)致直腸損傷退出了研究，這是由于一開始栓劑中包含磨碎的黑樹莓種子粉末，而不幸的是種子并沒有完全磨碎。通過讓干果加壓過篩再把果肉研磨成粉可以除去種子。有趣的是，七個口服黑樹莓外加栓劑的患者在9個月試驗結(jié)束時只有4個人減少了息肉的數(shù)量，一個數(shù)量沒有變化而另外兩個增加了?？傁⑷鈹?shù)量下降了19%。與此相比較，七個口服安慰劑外加直腸栓劑的患者總息肉數(shù)量減少了35%。這些試驗結(jié)果顯示僅用栓劑比口服漿果外加栓劑更有效。然而，每組需要更多的患者以得到漿果類影響息肉數(shù)量的結(jié)論。漿果類影響息肉大小和息肉數(shù)量具有良好的相關(guān)性（圖5）。經(jīng)過九個月的漿果治療，息肉大小的減少與細(xì)胞增殖減少（Ki細(xì)胞核著色）、細(xì)胞凋亡增加（TUNEL）有相關(guān)性。外加的生物標(biāo)志物研究正在進(jìn)行中?？偟膩碚f，他們的研究表明，漿果栓塞可能可以代替塞來昔布來治療家族性腺瘤性息肉病患者。
 
2.5.5口腔非典型增生
這個試驗旨在評價口腔非典型增生患者局部施用10%黑樹莓凝膠對增生指標(biāo)包括組織診斷、雜合性缺失（LOH）等的影響。10名口腔黏膜正常的患者和17名口腔非典型增生患者口腔局部施用10%黑樹莓凝膠，每天4次每次0.5g，連續(xù)6個星期。治療之前對所有非典型增生病變和正常組織拍照，病灶組織對半切開，以獲得處理前的診斷和生化及分子指標(biāo)。初始活檢一周后開始給予凝膠。從激光捕獲顯微切割的基底和基底表面上皮組織中分離基因組DNA，利用靶向已知和假定的腫瘤抑制基因（INK4a、ARF、p53、FHIT）的引物PCR擴增相關(guān)位點序列。研究中27名受試者沒有表現(xiàn)出黑樹莓凝膠相關(guān)毒性作用。大約50%的治療患者其非典型增生病灶退化，同時也降低了相關(guān)腫瘤抑制基因雜的合性缺失。大多數(shù)的參與者上皮組織iNOS和COX-2在治療后蛋白水平降低，但只有COX-2的減少具有顯著性。芯片分析表明，黑樹莓凝膠均一地抑制了與RNA加工、生長因子循環(huán)和細(xì)胞凋亡抑制相關(guān)的基因表達(dá)。在一位患者中，應(yīng)用黑樹莓凝膠可以降低組織表面的血管密度，并誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞終末分化。目前，NCI支持的一項隨機安慰劑對照II期臨床試驗正在70名口腔非典型增生患者中進(jìn)行，以證實了上述27名患者的先導(dǎo)研究結(jié)果。該II期臨床試驗中，患者局部施用黑樹莓凝膠12周。從試驗的初步結(jié)果似乎可以證實已發(fā)表的27名患者的研究數(shù)據(jù)（蘇珊.馬勒里，個人通訊錄）。
 
上述先導(dǎo)試驗結(jié)果提示，不同劑型的黑樹莓很有希望被用于治療口腔、食道、結(jié)腸的癌前病變。漿果類可能成為一種無毒的癌癥預(yù)防手段，特別是在可以局部給藥以達(dá)到相對高濃度漿果化合物的部位。
 
2.6 II期和III期臨床試驗
迄今為止，僅啟動了兩項黑樹莓預(yù)防癌癥的II期臨床試驗。其中一個就是上述用10%黑樹莓凝膠誘導(dǎo)口腔非典型增生組織退化和調(diào)節(jié)細(xì)胞和分子生物標(biāo)志物的試驗。另外一項在俄亥俄州立大學(xué)的臨床研究正在考察黑樹莓錠劑阻止口腔癌復(fù)發(fā)（Christopher Weghorst個人通訊），該項研究迄今仍沒有結(jié)果正式發(fā)表。目前還沒有黑樹莓預(yù)防癌癥的III期臨床試驗。
 
3 結(jié)論
癌癥治療和預(yù)防的焦點是研發(fā)靶向信號通路中特定基因以殺死癌細(xì)胞或者阻止癌前細(xì)胞發(fā)展成為癌癥且對正常細(xì)胞影響很小的藥物。與此相反，漿果粉末是化合物的混合物，可以影響多種癌癥相關(guān)基因表達(dá)（相對于治療藥物其程度較小），以在最小或無細(xì)胞毒的劑量下阻止或減緩癌前細(xì)胞轉(zhuǎn)化成惡性腫瘤。就這一點而言，漿果類可以說是一種理想的化學(xué)預(yù)防藥劑。毫無疑問，其他食品也具有這種功能。例如，西蘭花芽苗水提取物凍干粉可以有效抑制化學(xué)誘導(dǎo)的大鼠膀胱癌，并且沒有毒副反應(yīng)。
 
 基于食品的癌癥預(yù)防策略的一個主要關(guān)注點就是研究中食物的標(biāo)準(zhǔn)化。毫無疑問，僅從一個或者兩個地方獲得漿果并非始終可行，比如從美國不同地區(qū)或者其他國家獲得的黑樹莓可能有相當(dāng)大的不同。這也許并不重要，因為他們在大鼠食道癌變模型上反復(fù)證明了來自兩個州不同年份超過10批次的黑樹莓粉末的化學(xué)預(yù)防作用，這些黑樹莓粉末甚至在營養(yǎng)和非營養(yǎng)成分上也有相當(dāng)大的差異。也許共同點是漿果中的纖維含量，因為來自于不同漿果的纖維（青花素和鞣花單寧的含量明顯不同）具有相同的化學(xué)預(yù)防作用。因此，盡管其重要性顯而易見，但過度關(guān)注標(biāo)準(zhǔn)化在某種程度上可能是不必要的。
 
從實際來看，高危個體通常愿意參與漿果劑型的臨床試驗研究，并且具有很好的遵從性。而一般大眾則對普通食材預(yù)防包括癌癥的疾病迷惑不解。由于其相對較低的價格和毒性，基于食品的有效途徑不僅吸引發(fā)達(dá)國家，對不發(fā)達(dá)國家可能更具有可行性（與高度合成的藥劑相比）。因此，Stoner認(rèn)為，上述合理設(shè)計的基于食物的預(yù)防策略是癌癥和其他疾病預(yù)防全面戰(zhàn)略中必不可少的一部分。
 
致謝
本文作者誠摯感謝對相關(guān)研究做出重要貢獻(xiàn)的來自俄亥俄州立大學(xué)的多名研究生、博士后、技術(shù)員、臨床試驗管理者和合作者，以及來自明尼蘇達(dá)州大學(xué)、克利夫蘭診所基金會、紐約大學(xué)，芝加哥伊利諾伊大學(xué)，俄亥俄和威斯康星醫(yī)學(xué)院的合作者。

表一：不同年份收獲的黑樹莓粉末中的潛在化學(xué)預(yù)防成分
 
 
表二： 飲食黑樹莓對動物模型的癌癥預(yù)防作用
 
圖三：黑樹莓通過影響相關(guān)基因表達(dá)減少增殖，炎癥，血管生成，細(xì)胞凋亡刺激。
 
黑樹莓→增殖→Ki-67/MIB-1↓;COX-2↓;PGE2↓;Erk1/2↓
黑樹莓→炎癥→COX-2，iNOS↓；PGE2↓；NF-KB↓；CD45↓
黑樹莓→細(xì)胞凋亡→TUNEL↑;Bcl-2↓；Bax↑
黑樹莓→血管生成→VEGF-1↓；HIF-1α↓；CD34↓
 
表三： 漿果劑型臨床試驗
 
 
圖五 黑樹莓對家族性腺瘤性息肉病息肉數(shù)量和大小的影響
 
縱坐標(biāo)：息肉數(shù)量
橫坐標(biāo)：息肉平均減少率
口服黑樹莓+栓塞19（1-7）；栓塞35（8-14）；全部26
縱坐標(biāo)：息肉大小
橫坐標(biāo)：息肉平均減少率
口服黑樹莓+栓塞18（1-7）；栓塞321（8-14）；全部20
 

 
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