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原文： Bauman J E ,  CH  Hsu,  Centuori S , et al. Abstract LB221: Randomized crossover trial evaluating detoxication of tobacco carcinogens by broccoli seed and sprout extract in heavy smokers[C]// Proceedings: AACR Annual Meeting 2021; April 10-15, 2021 and May 17-21, 2021; Philadelphia, PA. 2021.

評估西蘭花種子和芽苗提取物對當前吸煙者的煙草致癌物解毒作用的隨機交叉試驗

摘要：食用富含異硫氰酸酯蘿卜硫苷的十字花科蔬菜與降低煙草相關(guān)癌癥的風險有關(guān)。蘿卜硫苷水解釋放蘿卜硫素，可有效誘導細胞保護II期酶。蘿卜硫素降低了4NQO癌變模型中口腔癌的發(fā)生率。在中國啟東市的居民中，西蘭花種子和芽苗提取物(BSSE)增加了對空氣污染物苯和丙烯醛的解毒作用，這也存在于煙草煙霧中。這項隨機、交叉試驗評估了BSSE Avmacol?對健康吸煙者煙草致癌物的解毒作用。參與者接受了2周的低劑量和高劑量BSSE治療(每日148μmol及296μmol蘿卜硫苷)，間隔2周洗脫，隨機分為低-高和高-低序列。主要終點是苯的解毒，通過尿中巰基酸SPMA的排泄來測量。次要終點包括生物利用度、丙烯醛和巴豆醛的解毒、GST基因型的調(diào)節(jié)和毒性。49名參與者參與了研究，其中包括26名（53%）女性，平均每天使用20支香煙。低劑量和高劑量BSSE的平均生物利用度分別為11%和10%。高劑量BSSE顯著上調(diào)尿中苯巰基酸(p = 0.04)、丙烯醛(p < 0.01)和巴豆醛(p = 0.02)的排泄量，與GST基因型無關(guān)。保留率和依從性較高，導致研究早期完成。綜上所述，BSSE顯著上調(diào)了當前吸煙者對煙草致癌物苯、丙烯醛和巴豆醛的解毒作用。

關(guān)鍵詞：蘿卜硫素、蘿卜硫苷、解毒、煙草致癌物、臨床試驗、西蘭花種子和芽苗提取物、吸煙者

1. 引言

習慣性吸煙是人乳頭瘤病毒(HPV)陰性頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)的主要危險因素[1]。對煙草相關(guān)的 HNSCC 進行根治性治療后的長期生存率受到上呼吸消化道內(nèi)第二原發(fā)腫瘤 (SPT) 發(fā)展的驚人影響，包括肺癌、食道癌或頭頸癌，每年發(fā)病率為 3-6% [2-5]。事實上，SPTs是早期HNSCC治療后死亡的主要原因[6,7]。雖然戒煙降低了SPTs的發(fā)生率，但在5年內(nèi)沒有觀察到風險的降低，風險也永遠不會恢復到基線[4,8]。盡管HNSCC的診斷代表了一個可教育的時機，而且大多數(shù)患者表示對戒煙感興趣，但大約50-70%的當前吸煙者在診斷后繼續(xù)吸煙[9-11]。此外，在30-50%試圖戒煙的人中，即使有戒煙證據(jù)的支持，大多數(shù)人也會復吸[12-14]。還需要采取更多的初級和二級預防戰(zhàn)略。

1953 年，當Slaughter及其同事首次描述上皮區(qū)域癌化或指標腫瘤周圍大體正常粘膜內(nèi)的多中心組織學異常時，提出了HNSCC化學預防的可能性[15]。由于長期接觸煙草和其他環(huán)境致癌物，這種所謂的“固定粘膜”會在整個上呼吸道產(chǎn)生SPTs。當流行病學研究發(fā)現(xiàn)HNSCC和SPTs風險的降低與富含水果和蔬菜的飲食有關(guān)[16-20]，第一個化學預防策略側(cè)重于衍生微量營養(yǎng)素(如維生素A)的藥理學劑量。臨床前模型支持類維生素A、合成維生素A類似物、作為口腔環(huán)境癌變的調(diào)節(jié)劑[21,22]。事實上，在兩項具有里程碑意義的HNSCC化學預防研究中[23,24]，高劑量異維甲酸逆轉(zhuǎn)了口腔癌前病變(OPLs)并預防了STPs。然而，毒性使常規(guī)使用不可行，SPTs發(fā)生率在停止治療后3年內(nèi)恢復到基線水平。在一項隨訪試驗中，低劑量異維甲酸耐受性良好，但不能預防[25]。針對煙草相關(guān)HNSCC和SPTs的有效、可耐受的化學預防劑是一種尚未滿足的全球需求。

HNSCC和SPTs的風險降低與食用十字花科蔬菜的蕓苔科有關(guān)，如西蘭花、羽衣甘藍和卷心菜[16-20]。異硫氰酸酯是由硫代葡萄糖苷衍生的應激反應植物化學物質(zhì)，可有效誘導細胞保護II期酶[26]，增強煙草煙霧[27,28]中的苯、醛和多環(huán)芳烴的解毒作用。植物化學物質(zhì)蘿卜硫素(SFN)是當其前體蘿卜硫苷(GR)被在食物制備或咀嚼過程中釋放的植物黑芥子酶水解時產(chǎn)生的，負責西蘭花提取物 80%的II期酶誘導。 SFN破壞了Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1 (KEAP1)對核因子（紅細胞衍生2）樣 2 (NRF2) 轉(zhuǎn)錄因子的抑制，使NRF2易位至細胞核并結(jié)合抗氧化反應元件(AREs)在靶基因的啟動子區(qū)域，包括解毒化學致癌物的酶，如NAD(P)H醌氧化還原酶 1 (NQO1) [30,31]。未成熟的西蘭花來源，例如西蘭花種子和芽苗，GR濃度高，使西蘭花種子和芽苗提取物(BSSE)成為煙草相關(guān)癌癥化學預防的候選者[29,32]。

我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，SFN降低了4NQO誘導的小鼠HNSCC的發(fā)生率和大小，并且富含SFN的BSSE上調(diào)了健康志愿者口腔黏膜中的NQO1基因轉(zhuǎn)錄本[33]。在人體研究中，各種BSSE配方都具有良好的耐受性[31,33-36]。值得注意的是，同時含有 GR 和 SFN 的 BSSE 可持續(xù)地增加了空氣污染物苯和丙烯醛的解毒作用，這些污染物也存在于煙草煙霧中[37]，推動了這里報告的臨床試驗：一項隨機、交叉試驗，評估兩劑BSSE對健康的現(xiàn)有吸煙者煙草致癌物的解毒作用。

2. 參與者和方法

2.1參與者

這項單中心研究在亞利桑那大學癌癥預防診所(Tucson，AZ，USA)進行，并由美國國家癌癥研究所(NCI)癌癥預防部門通過癌癥預防代理開發(fā)項目：早期臨床研究(HHSN2612012000311)贊助。該方案得到了NCI中央機構(gòu)審查委員會的批準，并按照《赫爾辛基宣言和良好臨床實踐》執(zhí)行。所有參與者均提供了書面的知情同意書。該研究已在clinicaltrials.gov(NCT03402230)注冊。主要納入標準包括：男性或女性年齡≥18歲；目前吸煙≥20包年，自我報告吸煙，目前平均每天≥10支；卡諾夫斯基表現(xiàn)狀態(tài)≥70%；器官和骨髓功能良好。主要的排除標準包括：過去2年內(nèi)有浸潤性癌癥病史；經(jīng)常使用超生理劑量的類固醇；不受控制的并發(fā)疾病。

該試驗是根據(jù)開放標簽、隨機、交叉設(shè)計進行的，評估兩劑BSSE對其他健康、當前重度吸煙者煙草致癌物的解毒作用。參與者被隨機分配到低-高或高-低劑量序列，并作為他們自己的對照。主要目的是確定BSSE是否增加了苯的解毒作用，通過尿中苯的巰基酸，S-苯基巰基酸(SPMA)的排泄變化來測量。次要目標包括：確定BSSE是否增加了丙烯醛和巴豆醛的解毒，通過尿中各自巰基酸、3-羥基丙基巰基醛(3-HPMA)(3-HPMA)和3-羥基-1-甲基丙基巰基醛(3-HMPMA)的排泄變化來測量；通過尿SFN代謝物測定BSSE Avmacol?的生物利用度；確定BSSE是否上調(diào)NRF2靶基因包括NQO1的口腔表達；評估有效SFN劑量、煙草致癌物解毒和NRF2靶基因的口腔表達之間的劑量-反應關(guān)系；并根據(jù)NCI不良事件通用術(shù)語標準(CTCAE)4.0版，描述低劑量和高劑量BSSE的毒性。探索目的是確定谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(GST)等位基因GSTM1和GSTT1是否是煙草致癌物解毒的重要遺傳調(diào)節(jié)因子。我們計劃積累61名符合條件的參與者來開始干預。在同一人群的化學預防研究([38]和NCT02348203)中觀察到，預期流失率≤33%，我們預計至少有41名參與者具有可評估的終點數(shù)據(jù)。最小可評估樣本量為41，總體顯著性水平為5%，至少有80%的能力檢測到0.50標準差(SD)，與類似研究中觀察到的效應量為0.45 SD一致[39]。

2.2 研究藥物和治療計劃

BSSE作為商業(yè)化的營養(yǎng)食品Avmacol?交付，由Nutramax Laboratories, Inc.按照良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP)標準生產(chǎn)。原始Avmacol?配方由富含GR的西蘭花種子提取物、用于芥子酶來源的冷凍西蘭花芽苗、抗壞血酸和用于片劑形成的惰性輔料(羧甲基纖維素、二氧化硅和微晶纖維素)組成。生產(chǎn)規(guī)范要求每片含有至少13 mg GR，并有足夠的黑芥子酶活性，以產(chǎn)生至少5 mg SFN。Avmacol?(RD0416-
03，制造于2016年4月)在整個研究中使用；每片含16 mg(37 μmol) GR，轉(zhuǎn)換為SFN 6 mg(34 μmol)。在整個研究過程中，穩(wěn)定性測試每6個月進行一次，并確認效力，表明在室溫下的保質(zhì)期超過60個月。

在2×2交叉設(shè)計中，每個參與者分別接受低劑量和高劑量的BSSE治療，包括每天4片和8片Avmacol?片(148μmol vs. 296μmol GR)。每個干預期為2周，間隔2周洗脫期，以減輕結(jié)轉(zhuǎn)效應。隨機化是低-高劑量與高-低劑量的順序，如圖1所示。

圖1：研究計劃

估計轉(zhuǎn)化率為35%，由于共同遞送的黑芥子酶和人體腸道微生物組中的β-硫葡糖苷酶的活性，低劑量與高劑量估計約為50與100 μmol SFN生物可利用[40]。每天晚上服用BSSE。從大約下午 6:00 開始到早上 6:00的通宵尿液，在研究期間收集了4次：在第一次BSSE劑量之前的每個治療期的基線；在每個治療期的最后一個晚上BSSE劑量之后。參與者自行將尿液收集到裝有抗壞血酸的不透明罐中，并將罐帶到當天早上的預約地點，在那里測量體積并將兩份10毫升的等分試樣在-80攝氏度下冷凍。 通過細胞刷收集口腔細胞，并在每個治療期的基線和結(jié)束時由訓練有素的協(xié)調(diào)員將其放入1-mL冷凍管中的RNALater，然后立即冷凍并如前所述在-80攝氏度下儲存[41]。

2.3 生物標志物分析

2.3.1 致癌物代謝物

苯、丙烯醛和巴豆醛的尿硫醇酸通過以前在吸煙者群體中使用的靈敏和特異的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測定法進行定量，稍作修改[42,43]。簡而言之，對于SPMA，將一小份尿液與內(nèi)標(SPMA-d5)混合，并在LC-MS/MS分析之前通過固相萃取進行萃取。對于3-HPMA和3-HMPMA，在LC-MS/MS分析之前，將一份尿液與內(nèi)標（分別為3-HPMA-d3、3-HMPMA-13C3-15N）和一份乙酸銨混合。LC MS/MS分析在帶有Surveyor HPLC系統(tǒng)的Therm TSQ Quantum Ultra 三重四極桿質(zhì)譜儀上進行。使用由乙酸銨和甲醇組成的流動相和Synergi MAX RP色譜柱對分析物進行色譜分離，并在負ESI模式下檢測，并使用以下質(zhì)量轉(zhuǎn)換進行多反應監(jiān)測：3-HPMA (220 > 91)、3-HMPMA (234 > 105)、3-HPMA-d3 (223 > 91)、3-HMPMA-13C3-15N (238 > 105)、SPMA (238 > 109) 和SPMA-d5 (243 > 114)。3-HPMA和HMPMA的校準曲線在0.07-150 nmol/mL的尿液濃度范圍內(nèi)呈線性。SPMA的校準曲線在0.2-420 pmol/mL的尿液濃度范圍內(nèi)呈線性。尿中致癌物代謝物水平通過肌酐測定試劑盒（Diazyme實驗室）測定的尿肌酐濃度進行標準化。從單個參與者收集的所有基線和干預后樣本在同一批次中一起分析。

2.3.2 SFN代謝物

GR到SFN的平均轉(zhuǎn)換計算為GR劑量作為夜間尿液中總SFN代謝物排泄的百分比，并在摩爾等量的基礎(chǔ)上進行歸一化。在10-μL注射后，對匹配的基線和治療結(jié)束后的尿液樣本進行SFN、SFN-Cys（299>114）、SFN-GSH（485>179）、SFN-CG（356>114）和SFN-NAC（341.1>114）的重復分析。儀器檢測和LC-MS/MS條件與之前使用的相同[44,45]。SFN代謝物被歸一化為尿肌酐，以解釋收集時間和體積的變化，如前所述的[37]。

2.3.3 Buccal細胞mRNA

使用Quick-RNAMiniPrepPlus(Zymo研究公司，歐文，加州，美國)從存儲的冷凍瓶中分離總mRNA。mRNA濃度通過納米Drop分光光度計(賽默飛世爾科學公司，沃爾思豪，MA，美國)進行定量，并通過Qubit熒光定量進行驗證，如前所述的[41]?？谇籱RNA由Nan?面板定制分析，添加額外的NRF2依賴和不依賴的靶基因，包括：AKR1B10、AKR1C1、CAT、CEACAM1、DEFB、FCER2、GCLC、GCLM、HMOX1、HSPA4、HSPB1、LYVE1、MIF、NFE2L2、NQO1、PPIA、SLC7A11、SMPD1、SOD2和TRAF6。根據(jù)質(zhì)量和可用性，使用純化的100-300ng的mRNA進行nanostring分析。簡單地說，樣本與人類PanCancerIO360面板的基因表達代碼集和定制面板加基因峰值（納米串技術(shù)，西雅圖，華盛頓州，美國）在65?C下雜交19小時。使用高靈敏度設(shè)置，在自動n計數(shù)器準備站上進一步純化并將雜交探針與光學墨盒結(jié)合，并在n計數(shù)器數(shù)字分析儀上以最大分辨率(555FOV)進行掃描。將每個樣本中每個基因的原始計數(shù)導入nSolver分析軟件，通過評估內(nèi)置的陽性對照、結(jié)合密度評估和以上背景的探針數(shù)量來評估總體檢測性能。批校準用于協(xié)調(diào)在不同運行中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，以面板標準作為參考。背景閾值法采用平均+2標準差。使用nCounter高級分析的歸一化模塊，對陽性對照的幾何平均值和管家基因進行了歸一化處理。所有進一步的分析均使用log2轉(zhuǎn)換的歸一化表達式值。

2.3.4 GSTM1和GSTT1基因型

從基線門診就診時收集的循環(huán)血液淋巴細胞中分離出基因組DNA。GSTM1和GSTT1采用上述的標準方法進行基因分型[46]。引物從Eurofifs訂購，使用熒光團，使用毛細管電泳系統(tǒng)進行可視化，并使用PCR擴增遺傳物質(zhì)[46,47]。樣品被稀釋1/50，然后在3730DNA測序儀（應用生物系統(tǒng)公司）上運行。生成的.fsa文件使用基因標記（軟遺傳學）進行可視化。對釉原蛋白未擴增的樣本沒有進行評分，而是再次重新擴增。在274bp處出現(xiàn)超過10Krfu的峰值為GSTM1陽性，在456bp處出現(xiàn)超過10Krfu的峰值為GSTT1陽性。含釉原蛋白擴增陽性的缺失峰被評定為零。

2.4 統(tǒng)計分析

對于SFN和煙草致癌物硫醇酸尿排泄的變化，將濃度歸一化為肌酐，然后由于高右偏進行對數(shù)轉(zhuǎn)換。低劑量和高劑量BSSE后的變化是獨立確定的。后濃度和前濃度之間的幾何平均值與相關(guān)的95%CI的比值來自對數(shù)正態(tài)回歸。計算斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)，以評估通過尿SFN代謝物測量的有效SFN劑量與致癌物解毒之間的相關(guān)性。使用每個參與者的log2（表達的倍數(shù)變化）和log2(肌酐巨大化SFN代謝物濃度的倍數(shù)變化)之間的皮爾遜相關(guān)性，計算與有效SFN劑量相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄本的口腔表達變化。通過使用聚類分析器對與有效SFN劑量最正正相關(guān)或最負相關(guān)的前30個基因進行過度表達分析，來評估功能富集。背景被設(shè)置為在定制的納米串面板中探測的770個基因。擬合線性混合效應模型，以確定有效SFN劑量、致癌物解毒和NRF2靶基因轉(zhuǎn)錄本的變化之間是否存在劑量-反應關(guān)系。為了探討GSTM1和GSTT1基因型是否與解毒相關(guān)，我們采用了雙側(cè)、雙樣本t檢驗。Bonferroni校正用于校正多重比較。McNemar試驗用于比較低劑量和高劑量治療之間每種特定AE的頻率。所有的統(tǒng)計分析均采用SAS9.4軟件包。

3. 結(jié)果

3.1研究的人群

如試驗報告統(tǒng)一標準（圖2）所示，從2018年1月至2019年11月，共有49名參與者被登記。112名潛在參與者接受了電話篩查；58人沒有進行篩查，最常見的原因包括煙草史不足（n=21），不感興趣/拒絕（n=20），取消或不參加篩查（n=7），目前沒有吸煙（n=5）。54名參與者中有5名在篩查訪問中被取消資格，原因是無法參加所有預定的研究訪問(n=2)、未受控制的高血壓(n=1)、未獲得生物樣本的同意(n=1)和臨床顯著的丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)值(n=1)。由于高保留和依從性，試驗提前完成；49名參與者中有48人完成了所有的研究治療和生物標本收集，并對主要終點進行了評估。

圖2：ONSORT圖

表1：基線特征

所有49名入組參與者的基線特征見表1。49名參與者中有26名（53%）為女性，中位年齡為57歲，中位煙草接觸量為36包年，中位每天使用20支香煙。試驗隊列的種族和民族組成與亞利桑那州的吸煙人口相平行，那里的西班牙裔的吸煙率低于非西班牙裔白人[48]。

3.2 研究終點

3.2.1 生物利用度

參與者在BSSE的低劑量和高劑量治療中都表現(xiàn)出SFN代謝物的顯著增加。 SFN代謝物的中位基線尿排泄在第1期為0.009 μmol/mg Cr（四分位距(IQR)：0.01, 0.03），在第2期為0.03 μmol/mg Cr（IQR：0.02, 0.04）（p = 0.02，表明具有統(tǒng)計學意義但可忽略不計的遺留效應）。在低劑量暴露期間，SFN代謝物的幾何平均值從0.03 (0.02, 0.05) 增加到13.3 (7.9, 22.6) μmol/mg Cr，代表后：前比為267.9 (264.7, 826.0; p < 0.0001)。在較高劑量暴露期間，SFN代謝物的幾何平均值從0.03 (0.02, 0.04) 增加到26.09 (16.2, 42.0) μmol/mg Cr，代表后：前比為 990.0 (592.2, 1655.1; p < 0.0001)。夜間收集尿液的中位持續(xù)時間為11小時(范圍5.8-13.7h)。BSSE在前11小時的平均生物利用度，通過夜間尿液中總SFN代謝物除以總給藥GR劑量，按摩爾當量標準化，低劑量治療為11%(范圍0.04-59%；SD11%)，高劑量治療為10%(范圍0.1-46%；SD10%)。觀察到SFN代謝物的劑量（低與高）和尿排泄之間的劑量反應關(guān)系（p < 0.01），該模型源自具有隨機截距的線性混合效應模型，該模型在調(diào)整期間效應后解釋了受試者內(nèi)的相關(guān)性。

3.2.2 致癌物解毒

表2概述了三種特定煙草致癌物的解毒產(chǎn)物在尿液排泄中的變化。高劑量的BSSE顯著上調(diào)當前重度吸煙者對苯、丙烯醛和巴豆醛的解毒作用。低劑量BSSE顯著上調(diào)苯的解毒作用，而丙烯醛和巴豆醛則沒有上調(diào)作用。

表2：致癌物代謝物的尿排泄

苯的巰基尿酸 (SPMA) 的中位基線尿排泄量在第1期為8.1 pmol/mg Cr (IQR 4.8, 13.6)，在第 2期為8.0 pmol/mg Cr (IQR 4.4, 11.6)（p = 0.35，表明無結(jié)轉(zhuǎn)效應）。在高劑量BSSE期間，SPMA的幾何平均值從7.6 (6.2, 9.4) 增加到9.1 (7.3, 11.3) pmol/mg Cr，代表后：前比為1.2 (1.0, 1.4; p = 0.04)。3-HPMA的幾何平均值從9934.5 (8008.0, 12,324.4) 增加到11,032.1 (9161.1, 13,285.2) pmol/mg Cr，代表后：前比例為1.3 (1.1, 1.5; p < 0.01)。3-HMPMA的幾何平均值從10,808.6 (8947.3, 13057.0) 增加到12,795.1 (10,922.9, 14,988.1) pmol/mg Cr，代表后：前比為1.2 (1.0, 1.4; p = 0.02)。在高劑量BSSE治療期間，SFN的有效劑量與苯 (rho = 0.21)、丙烯醛 (rho = 0.15) 和乙醛 (rho = 0.16) 的解毒作用呈適度正相關(guān)。

3.2.3 頰細胞基因表達

治療后的基因表達表現(xiàn)出顯著的變異性。為了進一步探索這一點，我們根據(jù)基因與有效SFN劑量的皮爾遜相關(guān)性對基因進行了排序(補充表S1)。NRF2依賴基因NQO1和GCLM的相關(guān)系數(shù)分別為0.38和0.34，在所有770個基因中排名第一和第二。利用基因本體論(GO)生物過程(BP)對與有效SFN劑量呈正相關(guān)的前30個基因進行功能富集評估。雖然經(jīng)過多次測試調(diào)整后的富集p值不顯著，但排名最高的生物過程是“細胞氨基酸代謝過程”(GO：0006520)、“有機氮化合物代謝過程”(GO：1901564)、“細胞應激反應”(GO：0033554)和“白細胞凋亡過程”(GO：0071887)(補充表S2)。

3.2.4 GSTT1和GSTM1基因型

我們評估了與NRF2解毒途徑相關(guān)的兩個GST等位基因GSTM1和GSTT1，GSTT與高劑量BSSE的主要終點的關(guān)聯(lián)。48名參與者中有25名（52%）GSTM1呈陽性。48名參與者中有40人（84%）GSTT1呈陽性。GSTT1陰性與陽性的參與者相比，SPMA的基線排泄顯著減少(p=0.02)。這兩種等位基因均與3-HPMA或3-HMPMA的基線排泄無關(guān)。苯、丙烯醛或巴豆醛解毒作用的上調(diào)與基因型無關(guān)。

3.2.5 SPMA解毒的線性回歸分析

僅在較高劑量期間對對數(shù)轉(zhuǎn)換的SPMA的變化進行探索性線性回歸分析，以確定與致癌物解毒最密切相關(guān)的變量。首先，評估包括年齡、性別、種族、種族、體重指數(shù)、GST基因型和頰側(cè)基因表達變化在內(nèi)的變量與SPMA變化的單變量關(guān)聯(lián)。然后將未調(diào)整p值<0.01的變量包括在調(diào)整后的分析中（補充表 S3）。 與苯解毒最密切相關(guān)的變量是層粘連蛋白-5γ-2 (LAMC2; p < 0.001)、干擾素誘導的跨膜蛋白 1 (IFITM1; p = 0.018) 和glypican 4 (GPC4; p = 0.027)。

3.2.6 安全性和毒性

表3通過低劑量或高劑量暴露總結(jié)了由方案治療引起的不良事件(AE)。49 名參與者中有29名(59%)報告了至少一種輕度1級或2級AE；所有29 (100%)人都注意到胃腸道AE。未報告3級或更高級別的AE。最常見的AE是不符合 CTCAE標準的稀便(24%)或腹瀉(22%)，均為1級。49名參與者中有10名(20%) 經(jīng)歷了通常與稀便或腹瀉相關(guān)的輕度腹痛或痙攣更高的劑量暴露；4例AE為1 級，6例為2級。在大劑量治療期間輕度腹痛和腹瀉的發(fā)生率顯著增加（分別為 p < 0.01和0.02）；這些預期的AE已在先前的研究中觀察到，并且可能歸因于BSSE補充劑的高纖維含量[31,33-36]。然而，沒有參與者因治療相關(guān)的AE退出研究。一名隨機分配到高低劑量序列的參與者在經(jīng)歷無關(guān)的心肌梗塞后在清除期退出研究。

表3：治療相關(guān)緊急不良事件

4. 討論

上呼吸道癌癥，包括HPV陰性的HNSCC，與長期暴露于環(huán)境致癌物有關(guān)，主要是那些存在于煙草煙霧中的致癌物，包括苯、醛和多環(huán)芳烴。由此產(chǎn)生的上皮區(qū)域癌變表現(xiàn)為HNSCC指數(shù)治療后的高發(fā)病率和經(jīng)常致命的SPTs。即使成功了，戒煙也只能部分地降低SPT的風險。盡管對HNSCC有50年的合理化學預防努力的歷史，但沒有發(fā)現(xiàn)任何藥物足夠安全和有效，可以成為治療的標準。目前的臨床試驗有三個關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：首先，SFN可以預防口腔癌變4NQO模型中的HNSCC，這是一種對人類HPV陰性HNSCC具有高分子保真度的臨床前模型[49]。第二，SFN在健康志愿者的口腔上皮細胞中具有生物活性，上調(diào)NRF2靶基因[33]。最后，每天攝入600 umol GR和40 umol SFN的不同BSSE制劑，在12周的干預期內(nèi)，對室外空氣污染物苯和丙烯醛(煙草煙霧中也有)有持續(xù)的解毒作用[37]。

這項隨機交叉臨床試驗的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)是，BSSE Avmacol?，由GR和活性黑莓酶組成，在健康的吸煙者中，在2周的暴露期中，當給予較高劑量時，可上調(diào)煙草致癌物質(zhì)苯、丙烯醛和巴豆醛的解毒作用。盡管該試驗人群的平均生物利用度約為單劑量8片正式生物利用度研究中描述的一半[40]，但SFN暴露足以產(chǎn)生生物活性。

較高的8片BSSE劑量，含有296 μmol GR，在第一個11小時內(nèi)平均生物利用度為30 μmol SFN，更有效；然而，沒有觀察到SFN有效劑量和解毒反應之間的正式劑量-反應關(guān)系。解釋可能是雙重的。首先，啟東空氣污染研究中使用的BSSE產(chǎn)品同時含有GR和SFN，后者70-80%的生物利用度為SFN代謝物，并支持較低四分位數(shù)的劑量[37]。Avmacol?聯(lián)合給藥GR和黑芥子酶，但是仍然需要GR到SFN的原位轉(zhuǎn)化，從而導致有效SFN劑量的更高變異性。第二，與啟東市研究所有參與者暴露的室外空氣污染物的濃度相同，由于呼吸同一區(qū)域的空氣，當前試驗是在不同的致癌物暴露情況下進行的，具體取決于個體參與者每天吸煙的品牌和數(shù)量。值得注意的是，在一項啟東市空氣污染的隨訪研究中，評價三種BSSE劑量(原始劑量為600 μmol GR和40 μmol SFN；一半劑量；五分之一劑量)，其中只有原始劑量對應的24 h尿量中值為24.6 μmol SFN代謝物與安慰劑對照顯著不同[50]。在目前對吸煙者的研究中，SFN代謝物和致癌物質(zhì)暴露的個體間較高的差異可能掩蓋了預期的劑量-反應關(guān)系。

在綠色化學預防中，使用植物或其簡單提取物作為防癌劑，一個經(jīng)常和重要的問題是，是否可以通過正常飲食達到具有生物活性的保護性植物化學物質(zhì)。市場階段西蘭花的GR含量變化很大，主要取決于基因型，但田間位置、年份、干旱條件和病害壓力等環(huán)境條件也有影響[51,52]。對巴爾的摩地區(qū)超市購買的31個新鮮的、未煮的市集階段西蘭花頭(Brassica oleracea var. italica)進行研究，其平均GR含量為每克0.4 μmol (0.005 ~ 1.1μmol)[53]。平均而言，大約28盎司的市售西蘭花的GR含量和本研究使用的高劑量Avmacol?差不多。因為西蘭花芽苗含有成熟植物10-100倍的GR，且具有豐富的黑芥子酶活性來源，其消耗可能更實用[32]。

SFN代謝物和口腔細胞中基因表達變化之間的相關(guān)性也發(fā)現(xiàn)了很高的個體間可變性。口腔細胞是研究煙草吸煙者中據(jù)稱的化學預防劑生物效應的替代上皮組織[41]。盡管如此，這項探索性分析發(fā)現(xiàn)，參與細胞氨基酸和有機氮化合物代謝、細胞對應激刺激的反應和內(nèi)在凋亡的基因的過度表達與有效的SFN劑量相關(guān)。細胞保護抗氧化反應的上調(diào)，包括解毒酶如NQO1和GCLM，是SFN的一種依賴于NRF2的機制，表明該分析方法的相關(guān)性。在臨床前模型中，SFN還通過抑制NF-kB來減少慢性炎癥，并通過表觀遺傳機制增強內(nèi)在細胞凋亡[54,55]。有趣的是，多變量分析還發(fā)現(xiàn)了IFITM1的口腔表達變化，一種具有抗增殖和抗炎功能的干擾素誘導蛋白，與苯解毒顯著相關(guān)[56,57]。這些探索性的發(fā)現(xiàn)與SFN可能通過NRF2依賴和不依賴的機制來對抗癌變過程中出現(xiàn)的解毒、炎癥和凋亡失調(diào)的假設(shè)相一致。

在之前的研究中，包括啟東空氣污染研究，GSTT1而不是GSTM1基因型影響基線苯代謝。特別是，與GSTT1等位基因陽性的參與者相比，GSTT1等位基因陰性的參與者的SPMA基線排泄明顯減少。然而，研究治療對苯解毒反應的上調(diào)與GST多態(tài)性無關(guān)。有趣的是，一個類似的試驗評估異硫氰酸酯2-苯基異硫氰酸酯(PEITC)苯和丙烯醛解毒在吸煙者發(fā)現(xiàn)單或雙缺失多態(tài)性GSTT1和GSTM1不成比例地受益于治療[39]，這種效應可能是可見的，因為有82名參與者。由于GSTT1和GSTM1的缺失多態(tài)性與HNSCC風險增加相關(guān)，并與煙草暴露相互作用[58]，因此使用異硫氰酸酯的化學預防可能對雙陰性個體最有益。

在之前的各種BSSE試驗中觀察到，毒性主要是胃腸道毒性，表現(xiàn)為1級稀便或腹瀉，并伴有輕度、痙攣性腹痛。這些AEs在高劑量治療中更常見，預計是由于纖維含量，但并不妨礙依從性。事實上，與我們之前在同一人群中([38]和NCT02348203)進行的研究相反，我們只觀察到3%對33%的脫落率。因此，高保留率和依從性導致49名參與者提前完成試驗，而不是61名。

雖然該試驗代表了美國亞利桑那州的吸煙人口，但該研究隊列主要是西班牙裔和非西班牙裔白人。這是一個公認的限制，盡管不太可能改變機械性的概念證明。這項隨機、安慰劑對照的隨訪研究將在多個中心進行，以捕捉北美的種族和民族多樣性，從而產(chǎn)生更具代表性和一般化的結(jié)果。

5. 結(jié)論

本研究增加了越來越多的文獻，表明異硫氰酸酯的消費，集中在十字花科蔬菜的蕓苔屬植物中，增強了環(huán)境致癌物質(zhì)的解毒，包括苯和丙烯醛，這些物質(zhì)在空氣污染和煙草煙霧中很常見。此處和其他研究中觀察到的低毒性和高依從性提高了對環(huán)境致癌作用的可耐受、長期化學預防策略的承諾。未來的研究將促進商業(yè)膳食補充劑的提供，包括這里研究的BSSE Avmacol?，具有可預測濃度，可接受的生物利用度，按照GMP標準生產(chǎn)，以及在環(huán)境溫度下的長保質(zhì)期；這與不切實際的種植、收獲和生產(chǎn)3天的西蘭花芽提取物形成對比，這些已不再用于臨床試驗。在高危人群中，逐步開發(fā)抗煙草相關(guān)致癌是必要的。一項多中心、隨機、安慰劑對照試驗現(xiàn)在計劃在其他健康、重度吸煙者中評估12周內(nèi)高劑量BSSE對苯和丙烯醛解毒的可持續(xù)性(NCT05121051)。

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