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蘿卜硫素增強人體谷胱甘肽并影響人腦代謝物的一項臨床研究
發(fā)表于：2021-12-14 作者：Thomas W. Sedlak 來源：Molecular Neuropsychiatry 點擊量：8471
原文：Thomas W. Sedlak, Leslie G. Nucifora, Koga M , et al. Sulforaphane Augments Glutathione and Influences Brain Metabolites in Human Subjects: A Clinical Pilot Study[J]. Molecular Neuropsychiatry, 2017, 3(4):214-222.
翻譯：
蘿卜硫素增強人體谷胱甘肽并影響人腦代謝物的一項臨床研究
摘要
精神分裂癥和其他神經(jīng)精神疾病期待著有與機制相關(guān)的干預措施。已有多項研究表明，過量的氧化應激越來越多地被認為參與腦疾病的病理生理過程，且主要抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）也相應減少。關(guān)于通過成像技術(shù)用于評估大腦中氧化應激相關(guān)變化的技術(shù)警告，已迫使研究人員探索外周GSH作為氧化應激相關(guān)腦變化的可能病理特征。在GSH缺乏的臨床前模型中，我們發(fā)現(xiàn)了全腦和外周GSH水平之間的相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)，在每日口服給藥7天后，天然存在的異硫氰酸酯蘿卜硫素增加健康受試者血液的GSH水平。同時，我們通過7-T磁共振波譜探討了蘿卜硫素對前扣帶皮層，海馬和丘腦中腦GSH水平的潛在影響。除了在服用蘿卜硫素后大腦谷胱甘肽水平的持續(xù)增加外，還觀察到血液和丘腦谷胱甘肽在服用蘿卜硫素前后的比例呈顯著正相關(guān)。這項臨床試驗研究表明，探索外周GSH水平與臨床/神經(jīng)心理測驗的關(guān)系，以及蘿卜硫素對神經(jīng)精神疾病中功能改變的影響，具有重要的價值。
關(guān)鍵詞
蘿卜硫素；谷胱甘肽；氧化應激
1. 引言
氧化應激是多種人類疾病的病理生理學的基礎，從心血管綜合征和糖尿病到神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病和帕金森病[1-5]。此外，最近的研究表明，氧化應激也在神經(jīng)精神疾病如精神分裂癥（SZ）中發(fā)揮作用[6-9]。
谷胱甘肽（GSH）是氧化應激和氧化還原平衡最重要的調(diào)節(jié)劑之一。這種抗氧化劑三肽以低毫摩爾細胞內(nèi)水平存在，并被超過20種酶直接利用以發(fā)揮其抗氧化和細胞保護作用。GSH參與許多疾病的病理狀態(tài)已早有報道[10-13]。
研究和治療腦部疾病的障礙是獲得生物標本，這些標本更容易用于外周疾病。因此，許多研究依賴于更容易獲得的血液和腦脊髓液樣本來表征神經(jīng)精神疾病的分子基礎[14-23]。盡管受試者之間存在差異，但多項研究報道，在外周可獲得的組織和液體（如血液）中，精神分裂癥中GSH顯著降低[6,18,19,24-29]。
然而，與精神分裂癥相關(guān)的腦中GSH的分子分布尚不清楚。體內(nèi)磁共振波譜（MRS）是一種用于測量腦代謝物水平的分析技術(shù)[30]。MRS的成功應用顯示精神分裂癥患者的腦谷氨酸（Glu）和γ-氨基丁酸（GABA）水平發(fā)生了改變[31-34]。相比之下，GSH的數(shù)據(jù)不太一致[19,35,36]。3-T MRS檢測谷胱甘肽水平的敏感性有限可能是這種不一致的潛在原因，而使用7-T MRS的研究應該改進檢測，并產(chǎn)生更一致的結(jié)果。因此，目前對基于MRS的GSH指標的解讀應持謹慎態(tài)度。目前的MRS方法可能不夠靈敏，無法檢測與病理改變相關(guān)的微妙但關(guān)鍵的變化。因此，許多研究人員正在探索外周GSH作為氧化應激相關(guān)腦變化的可能標志的潛在效用。
蘿卜硫素是一種天然的植物化學物質(zhì)，富含在十字花科植物的種子和芽，如西蘭花。它在創(chuàng)傷性腦和脊髓損傷的臨床前模型中顯示出前景[37,38]。蘿卜硫素通過與細胞抑制因子KEAP1結(jié)合并分離的能力激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 [39,40]。因此，蘿卜硫素有望促進適當?shù)难趸€原平衡和對氧化應激[41]的保護。由于其存在于消費性食品中，因此蘿卜硫素是進一步人類研究的有吸引力的候選者。事實上，它在治療哮喘、空氣污染損傷、良性前列腺增生、紫外線引起的紅斑、糖尿病、控制幽門螺桿菌(胃癌的一種致癌物)，以及預防多種不同癌癥方面都有潛在的應用價值[42-44]。最近的報道表明，使用蘿卜硫素可改善諸如自閉癥和精神分裂等人類大腦疾病狀況[45-47]。盡管如此，仍然難以理解蘿卜硫素如何與神經(jīng)精神病癥的發(fā)病機制相關(guān)聯(lián)。
我們假設向受試者使用蘿卜硫素可以增加血液和腦部GSH水平，并且外周血GSH水平可以反映大腦中的氧化應激和氧化還原相關(guān)的生理學和病理生理學。鑒于蘿卜硫素可能是一種候選治療方法，研究蘿卜硫素對GSH的影響可能是確定預測有益效果的標志物的第一步。
2. 方法
2.1 小鼠模型
本研究中使用具有CD1背景的神經(jīng)元谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1敲除（Eaac1 KO）小鼠[48]和野生型（WT）小鼠，并將其置于受控設施中（23±1℃； 50±5％濕度；光照和黑暗循環(huán)分別在上午7點和下午7點開始），可自由獲取食物和水。在來自3個月大的雄性小鼠（Eaac1 KO小鼠，n = 4；WT小鼠，n = 5）的全腦中定量GSH水平。 我們利用雄性動物作為嚙齒動物GSH酶水平在發(fā)情期間波動高達50％[49]。三個月大的動物體內(nèi)的谷胱甘肽水平不像一歲以上的嚙齒動物那樣隨年齡增長而下降（3個月齡的動物沒有年齡依賴性的GSH水平下降）[50]。
2.2 西蘭花芽提取物（蘿卜硫素）
本研究中使用的西蘭花芽提取物是一種高度標準化的蘿卜硫素配方制劑[51,52]。如前所述[45,53-58]，2個西蘭花提取物凝膠膠囊中蘿卜硫素的標準含量為100μmol，每天2粒，連續(xù)7天。100μmol蘿卜硫素的劑量和7天的治療持續(xù)時間是根據(jù)先前的研究經(jīng)驗確定的，包括一項試驗證明在受試者的鼻腔灌洗細胞中誘導抗氧化酶[59]和改善空氣污染物的排泄[56]。本蘿卜硫素的配方生物利用度為80%[58]，口服攝入后1小時達到血漿峰值水平，一級動力學下降，并在尿液中積極排泄（8小時為60％）[58,60]。
2.3 人類研究受試者
在美國馬里蘭州巴爾的摩的約翰霍普金斯精神分裂癥中心招募了9名健康志愿者（5名男性和4名女性）。人口統(tǒng)計信息見表1。男性和女性的GSH水平相似[61]。本研究包括年齡較小的受試者（年齡21-26歲，1名受試者年齡56歲）。如果受試者有嚴重精神疾病的個人或直系親屬病史、近期醫(yī)院感染史、慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病、導致意識喪失的創(chuàng)傷性頭部損傷或活性物質(zhì)濫用，則被排除在外。我們將煙草吸煙者排除在本研究之外，因為吸煙是已知的氧化應激誘導因子[62,63]。具有MRI掃描禁忌癥的患者，例如依賴于苯二氮卓類藥物，禁止性幽閉恐怖癥，金屬植入物或假肢，起搏器或?qū)κ茉囌邩?gòu)成安全風險的任何醫(yī)學病癥（例如，中耳疾?。┮脖慌懦谕?。
2.4 臨床研究設計
受試者完成了兩次間隔時間為7天（1周）的隨訪。受試者每天早晨空腹服用2個西蘭花芽提取物凝膠膠囊給（內(nèi)含100μmol蘿卜硫素），為期1周。研究人員通過電話聯(lián)系受試者，提醒受試者每天服用按時按量西蘭花提取物。在第一次給藥前和最后一次給藥后4小時內(nèi)收集尿液和血液樣本。在第一次給藥前和最后一次給藥后4小時內(nèi)進行MRS掃描。受試者完成了服用提取物的日期和時間的日志記錄，并記錄了他們在研究期間所經(jīng)歷的任何潛在不適或疾病。三名受試者在空腹服用提取物時表示輕度到中度惡心或腹痛。研究設計總結(jié)在在線補充圖1中（對于所有在線補充材料，請參見
www.karger.com/doi/10.1159/000487639 ）。
2.5 血液和腦組織中GSH水平的測量（小鼠和人類）
GSH總量(GSH和谷胱甘肽二硫醚的總和[GSSG])采用Tietze方法的改進方法在人血細胞中測定[64]。我們將“總GSH”簡稱為“GSH”。 我們使用這些方法在多項研究中量化了GSH和氧化應激[18,65,66]。將非單核細胞血細胞重懸于含有200mM 2-（N-嗎啉代）乙磺酸和1mM EDTA（乙二胺四乙酸）的緩沖液中并超聲處理。裂解后的細胞懸液在4℃下以10000 g旋轉(zhuǎn)15分鐘。通過加入50％v / v新鮮制備的10％偏磷酸將所得上清液脫蛋白，然后在室溫下孵育5分鐘。然后將脫蛋白質(zhì)樣品以2,000g旋轉(zhuǎn)2分鐘，并將上清液儲存在-20℃直至測定。通過向100μL經(jīng)過偏磷酸處理的細胞裂解物中加入5μL新制備的4M三乙醇胺進行動力學測定。然后嚴格按照制造商的說明使用試劑盒（Cayman Chemical Company； 703002）測量GSH。測量GSH對5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）還原的415nm處吸光度的增加速率反映了總GSH含量。使動力學測定運行20分鐘，每隔1分鐘收集數(shù)據(jù)。血漿中總GSH的濃度報告為nmol / mL。使用0至16nmol / mL的標準曲線校準測定。使用2次獨立測量的平均值確定每個報告的GSH值。
2.6 7-T磁共振光譜（7-T MRS）
使用配備有32通道頭部線圈（Nova Medical，Wilmington，MA，USA）的7-T掃描儀（Philips Achieva； Philips，Best，The Netherlands）掃描所有受試者。采用梯度回波序列(FOV = 220×220×180 mm)磁化制備快速采集3D T1加權(quán)圖像。使用刺激回聲采集模式序列（TE / TM / TR = 14/33 / 3,000ms，NEX = 128），從前扣帶皮層（ACC； 30×30×30mm），左側(cè)海馬（HP； 35×15×15mm）和雙側(cè)丘腦（THAL； 20×30×15mm）記錄光譜，除了2個受試者，其中光譜僅從ACC記錄，體素大小為38×30×30mm（在線補充圖2）。
并非所有剩余的受試者都獲得了針對所有三個大腦區(qū)域的MRS數(shù)據(jù)。VAPOR（可變功率和優(yōu)化的弛豫延遲）水抑制用于最小化主要水信號[67]。另外，還從每個體素（NEX = 16）獲得沒有水抑制的參考掃描。利用LCModel軟件包對光譜進行分析[68]，并從VeSPA項目中模擬出一個基集[69]。以未抑制的水信號為參照，對代謝物濃度進行歸一化。擬合誤差采用CRLBs (Cramér-Rao下界)進行評估。代謝物濃度僅在相應的CRLB值低于20%時才納入進一步的統(tǒng)計分析。
我們研究的目的是確定蘿卜硫素治療后腦GSH水平的變化，可能與血液GSH水平相關(guān)； 因此GSH是我們的主要結(jié)果指標。 GABA，谷氨酰胺（Gln），Glu和N-乙酰天冬氨酸（NAA）作為次要結(jié)果測量。使用配對t檢驗比較GABA，Gln，Glu，GSH和NAA濃度的治療前和治療后測量值之間的差異。
表1. 臨床和人口統(tǒng)計學特征
圖1. 測量野生型（WT）和Eaac1敲除（+/-）小鼠中血細胞和腦組織中的谷胱甘肽（GSH）水平。a. 與WT同窩小鼠（n = 5）相比，3個月大的雄性Eaac1 +/-小鼠（n = 4）中淋巴細胞中總GSH水平顯著降低。b. 與WT同窩小鼠相比，Eaac1 +/-小鼠中全腦中總GSH水平顯著降低。c. 各個動物（白色圓圈，WT小鼠； 黑色圓圈，Eaac1 +/-小鼠）中淋巴細胞和腦中總GSH的水平不同。然而，淋巴細胞中總GSH水平與腦中總GSH水平的比例是恒定的。
圖2.測量人血細胞中谷胱甘肽（GSH）的水平。在給予蘿卜硫素（SFN）1周后，細胞GSH顯著增加（雙尾，配對t檢驗：p = 0.02）。
2.7 分析與統(tǒng)計
使用R版本3.3.0 for Windows進行統(tǒng)計分析。使用蘿卜硫素前和后血液GSH比值和代謝物比值計算通過MRS測量的血液GSH水平和腦代謝物水平之間的相關(guān)關(guān)系。血GSH比值采用Shapiro-Wilk正態(tài)檢驗確定為非參數(shù)；因此，我們采用Spearman相關(guān)系數(shù)來確定血GSH與腦MRS數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。對于非參數(shù)數(shù)據(jù)，使用Mann-Whitney檢驗對WT和Eaac1 KO小鼠中淋巴細胞和腦中的總GSH水平進行兩組比較。Spearman相關(guān)系數(shù)用于確定大腦中總GSH水平與小鼠淋巴細胞中GSH水平之間的關(guān)系。
Spearman的相關(guān)分析和成對的雙尾t檢驗用于確定性別對對血GSH水平中蘿卜硫素反應的影響。Wilcoxon秩和檢驗用于確定種族類別是否是血液中GSH水平的協(xié)變量。Pearson相關(guān)分析用于確定年齡對血液GSH水平中蘿卜硫素反應的影響。為了進行徹底的分析，使用單變量和多變量線性回歸模型分別確定種族和年齡以及性別和種族對THAL GSH水平的蘿卜硫素響應的影響。應用Shapiro-Wilk測試來確認正態(tài)性（參數(shù)或非參數(shù)）。 使用Benjamini和Hochberg的方法調(diào)整p值。 所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差（SD）和α值p <0.05。
3. 結(jié)果
3.1 小鼠模型中觀察到的外周和腦GSH水平
我們檢測了外周GSH水平是否可以反映動物模型中腦GSH水平的病理生理變化。我們最初使用小鼠模型系統(tǒng)，在這些模型所提供的受控遺傳和環(huán)境條件下，研究血液和大腦中GSH缺乏的影響。由于研究蘿卜硫素對GSH水平的影響是我們的主要目標，人體研究通常具有一定程度的遺傳和環(huán)境變異性，我們希望小鼠模型可以指導我們的人體研究來檢查外周腦與腦內(nèi)GSH水平之間的關(guān)系在控制遺傳和環(huán)境系統(tǒng)下。我們使用Eaac1 KO小鼠，由于其合成不足，大腦中的GSH水平降低[48]。首先，我們重復了先前的研究結(jié)果[48]，與WT小鼠相比，Eaac1 KO小鼠的腦GSH水平降低（圖1a）。我們的研究表明，與WT小鼠相比，Eaac1 KO小鼠的外周循環(huán)淋巴細胞大大降低了GSH水平（p = 0.008）（圖1b）。重要的是，腦和外周GSH水平在WT和KO小鼠中顯著相關(guān)（ρ= 0.967； p <0.001）（圖1c）。因此，雖然我們需要謹慎地推廣這些觀察結(jié)果，但外周GSH水平的測量可能是腦GSH水平的潛在有用指標。
3.2 每日服用蘿卜硫素連續(xù)7天后，受試者的血液GSH水平升高
服用前和服用后尿液分析證實存在尿蘿卜硫素代謝物，證實受試者遵守口服蘿卜硫素方案(數(shù)據(jù)未顯示)。在給予蘿卜硫素1周后，研究受試者證實了非單核細胞中GSH的顯著增加，其包括T細胞，B細胞和NK細胞的混合物（圖2）。給予蘿卜硫素前GSH水平為9。22 nmol / mL，使用蘿卜硫素后為12。2 nmol / mL，增加32％。蘿卜硫素對GSH影響與受試者的年齡（r = -0.1936； p = 0.62）和他們的性別（ρ= 0.087； p = 0.825）都沒有相關(guān)性。也沒有發(fā)現(xiàn)種族是一個解釋變量，正如四組的Wilcoxon秩和檢驗所證明的那樣（p = 0.318）。
3.3 通過MRS測量腦代謝物
在這項研究中，我們獲得了三個不同腦區(qū)（THAL，HP和ACC）中五種代謝物（GSH，GABA，Gln，Glu和NAA）的測量值。我們特別選擇了這三個大腦區(qū)域，因為它們是精神分裂癥 [70-77]中受影響的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和功能連接的基礎。我們在本研究中的主要假設是蘿卜硫素可能影響這些大腦區(qū)域的GSH水平，并可能與外周血中的GSH水平相關(guān)。
我們發(fā)現(xiàn)HP GSH從1。11±0.34增加到1。38±0.28 mM（p = 0.041；配對，雙尾t檢驗；在線補充圖2）。THAL和ACC中GSH水平的變化沒有達到顯著性。在給予蘿卜硫素之前和之后，THAL GSH水平的代表性成對分析顯示在在線補充圖3中。關(guān)于針對本研究的非主要假設量化的其他腦代謝物，THAL中的Gln水平從1。21±0.22增加至1。49±0.26mM（p = 0.017；配對，雙尾t檢驗）。由于樣本量有限，在多次比較的事后校正后，增加并不顯著，但在考慮受試者數(shù)量較少時，結(jié)果仍然具有啟發(fā)性。
通過線性回歸分析確定，腦GSH水平的蘿卜硫素響應不受年齡，性別或種族的影響。我們對THAL中測量的GSH水平進行了代表性分析，因為該區(qū)域產(chǎn)生的結(jié)果與蘿卜硫素攝入前后血液中GSH水平的生化測量最顯著相關(guān)。在多元線性回歸分析中，對于年齡，性別和種族使用蘿卜硫素之前和之后THAL中GSH水平的各自p值分別為0.582,0.900和0.567，并且種族單變量分析中p = 0.406?？偟膩碚f，年齡，性別和種族不是與腦GSH水平的蘿卜硫素反應相關(guān)的協(xié)變量。
我們觀察到血液中的GSH水平與THAL腦區(qū)域中的GSH水平之間顯著正相關(guān)（ρ= 0.943； p = 0.017； q = 0.051）。為了提高透明度，我們還報告了在三個不同的腦區(qū)測量的所有五種代謝物的相關(guān)結(jié)果（在線表1)。使用蘿卜硫素后，血液GSH的增加與THAL中的GABA，Gln，Glu和GSH正相關(guān)。雖然這些相關(guān)性在多次比較后并不顯著，但仍然具有啟發(fā)性。 功效分析計算表明，n = 50的樣本量將產(chǎn)生顯著的結(jié)果，這將是未來研究的重點。
4. 討論
我們報道，短期使用蘿卜硫素足以顯著增加受試者的外周GSH水平。我們發(fā)現(xiàn)HP中GSH增加，但在評估的大腦區(qū)域中沒有。外周GSH比值與蘿卜硫素處理后THAL中的腦GSH水平具有強烈且顯著正相關(guān)，與我們的遺傳和環(huán)境均一的臨床前GSH缺乏小鼠模型研究獲得的結(jié)果一致。
在這項研究中，我們進行了統(tǒng)計分析，以驗證年齡、性別和種族不影響參與人群中GSH水平的蘿卜硫素反應。雖然據(jù)報道GCLC GAG TNR多態(tài)性影響歐洲高加索人群中的GSH水平[78]，但我們報道特定基因型可能不會影響我們研究人群（包括非裔美國人在內(nèi)的北美人群）的水平[79]。遺傳和/或環(huán)境因素可能影響GSH水平的蘿卜硫素反應仍然是難以捉摸的。
如已經(jīng)報道的心血管和腦血管疾病，可能需要更長的治療持續(xù)時間和/或更高的劑量。例如，在涉及患有2型糖尿病的受試者的臨床試驗中，報告了氧化應激的改善，其中劑量為10g /天（~225μmol）的蘿卜硫素，持續(xù)時間為4周，每次顯著高于目前研究[80]。這可能是因為我們在本研究中僅觀察到蘿卜硫素處理后大腦代謝物的暗示性變化。然而，我們的短期給藥策略耐受性良好，這將進一步促進隨后的蘿卜硫素方案，以試圖將臨床生物標志物與患者導向的結(jié)果聯(lián)系起來。
當通過標準生化測定法定量兩者時，外周和腦GSH水平在小鼠中相關(guān)。盡管如此，至少對于使用蘿卜硫素的當前劑量和持續(xù)時間而言，目前尚不清楚血清中的蘿卜硫素引起的血液中GSH的增加對于大腦意味著什么。在受試者中通過MRS估計腦中的GSH濃度具有局限性或者至少目前需要謹慎[81]。蘿卜硫素可能穿過血腦屏障，盡管它的效力和必要的劑量在人類中尚未建立。在大鼠中，外周給藥蘿卜硫素可誘導大腦中的抗炎HO-1基因，對腦卒中、創(chuàng)傷性腦損傷和苯環(huán)利定誘導的運動亢進均有有益作用[37,82,83]。
蘿卜硫素干預的結(jié)果研究將受益于將臨床表型與客觀測量的生物標志物聯(lián)系起來，這些生物標志物可能反映了疾病的病理生理學[47]。例如，在提交的研究中，我們將報告外周GSH水平可能與認知功能相關(guān)。因此，我們認為探索外周GSH與臨床/神經(jīng)心理學測量之間可能的相關(guān)性以及蘿卜硫素對神經(jīng)精神障礙中改變的功能測量的影響具有重要意義。本研究是后期同類研究的關(guān)鍵起點。
翻譯：
蘿卜硫素增強人體谷胱甘肽并影響人腦代謝物的一項臨床研究
摘要
精神分裂癥和其他神經(jīng)精神疾病期待著有與機制相關(guān)的干預措施。已有多項研究表明，過量的氧化應激越來越多地被認為參與腦疾病的病理生理過程，且主要抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）也相應減少。關(guān)于通過成像技術(shù)用于評估大腦中氧化應激相關(guān)變化的技術(shù)警告，已迫使研究人員探索外周GSH作為氧化應激相關(guān)腦變化的可能病理特征。在GSH缺乏的臨床前模型中，我們發(fā)現(xiàn)了全腦和外周GSH水平之間的相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)，在每日口服給藥7天后，天然存在的異硫氰酸酯蘿卜硫素增加健康受試者血液的GSH水平。同時，我們通過7-T磁共振波譜探討了蘿卜硫素對前扣帶皮層，海馬和丘腦中腦GSH水平的潛在影響。除了在服用蘿卜硫素后大腦谷胱甘肽水平的持續(xù)增加外，還觀察到血液和丘腦谷胱甘肽在服用蘿卜硫素前后的比例呈顯著正相關(guān)。這項臨床試驗研究表明，探索外周GSH水平與臨床/神經(jīng)心理測驗的關(guān)系，以及蘿卜硫素對神經(jīng)精神疾病中功能改變的影響，具有重要的價值。
關(guān)鍵詞
蘿卜硫素；谷胱甘肽；氧化應激
1. 引言
氧化應激是多種人類疾病的病理生理學的基礎，從心血管綜合征和糖尿病到神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病和帕金森病[1-5]。此外，最近的研究表明，氧化應激也在神經(jīng)精神疾病如精神分裂癥（SZ）中發(fā)揮作用[6-9]。
谷胱甘肽（GSH）是氧化應激和氧化還原平衡最重要的調(diào)節(jié)劑之一。這種抗氧化劑三肽以低毫摩爾細胞內(nèi)水平存在，并被超過20種酶直接利用以發(fā)揮其抗氧化和細胞保護作用。GSH參與許多疾病的病理狀態(tài)已早有報道[10-13]。
研究和治療腦部疾病的障礙是獲得生物標本，這些標本更容易用于外周疾病。因此，許多研究依賴于更容易獲得的血液和腦脊髓液樣本來表征神經(jīng)精神疾病的分子基礎[14-23]。盡管受試者之間存在差異，但多項研究報道，在外周可獲得的組織和液體（如血液）中，精神分裂癥中GSH顯著降低[6,18,19,24-29]。
然而，與精神分裂癥相關(guān)的腦中GSH的分子分布尚不清楚。體內(nèi)磁共振波譜（MRS）是一種用于測量腦代謝物水平的分析技術(shù)[30]。MRS的成功應用顯示精神分裂癥患者的腦谷氨酸（Glu）和γ-氨基丁酸（GABA）水平發(fā)生了改變[31-34]。相比之下，GSH的數(shù)據(jù)不太一致[19,35,36]。3-T MRS檢測谷胱甘肽水平的敏感性有限可能是這種不一致的潛在原因，而使用7-T MRS的研究應該改進檢測，并產(chǎn)生更一致的結(jié)果。因此，目前對基于MRS的GSH指標的解讀應持謹慎態(tài)度。目前的MRS方法可能不夠靈敏，無法檢測與病理改變相關(guān)的微妙但關(guān)鍵的變化。因此，許多研究人員正在探索外周GSH作為氧化應激相關(guān)腦變化的可能標志的潛在效用。
蘿卜硫素是一種天然的植物化學物質(zhì)，富含在十字花科植物的種子和芽，如西蘭花。它在創(chuàng)傷性腦和脊髓損傷的臨床前模型中顯示出前景[37,38]。蘿卜硫素通過與細胞抑制因子KEAP1結(jié)合并分離的能力激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 [39,40]。因此，蘿卜硫素有望促進適當?shù)难趸€原平衡和對氧化應激[41]的保護。由于其存在于消費性食品中，因此蘿卜硫素是進一步人類研究的有吸引力的候選者。事實上，它在治療哮喘、空氣污染損傷、良性前列腺增生、紫外線引起的紅斑、糖尿病、控制幽門螺桿菌(胃癌的一種致癌物)，以及預防多種不同癌癥方面都有潛在的應用價值[42-44]。最近的報道表明，使用蘿卜硫素可改善諸如自閉癥和精神分裂等人類大腦疾病狀況[45-47]。盡管如此，仍然難以理解蘿卜硫素如何與神經(jīng)精神病癥的發(fā)病機制相關(guān)聯(lián)。
我們假設向受試者使用蘿卜硫素可以增加血液和腦部GSH水平，并且外周血GSH水平可以反映大腦中的氧化應激和氧化還原相關(guān)的生理學和病理生理學。鑒于蘿卜硫素可能是一種候選治療方法，研究蘿卜硫素對GSH的影響可能是確定預測有益效果的標志物的第一步。
2. 方法
2.1 小鼠模型
本研究中使用具有CD1背景的神經(jīng)元谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1敲除（Eaac1 KO）小鼠[48]和野生型（WT）小鼠，并將其置于受控設施中（23±1℃； 50±5％濕度；光照和黑暗循環(huán)分別在上午7點和下午7點開始），可自由獲取食物和水。在來自3個月大的雄性小鼠（Eaac1 KO小鼠，n = 4；WT小鼠，n = 5）的全腦中定量GSH水平。 我們利用雄性動物作為嚙齒動物GSH酶水平在發(fā)情期間波動高達50％[49]。三個月大的動物體內(nèi)的谷胱甘肽水平不像一歲以上的嚙齒動物那樣隨年齡增長而下降（3個月齡的動物沒有年齡依賴性的GSH水平下降）[50]。
2.2 西蘭花芽提取物（蘿卜硫素）
本研究中使用的西蘭花芽提取物是一種高度標準化的蘿卜硫素配方制劑[51,52]。如前所述[45,53-58]，2個西蘭花提取物凝膠膠囊中蘿卜硫素的標準含量為100μmol，每天2粒，連續(xù)7天。100μmol蘿卜硫素的劑量和7天的治療持續(xù)時間是根據(jù)先前的研究經(jīng)驗確定的，包括一項試驗證明在受試者的鼻腔灌洗細胞中誘導抗氧化酶[59]和改善空氣污染物的排泄[56]。本蘿卜硫素的配方生物利用度為80%[58]，口服攝入后1小時達到血漿峰值水平，一級動力學下降，并在尿液中積極排泄（8小時為60％）[58,60]。
2.3 人類研究受試者
在美國馬里蘭州巴爾的摩的約翰霍普金斯精神分裂癥中心招募了9名健康志愿者（5名男性和4名女性）。人口統(tǒng)計信息見表1。男性和女性的GSH水平相似[61]。本研究包括年齡較小的受試者（年齡21-26歲，1名受試者年齡56歲）。如果受試者有嚴重精神疾病的個人或直系親屬病史、近期醫(yī)院感染史、慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病、導致意識喪失的創(chuàng)傷性頭部損傷或活性物質(zhì)濫用，則被排除在外。我們將煙草吸煙者排除在本研究之外，因為吸煙是已知的氧化應激誘導因子[62,63]。具有MRI掃描禁忌癥的患者，例如依賴于苯二氮卓類藥物，禁止性幽閉恐怖癥，金屬植入物或假肢，起搏器或?qū)κ茉囌邩?gòu)成安全風險的任何醫(yī)學病癥（例如，中耳疾?。┮脖慌懦谕?。
2.4 臨床研究設計
受試者完成了兩次間隔時間為7天（1周）的隨訪。受試者每天早晨空腹服用2個西蘭花芽提取物凝膠膠囊給（內(nèi)含100μmol蘿卜硫素），為期1周。研究人員通過電話聯(lián)系受試者，提醒受試者每天服用按時按量西蘭花提取物。在第一次給藥前和最后一次給藥后4小時內(nèi)收集尿液和血液樣本。在第一次給藥前和最后一次給藥后4小時內(nèi)進行MRS掃描。受試者完成了服用提取物的日期和時間的日志記錄，并記錄了他們在研究期間所經(jīng)歷的任何潛在不適或疾病。三名受試者在空腹服用提取物時表示輕度到中度惡心或腹痛。研究設計總結(jié)在在線補充圖1中（對于所有在線補充材料，請參見
www.karger.com/doi/10.1159/000487639 ）。
2.5 血液和腦組織中GSH水平的測量（小鼠和人類）
GSH總量(GSH和谷胱甘肽二硫醚的總和[GSSG])采用Tietze方法的改進方法在人血細胞中測定[64]。我們將“總GSH”簡稱為“GSH”。 我們使用這些方法在多項研究中量化了GSH和氧化應激[18,65,66]。將非單核細胞血細胞重懸于含有200mM 2-（N-嗎啉代）乙磺酸和1mM EDTA（乙二胺四乙酸）的緩沖液中并超聲處理。裂解后的細胞懸液在4℃下以10000 g旋轉(zhuǎn)15分鐘。通過加入50％v / v新鮮制備的10％偏磷酸將所得上清液脫蛋白，然后在室溫下孵育5分鐘。然后將脫蛋白質(zhì)樣品以2,000g旋轉(zhuǎn)2分鐘，并將上清液儲存在-20℃直至測定。通過向100μL經(jīng)過偏磷酸處理的細胞裂解物中加入5μL新制備的4M三乙醇胺進行動力學測定。然后嚴格按照制造商的說明使用試劑盒（Cayman Chemical Company； 703002）測量GSH。測量GSH對5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）還原的415nm處吸光度的增加速率反映了總GSH含量。使動力學測定運行20分鐘，每隔1分鐘收集數(shù)據(jù)。血漿中總GSH的濃度報告為nmol / mL。使用0至16nmol / mL的標準曲線校準測定。使用2次獨立測量的平均值確定每個報告的GSH值。
2.6 7-T磁共振光譜（7-T MRS）
使用配備有32通道頭部線圈（Nova Medical，Wilmington，MA，USA）的7-T掃描儀（Philips Achieva； Philips，Best，The Netherlands）掃描所有受試者。采用梯度回波序列(FOV = 220×220×180 mm)磁化制備快速采集3D T1加權(quán)圖像。使用刺激回聲采集模式序列（TE / TM / TR = 14/33 / 3,000ms，NEX = 128），從前扣帶皮層（ACC； 30×30×30mm），左側(cè)海馬（HP； 35×15×15mm）和雙側(cè)丘腦（THAL； 20×30×15mm）記錄光譜，除了2個受試者，其中光譜僅從ACC記錄，體素大小為38×30×30mm（在線補充圖2）。
并非所有剩余的受試者都獲得了針對所有三個大腦區(qū)域的MRS數(shù)據(jù)。VAPOR（可變功率和優(yōu)化的弛豫延遲）水抑制用于最小化主要水信號[67]。另外，還從每個體素（NEX = 16）獲得沒有水抑制的參考掃描。利用LCModel軟件包對光譜進行分析[68]，并從VeSPA項目中模擬出一個基集[69]。以未抑制的水信號為參照，對代謝物濃度進行歸一化。擬合誤差采用CRLBs (Cramér-Rao下界)進行評估。代謝物濃度僅在相應的CRLB值低于20%時才納入進一步的統(tǒng)計分析。
我們研究的目的是確定蘿卜硫素治療后腦GSH水平的變化，可能與血液GSH水平相關(guān)； 因此GSH是我們的主要結(jié)果指標。 GABA，谷氨酰胺（Gln），Glu和N-乙酰天冬氨酸（NAA）作為次要結(jié)果測量。使用配對t檢驗比較GABA，Gln，Glu，GSH和NAA濃度的治療前和治療后測量值之間的差異。
表1. 臨床和人口統(tǒng)計學特征
| 性別，n(%) | |
| 男 | 5（56） |
| 女 | 4（44） |
| 平均年齡±SD，年 | 27.8±10.67 |
| 種族，n(%) | |
| 白種人 | 2（22） |
| 美國黑人 | 3（34） |
| 亞洲人 | 2（22） |
| 其他 | 2（22） |
| 教育水平，n(%) | |
| 高學歷 | 5（56） |
| 大學生 | 4（44） |
| 是否吸煙，n(%) | |
| 吸煙者 | 0（0） |
| 不吸煙者 | 9（100） |
圖1. 測量野生型（WT）和Eaac1敲除（+/-）小鼠中血細胞和腦組織中的谷胱甘肽（GSH）水平。a. 與WT同窩小鼠（n = 5）相比，3個月大的雄性Eaac1 +/-小鼠（n = 4）中淋巴細胞中總GSH水平顯著降低。b. 與WT同窩小鼠相比，Eaac1 +/-小鼠中全腦中總GSH水平顯著降低。c. 各個動物（白色圓圈，WT小鼠； 黑色圓圈，Eaac1 +/-小鼠）中淋巴細胞和腦中總GSH的水平不同。然而，淋巴細胞中總GSH水平與腦中總GSH水平的比例是恒定的。
圖2.測量人血細胞中谷胱甘肽（GSH）的水平。在給予蘿卜硫素（SFN）1周后，細胞GSH顯著增加（雙尾，配對t檢驗：p = 0.02）。
2.7 分析與統(tǒng)計
使用R版本3.3.0 for Windows進行統(tǒng)計分析。使用蘿卜硫素前和后血液GSH比值和代謝物比值計算通過MRS測量的血液GSH水平和腦代謝物水平之間的相關(guān)關(guān)系。血GSH比值采用Shapiro-Wilk正態(tài)檢驗確定為非參數(shù)；因此，我們采用Spearman相關(guān)系數(shù)來確定血GSH與腦MRS數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。對于非參數(shù)數(shù)據(jù)，使用Mann-Whitney檢驗對WT和Eaac1 KO小鼠中淋巴細胞和腦中的總GSH水平進行兩組比較。Spearman相關(guān)系數(shù)用于確定大腦中總GSH水平與小鼠淋巴細胞中GSH水平之間的關(guān)系。
Spearman的相關(guān)分析和成對的雙尾t檢驗用于確定性別對對血GSH水平中蘿卜硫素反應的影響。Wilcoxon秩和檢驗用于確定種族類別是否是血液中GSH水平的協(xié)變量。Pearson相關(guān)分析用于確定年齡對血液GSH水平中蘿卜硫素反應的影響。為了進行徹底的分析，使用單變量和多變量線性回歸模型分別確定種族和年齡以及性別和種族對THAL GSH水平的蘿卜硫素響應的影響。應用Shapiro-Wilk測試來確認正態(tài)性（參數(shù)或非參數(shù)）。 使用Benjamini和Hochberg的方法調(diào)整p值。 所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差（SD）和α值p <0.05。
3. 結(jié)果
3.1 小鼠模型中觀察到的外周和腦GSH水平
我們檢測了外周GSH水平是否可以反映動物模型中腦GSH水平的病理生理變化。我們最初使用小鼠模型系統(tǒng)，在這些模型所提供的受控遺傳和環(huán)境條件下，研究血液和大腦中GSH缺乏的影響。由于研究蘿卜硫素對GSH水平的影響是我們的主要目標，人體研究通常具有一定程度的遺傳和環(huán)境變異性，我們希望小鼠模型可以指導我們的人體研究來檢查外周腦與腦內(nèi)GSH水平之間的關(guān)系在控制遺傳和環(huán)境系統(tǒng)下。我們使用Eaac1 KO小鼠，由于其合成不足，大腦中的GSH水平降低[48]。首先，我們重復了先前的研究結(jié)果[48]，與WT小鼠相比，Eaac1 KO小鼠的腦GSH水平降低（圖1a）。我們的研究表明，與WT小鼠相比，Eaac1 KO小鼠的外周循環(huán)淋巴細胞大大降低了GSH水平（p = 0.008）（圖1b）。重要的是，腦和外周GSH水平在WT和KO小鼠中顯著相關(guān)（ρ= 0.967； p <0.001）（圖1c）。因此，雖然我們需要謹慎地推廣這些觀察結(jié)果，但外周GSH水平的測量可能是腦GSH水平的潛在有用指標。
3.2 每日服用蘿卜硫素連續(xù)7天后，受試者的血液GSH水平升高
服用前和服用后尿液分析證實存在尿蘿卜硫素代謝物，證實受試者遵守口服蘿卜硫素方案(數(shù)據(jù)未顯示)。在給予蘿卜硫素1周后，研究受試者證實了非單核細胞中GSH的顯著增加，其包括T細胞，B細胞和NK細胞的混合物（圖2）。給予蘿卜硫素前GSH水平為9。22 nmol / mL，使用蘿卜硫素后為12。2 nmol / mL，增加32％。蘿卜硫素對GSH影響與受試者的年齡（r = -0.1936； p = 0.62）和他們的性別（ρ= 0.087； p = 0.825）都沒有相關(guān)性。也沒有發(fā)現(xiàn)種族是一個解釋變量，正如四組的Wilcoxon秩和檢驗所證明的那樣（p = 0.318）。
3.3 通過MRS測量腦代謝物
在這項研究中，我們獲得了三個不同腦區(qū)（THAL，HP和ACC）中五種代謝物（GSH，GABA，Gln，Glu和NAA）的測量值。我們特別選擇了這三個大腦區(qū)域，因為它們是精神分裂癥 [70-77]中受影響的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和功能連接的基礎。我們在本研究中的主要假設是蘿卜硫素可能影響這些大腦區(qū)域的GSH水平，并可能與外周血中的GSH水平相關(guān)。
我們發(fā)現(xiàn)HP GSH從1。11±0.34增加到1。38±0.28 mM（p = 0.041；配對，雙尾t檢驗；在線補充圖2）。THAL和ACC中GSH水平的變化沒有達到顯著性。在給予蘿卜硫素之前和之后，THAL GSH水平的代表性成對分析顯示在在線補充圖3中。關(guān)于針對本研究的非主要假設量化的其他腦代謝物，THAL中的Gln水平從1。21±0.22增加至1。49±0.26mM（p = 0.017；配對，雙尾t檢驗）。由于樣本量有限，在多次比較的事后校正后，增加并不顯著，但在考慮受試者數(shù)量較少時，結(jié)果仍然具有啟發(fā)性。
通過線性回歸分析確定，腦GSH水平的蘿卜硫素響應不受年齡，性別或種族的影響。我們對THAL中測量的GSH水平進行了代表性分析，因為該區(qū)域產(chǎn)生的結(jié)果與蘿卜硫素攝入前后血液中GSH水平的生化測量最顯著相關(guān)。在多元線性回歸分析中，對于年齡，性別和種族使用蘿卜硫素之前和之后THAL中GSH水平的各自p值分別為0.582,0.900和0.567，并且種族單變量分析中p = 0.406?？偟膩碚f，年齡，性別和種族不是與腦GSH水平的蘿卜硫素反應相關(guān)的協(xié)變量。
我們觀察到血液中的GSH水平與THAL腦區(qū)域中的GSH水平之間顯著正相關(guān)（ρ= 0.943； p = 0.017； q = 0.051）。為了提高透明度，我們還報告了在三個不同的腦區(qū)測量的所有五種代謝物的相關(guān)結(jié)果（在線表1)。使用蘿卜硫素后，血液GSH的增加與THAL中的GABA，Gln，Glu和GSH正相關(guān)。雖然這些相關(guān)性在多次比較后并不顯著，但仍然具有啟發(fā)性。 功效分析計算表明，n = 50的樣本量將產(chǎn)生顯著的結(jié)果，這將是未來研究的重點。
4. 討論
我們報道，短期使用蘿卜硫素足以顯著增加受試者的外周GSH水平。我們發(fā)現(xiàn)HP中GSH增加，但在評估的大腦區(qū)域中沒有。外周GSH比值與蘿卜硫素處理后THAL中的腦GSH水平具有強烈且顯著正相關(guān)，與我們的遺傳和環(huán)境均一的臨床前GSH缺乏小鼠模型研究獲得的結(jié)果一致。
在這項研究中，我們進行了統(tǒng)計分析，以驗證年齡、性別和種族不影響參與人群中GSH水平的蘿卜硫素反應。雖然據(jù)報道GCLC GAG TNR多態(tài)性影響歐洲高加索人群中的GSH水平[78]，但我們報道特定基因型可能不會影響我們研究人群（包括非裔美國人在內(nèi)的北美人群）的水平[79]。遺傳和/或環(huán)境因素可能影響GSH水平的蘿卜硫素反應仍然是難以捉摸的。
如已經(jīng)報道的心血管和腦血管疾病，可能需要更長的治療持續(xù)時間和/或更高的劑量。例如，在涉及患有2型糖尿病的受試者的臨床試驗中，報告了氧化應激的改善，其中劑量為10g /天（~225μmol）的蘿卜硫素，持續(xù)時間為4周，每次顯著高于目前研究[80]。這可能是因為我們在本研究中僅觀察到蘿卜硫素處理后大腦代謝物的暗示性變化。然而，我們的短期給藥策略耐受性良好，這將進一步促進隨后的蘿卜硫素方案，以試圖將臨床生物標志物與患者導向的結(jié)果聯(lián)系起來。
當通過標準生化測定法定量兩者時，外周和腦GSH水平在小鼠中相關(guān)。盡管如此，至少對于使用蘿卜硫素的當前劑量和持續(xù)時間而言，目前尚不清楚血清中的蘿卜硫素引起的血液中GSH的增加對于大腦意味著什么。在受試者中通過MRS估計腦中的GSH濃度具有局限性或者至少目前需要謹慎[81]。蘿卜硫素可能穿過血腦屏障，盡管它的效力和必要的劑量在人類中尚未建立。在大鼠中，外周給藥蘿卜硫素可誘導大腦中的抗炎HO-1基因，對腦卒中、創(chuàng)傷性腦損傷和苯環(huán)利定誘導的運動亢進均有有益作用[37,82,83]。
蘿卜硫素干預的結(jié)果研究將受益于將臨床表型與客觀測量的生物標志物聯(lián)系起來，這些生物標志物可能反映了疾病的病理生理學[47]。例如，在提交的研究中，我們將報告外周GSH水平可能與認知功能相關(guān)。因此，我們認為探索外周GSH與臨床/神經(jīng)心理學測量之間可能的相關(guān)性以及蘿卜硫素對神經(jīng)精神障礙中改變的功能測量的影響具有重要意義。本研究是后期同類研究的關(guān)鍵起點。
本文由福山生物整理翻譯，轉(zhuǎn)載請注明出處。
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