營(yíng)養(yǎng)知識(shí)
最新資訊
-
電話(huà)： 400-113-6988 郵箱： dongfangxicao@163.com 地址： 深圳市南山區(qū)粵海街道高新中三道9號(hào)環(huán)球數(shù)碼大廈19樓
↓ 微信掃碼識(shí)別關(guān)注我們 ↓ 
SFN通過(guò)降低AGEs受體表達(dá)，抑制AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷
發(fā)表于：2020-04-28 作者：admin 來(lái)源：本站 點(diǎn)擊量：11226
Sulforaphane inhibits advanced glycation end product–induced pericyte damage by reducing expression of receptor for advanced glycation end products
SFN通過(guò)降低晚期糖基化終產(chǎn)物受體的表達(dá)，抑制晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的周細(xì)胞損傷
晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）不僅抑制DNA合成，而且還通過(guò)與AGE受體（RAGE）相互作用引起視網(wǎng)膜周細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡和炎癥，從而在糖尿病性視網(wǎng)膜病變中發(fā)揮作用。類(lèi)似地，蘿卜硫素是在廣泛食用的十字花科蔬菜中發(fā)現(xiàn)的天然存在的異硫氰酸酯，其保護(hù)免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的組織損傷。因此，我們假設(shè)蘿卜硫素可通過(guò)其抗氧化特性抑制AGE誘導(dǎo)的周細(xì)胞損傷。晚期糖基化終產(chǎn)物刺激了牛培養(yǎng)的視網(wǎng)膜周細(xì)胞中超氧化物的產(chǎn)生以及RAGE基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)，并且這些效果通過(guò)用蘿卜硫素處理來(lái)防止。針對(duì)RAGE的蘿卜硫素和抗體顯著抑制了AGE誘導(dǎo)的DNA合成下降、凋亡細(xì)胞死亡以及周細(xì)胞單核細(xì)胞趨化蛋白1信使RNA水平的上調(diào)。本研究首次表明，蘿卜硫素可抑制AGE暴露周細(xì)胞的DNA合成，凋亡細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)，部分原因是通過(guò)其抗氧化特性抑制RAGE表達(dá)。通過(guò)蘿卜硫素阻斷周細(xì)胞中的AGE-RAGE軸可能是治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變的新型治療靶點(diǎn)。
1. 引言
糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病中最具破壞性的微血管并發(fā)癥之一，也是職業(yè)年齡人群獲得性失明的主要原因[1,2]。糖尿病視網(wǎng)膜病變最早的組織病理學(xué)標(biāo)志是周細(xì)胞丟失[3]。與周細(xì)胞損失同時(shí)，觀(guān)察到幾種特征性變化，包括視網(wǎng)膜基底膜增厚，視網(wǎng)膜血管通透性過(guò)高和微動(dòng)脈瘤形成[3]。由于周細(xì)胞已被證明在維持微血管穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，因此推測(cè)糖尿病視網(wǎng)膜病變的惡化和與視網(wǎng)膜新生血管形成相關(guān)的增殖性變化是周細(xì)胞丟失的結(jié)果[4-6]。
晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）由美拉德過(guò)程形成，這是一種還原糖和蛋白質(zhì)氨基之間的非酶促反應(yīng)，有助于蛋白質(zhì)的老化[6-10]。在糖尿病高血糖條件下，這一過(guò)程開(kāi)始于可逆的希夫堿加合物轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的阿馬多里（Amadori）產(chǎn)物。在數(shù)天到數(shù)周的過(guò)程中，Amadori產(chǎn)物經(jīng)歷進(jìn)一步的重排反應(yīng)，例如脫水和縮合，以形成稱(chēng)為AGE的不可逆交聯(lián)的大蛋白衍生物。有越來(lái)越多的證據(jù)表明，AGE及其細(xì)胞表面受體，AGE相互作用受體（RAGE）與許多糖尿病和衰老相關(guān)疾病的病理后遺癥的發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)[6-10]。事實(shí)上，我們以前發(fā)現(xiàn)AGEs不僅抑制DNA合成，而且還通過(guò)與RAGE的相互作用，通過(guò)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生誘導(dǎo)培養(yǎng)的視網(wǎng)膜周細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞死亡[6,11,12]。AGE相互作用的晚期糖基化終產(chǎn)物受體也刺激各種細(xì)胞類(lèi)型中的單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）表達(dá)，這可能導(dǎo)致血管通透性過(guò)高和早期糖尿病視網(wǎng)膜病變血液 - 視網(wǎng)膜屏障功能受損[13-17]。這些觀(guān)察結(jié)果表明，阻斷AGE誘導(dǎo)的周細(xì)胞損傷可能是糖尿病視網(wǎng)膜病變的新治療靶點(diǎn)。
蘿卜硫素是十字花科蔬菜中天然存在的異硫氰酸酯，如西蘭花、卷心菜和球芽甘藍(lán)[18,19]。蘿卜硫素是具有抗癌特性的II相抗氧化解毒酶的誘導(dǎo)劑[18,19]。此外，蘿卜硫素對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)組織損傷具有保護(hù)作用，包括實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病和神經(jīng)病變[20,21]。蘿卜硫素還被證明可以改善1型糖尿病大鼠的代謝紊亂，并通過(guò)Nrf2[20]的激活抑制氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，從而抑制蛋白尿和腎小球硬化。盡管已知蘿卜硫素的許多有益屬性，但據(jù)我們所知，尚無(wú)研究檢測(cè)蘿卜硫素對(duì)AGE誘發(fā)的周細(xì)胞損傷的影響。因此，我們假設(shè)蘿卜硫素通過(guò)其抗氧化特性可以預(yù)防AGE-RAGE誘導(dǎo)的周細(xì)胞損傷。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們研究了蘿卜硫素是否能抑制AGE暴露的周細(xì)胞中超氧化物的產(chǎn)生，RAGE表達(dá)，DNA合成，細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。
2. 方法和材料
2.1. 材料
D-甘油醛和1％蛋白酶抑制劑混合物購(gòu)自Nakalai Tesque（Kyoto，Japan），[3H]胸苷購(gòu)自GE Healthcare（Buckinghamshire，UK）。4-（2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸和氯化鈉來(lái)自日本大阪的Wako Pure Chemical Industries，Ltd。其他化學(xué)品購(gòu)自Sigma（St Louis，MO，USA）。
2.2. AGE-牛血清白蛋白的制備
如前所述制備晚期糖基化終產(chǎn)物 - 牛血清白蛋白（BSA）[12]。簡(jiǎn)言之，將BSA（25mg / mL）在無(wú)菌條件下與0.1mol / L甘油醛在0.2mol / L磷酸鈉緩沖液（pH7.4）中培育7天。然后，通過(guò)PD-10柱層析除去未摻入的糖并用磷酸鹽緩沖鹽水透析。除不含還原糖外，對(duì)照組未糖化BSA在相同條件下培育。使用Endospecy ES-20S系統(tǒng)（Seikagaku Co，Tokyo，Japan）測(cè)試制劑的內(nèi)毒素; 沒(méi)有檢測(cè)到內(nèi)毒素。
2.3. 制備針對(duì)RAGE的抗體
如前所述，制備了針對(duì)RAGE的抗體（RAGE-Ab），用于中和測(cè)定，其識(shí)別人RAGE蛋白的氨基酸殘基167-180 [22]。
2.4. 細(xì)胞
分離牛視網(wǎng)膜周細(xì)胞并將其保持在Dulbecco 改良的Eagle培養(yǎng)基（Gibco BRL，Rockville，MD，USA）中，其如前所述[21,23]補(bǔ)充有20％胎牛血清（ICN Biomedicals Inc，Aurora，OH，USA）。將5至10次傳代的細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。晚期糖基化終產(chǎn)物治療在含有2％胎牛血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行。
2.5. 活性氧生成
在存在或不存在0.1或0.4μmol/ L蘿卜硫素或5μg/ mL RAGE-Ab的情況下，用100μg/ mL AGE-BSA或非糖基化的BSA處理周細(xì)胞2小時(shí)。接下來(lái)，如前所述測(cè)量細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生[24]。簡(jiǎn)而言之，在用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌除去死細(xì)胞后，將周細(xì)胞在37℃下與不含酚紅的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基一起培養(yǎng)15分鐘，其中含有10μmol/ L 5-（和-6） - 氯甲基 -2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（Molecular Probes Inc，Eugene，OR，USA）。根據(jù)制造商推薦的方法，使用EZScan-FL for Windows程序在EZS-FL熒光板讀數(shù)器（Asahi Techno Glass，Tokyo，Japan）中測(cè)量細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。
2.6. 實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)
在存在或不存在0.1或0.4μmol/ L蘿卜硫素或5μg/ mL RAGE-Ab的情況下，用100μg/ mL的AGE-BSA或非糖基化的BSA處理周細(xì)胞4或24小時(shí)。然后，根據(jù)制造商的說(shuō)明，用RNAqueous-4聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒（AmbionInc，Austin，TX，USA）提取總RNA。用Prime Script RT Reagent試劑盒（Takara Bio Inc，Shiga，Japan）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA）。根據(jù)供應(yīng)商的建議[16]，使用Assay-on-Demand和TaqMan 5熒光核酸酶化學(xué)（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR。簡(jiǎn)而言之，使用Premix ExTaq（Takara Bio Inc），在體積為20μL的48孔反應(yīng)板中進(jìn)行2ng模板cDNA的實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。反應(yīng)板在StepOne PCR系統(tǒng)上運(yùn)行，具有以下曲線(xiàn)：95℃60秒，然后50個(gè)循環(huán)的95℃60秒，然后60℃15秒。在10至30個(gè)PCR循環(huán)后，通過(guò)從每個(gè)靶基因的閾值循環(huán)中減去內(nèi)源基因（β肌動(dòng)蛋白）的閾值的平均周期來(lái)計(jì)算每個(gè)樣品中所有基因的閾值Δ周期。通過(guò)閾值表達(dá)方法的比較Δ周期來(lái)計(jì)算每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)。牛RAGE，MCP-1和β-肌動(dòng)蛋白基因的引物和探針的ID分別為Bt03212202_m1，Bt03212321_m1和Bt03279174_g1（Applied Biosystems）。
2.7. 蛋白質(zhì)印跡分析
在存在或不存在0.4μmol/ L蘿卜硫素的情況下，用100μg/ mL的AGE-BSA或非糖基化的BSA處理周細(xì)胞24小時(shí)。培育后，用冷的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細(xì)胞，刮下，通過(guò)流體動(dòng)力學(xué)剪切（21號(hào)針頭）勻漿，并通過(guò)在12000g，4℃下離心20分鐘。通過(guò)裂解緩沖液（25mmol / L 4-（2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸[pH 7.1]，150mmol / L氯化鈉，1％Triton-X-100, 10％甘油，2mmol / L原釩酸鈉，50mmol / L氟化鈉，10mmol / L焦磷酸鈉，1％磷酸酶抑制劑混合物I和II，和1％蛋白酶抑制劑混合物）。將樣品在95℃煮沸5分鐘后，通過(guò)十二烷基硫酸鈉 - 聚丙烯酰胺凝膠電泳（4％-12％）分離5μg細(xì)胞裂解物，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上（Amersham Pharmacia Biotech，Buckinghamshire，UK）。用1：200稀釋的抗RAGE多克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA）或1：1000稀釋的針對(duì)α微管蛋白的單克隆抗體探測(cè)膜。如前所述，用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)（Amersham Pharmacia Biotech）使免疫反應(yīng)條帶可視化[25]。
2.8. 測(cè)量[3H]胸苷摻入周細(xì)胞
在存在或不存在0.1或0.4μmol/ L蘿卜硫素或5μg/ mL RAGE-Ab的情況下，用100μg/ mL AGE-BSA或非糖基化BSA處理周細(xì)胞20小時(shí)。然后，加入[3H]胸苷至終濃度為1μCi/ mL，并將細(xì)胞進(jìn)一步培育4小時(shí)。培育后，將細(xì)胞用冰冷的10％（wt / vol）三氯乙酸固定20分鐘，然后處理所得的酸不溶性物質(zhì)用于液體閃爍計(jì)數(shù)[26]。
2.9. 周細(xì)胞凋亡細(xì)胞死亡的測(cè)量
在存在或不存在0.1或0.4μmol/ L蘿卜硫素或5μg/ mL RAGE-Ab的情況下，用100μg/ mL AGE-BSA或非糖基化BSA處理周細(xì)胞7天。然后，裂解細(xì)胞，并在酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）中分析上清液的DNA片段（Cell Death Detection ELISA plus; Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany），如前所述[2]。
2.10. 數(shù)據(jù)分析
所有值均表示為平均值±SE。進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），然后進(jìn)行Tukey或Games-Howell檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。P <0.05被認(rèn)為是顯著。使用由Heinrich Heine University（Dusseldorf，Germany）提供的G * Power3進(jìn)行功率分析。
3. 結(jié)果
因?yàn)锳GE可以通過(guò)ROS的產(chǎn)生對(duì)多種細(xì)胞功能發(fā)揮多效作用[5-12]，我們首先研究了蘿卜硫素對(duì)暴露于AGE 2小時(shí)周細(xì)胞中ROS產(chǎn)生的影響。如圖1所示，蘿卜硫素劑量依賴(lài)性地抑制AGE誘導(dǎo)的周細(xì)胞中ROS產(chǎn)生的增加; 0.4μmol/ L蘿卜硫素完全阻斷周細(xì)胞中AGE誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。針對(duì)5μg/ mL的RAGE的抗體也完全阻斷由AGE誘發(fā)的周細(xì)胞中的ROS產(chǎn)生。
圖1 - 蘿卜硫素對(duì)AGE暴露的周細(xì)胞中ROS產(chǎn)生的影響。
在存在或不存在0.1或0.4μmol/ L蘿卜硫素或5μg/ mL RAGE-Ab的情況下，用100μg/ mL AGE-BSA或非糖基化BSA處理周細(xì)胞2小時(shí)。然后，將周細(xì)胞與含有10μmol/ L 5-（和-6） - 氯甲基-2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯的無(wú)酚紅Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基在37℃培育15分鐘。用EZS-FL熒光板讀數(shù)器通過(guò)熒光強(qiáng)度評(píng)估細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。每組n = 16。所有值均表示為平均值±SE。進(jìn)行單因素方差分析，然后進(jìn)行Tukey檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較; P <0.05被認(rèn)為是顯著的。＃和##，P <0.05和P <0.01分別與單獨(dú)使用AGE的值相比較。 功率≥0.81。
AGE受體是AGE的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，可以介導(dǎo)AGE對(duì)周細(xì)胞的有害影響[6]。通常，信使RNA（mRNA）上調(diào)可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)過(guò)度表達(dá)。因此，隨后的研究集中于蘿卜硫素對(duì)暴露于AGE 4和24小時(shí)的周細(xì)胞中RAGE基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。如圖2A所示，0.1和0.4μmol/ L的蘿卜硫素阻止了AGE處理的周細(xì)胞中RAGE mRNA水平的上調(diào)。盡管0.1μmol/ L的蘿卜硫素對(duì)RAGE蛋白表達(dá)的影響不足，但0.4μmol/ L的蘿卜硫素完全阻斷周細(xì)胞中AGE誘導(dǎo)的RAGE蛋白誘導(dǎo)（圖2B）。
圖2-蘿卜硫素對(duì)AGE暴露的周細(xì)胞中RAGE基因（A）和蛋白質(zhì)表達(dá)（B）的影響。
在存在或不存在0.1或0.4μmol/ L蘿卜硫素的情況下，用100μg/ mL的AGE-BSA或非糖基化的BSA處理周細(xì)胞4（A）或24小時(shí)（B）。A，然后，使用Prime Script RT Reagent試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并使用Assay-on-Demand和TaqMan 5熒光核酸酶化學(xué)法通過(guò)實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。數(shù)據(jù)通過(guò)β-肌動(dòng)蛋白mRNA衍生信號(hào)的強(qiáng)度歸一化，然后與單獨(dú)用BSA獲得的值相關(guān)。每組n = 9。所有值均表示為平均值±SE。進(jìn)行單因素方差分析，然后進(jìn)行Games-Howell檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較; P <0.05被認(rèn)為是顯著的。##，P <0.01與單獨(dú)使用AGE的值比較。 功率≥0.93。B，培育后，用冷的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細(xì)胞，刮下，通過(guò)流體動(dòng)力學(xué)剪切（21號(hào)針頭）勻漿，并通過(guò)在12000g，4℃下離心20分鐘。通過(guò)裂解緩沖液立即裂解細(xì)胞，并通過(guò)十二烷基硫酸鈉 - 聚丙烯酰胺凝膠電泳（4％-12％）分離5μg細(xì)胞裂解物并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用1：200稀釋的抗RAGE多克隆抗體或1：1000稀釋的針對(duì)α微管蛋白的單克隆抗體探測(cè)膜。用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)顯現(xiàn)免疫反應(yīng)條帶。數(shù)據(jù)通過(guò)α微管蛋白衍生信號(hào)的強(qiáng)度歸一化，然后與單獨(dú)用BSA獲得的值相關(guān)。每組n = 3。所有值均表示為平均值±SE。進(jìn)行單因素方差分析，然后進(jìn)行Tukey檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較; P <0.05被認(rèn)為是顯著的。##，P <0.01與單獨(dú)使用AGE的值比較。 功率≥0.99。
我們進(jìn)一步研究了蘿卜硫素對(duì)AGE暴露的周細(xì)胞中DNA合成和凋亡的影響。如圖3A所示，24小時(shí)的AGE處理顯著降低培養(yǎng)的視網(wǎng)膜周細(xì)胞中的DNA合成。此外，AGE暴露相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間（7天）誘導(dǎo)周細(xì)胞的凋亡性細(xì)胞死亡（圖3B）。用0.4μmol/ L蘿卜硫素或5μg/ mL RAGE-Ab處理顯著防止AGE的這些生長(zhǎng)抑制和促凋亡作用（圖3A和B）。此外，如圖4所示，蘿卜硫素劑量依賴(lài)性地抑制AGE誘導(dǎo)的周細(xì)胞中MCP-1 mRNA水平的上調(diào)。通過(guò)用5μg/ mL RAGE-Ab處理，通過(guò)AGE誘導(dǎo)4小時(shí)的周細(xì)胞MCP-1基因被完全抑制。
圖3-蘿卜硫素對(duì)AGE暴露的周細(xì)胞中[3H]胸苷摻入（A）和凋亡細(xì)胞死亡（B）的影響。
在存在或不存在0.1或0.4μmol/ L蘿卜硫素或5μg/ mL RAGE-Ab的情況下，用100μg/ mL的AGE-BSA或非濃縮的BSA處理周細(xì)胞20（A）或7天（B）。A，然后，將[3H]胸苷加入培養(yǎng)基中。4小時(shí)后，測(cè)定[3H]胸苷摻入細(xì)胞中。每組n = 6至12。所有值均表示為平均值±SE。進(jìn)行單因素方差分析，然后進(jìn)行Games-Howell檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較; P <0.05被認(rèn)為是顯著的。＃和##，P <.05和P <.01分別與單獨(dú)使用AGE的值相比較。 功率≥0.93。B，用細(xì)胞死亡ELISA plus檢測(cè)測(cè)量凋亡細(xì)胞死亡。每組n = 18。所有值均表示為平均值±SE。進(jìn)行單因素方差分析，然后進(jìn)行Games-Howell檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較; P <0.05被認(rèn)為是顯著的。＃和##，P <.05和P <.01分別與單獨(dú)使用AGE的值相比較。 功率≥0.81。
圖4-蘿卜硫素對(duì)AGE暴露的周細(xì)胞中MCP-1基因表達(dá)的影響。
在存在或不存在0.1或0.4μmol/ L蘿卜硫素或5μg/ mL RAGE-Ab的情況下，用100μg/ mL AGE-BSA或非糖基化BSA處理周細(xì)胞24小時(shí)。然后，使用Prime Script RT Reagent試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNAs，并使用Assay-on-Demand和TaqMan 5熒光核酸酶化學(xué)法通過(guò)實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。數(shù)據(jù)通過(guò)β-肌動(dòng)蛋白mRNA衍生信號(hào)的強(qiáng)度歸一化，然后與單獨(dú)用BSA獲得的值相關(guān)。每組n = 3。所有值均表示為平均值±SE。進(jìn)行單因素方差分析，然后進(jìn)行Tukey檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較; P <.05被認(rèn)為是顯著的。＃和##，P <0.05和P <0.01分別與單獨(dú)使用AGE的值相比較。 功率≥0.79。
4. 討論
一些大型前瞻性臨床研究，糖尿病控制和并發(fā)癥試驗(yàn)[27]以及英國(guó)前瞻性糖尿病研究[28]，已經(jīng)表明，強(qiáng)化控制血糖或血壓可顯著降低糖尿病患者視網(wǎng)膜病變發(fā)展和進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。然而，嚴(yán)格控制血糖或血壓通常難以維持，并且可能增加低血糖或低血壓的風(fēng)險(xiǎn)。此外，目前治療威脅視力的增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療方案由于相當(dāng)大的副作用而遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能令人滿(mǎn)意[5]。因此，糖尿病患者需要開(kāi)發(fā)特異性靶向糖尿病性視網(wǎng)膜病的新型治療策略。
微血管由2種類(lèi)型的細(xì)胞，周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞組成[5,6]。以前的研究表明，周細(xì)胞有助于維持視網(wǎng)膜血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)[4-6]。此外，在具有血小板衍生生長(zhǎng)因子B（[±]小鼠）的單一功能等位基因的小鼠中，已經(jīng)顯示具有周細(xì)胞的視網(wǎng)膜毛細(xì)血管覆蓋對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞的存活是至關(guān)重要的，特別是在諸如糖尿病的應(yīng)激條件下[29]。這些觀(guān)察結(jié)果表明，周細(xì)胞的丟失是糖尿病視網(wǎng)膜病變最早的組織病理學(xué)標(biāo)志，可能使血管易于發(fā)生血管生成，血栓形成和內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜病變的全面臨床表現(xiàn)。
該研究首次表明，蘿卜硫素抑制AGE誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，RAGE表達(dá)，DNA合成減少和周細(xì)胞凋亡細(xì)胞死亡。此外，RAGE-Ab完全阻止了AGE對(duì)周細(xì)胞的這些有害影響。我們之前已經(jīng)證明AGE通過(guò)ROS產(chǎn)生刺激RAGE基因表達(dá)，并且一種抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸可以防止AGE暴露的周細(xì)胞中DNA合成的減少以及凋亡細(xì)胞死亡[12,30,31]。目前的研究結(jié)果表明，蘿卜硫素還可能抑制AGE誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜周細(xì)胞中DNA合成和凋亡細(xì)胞死亡的減少，部分原因是通過(guò)其抗氧化特性抑制RAGE表達(dá)。此外，AGE-RAGE相互作用可誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生并隨后上調(diào)RAGE表達(dá)，這可能加強(qiáng)AGE對(duì)周細(xì)胞的有害作用。因此，AGE-RAGE軸和ROS之間的串?dāng)_可能隨著周細(xì)胞的損傷而發(fā)生。換句話(huà)說(shuō)，RAGE與AGE→ROS結(jié)合導(dǎo)致RAGE基因誘導(dǎo)，隨后RAGE蛋白表達(dá)和生長(zhǎng)抑制和炎癥反應(yīng)的事件將導(dǎo)致凋亡性細(xì)胞死亡。這是一系列可能發(fā)生在AGE暴露的周細(xì)胞中的事件。因此，我們對(duì)每次測(cè)量使用不同的處理時(shí)間。鑒于糖尿病視網(wǎng)膜中AGE誘發(fā)的周細(xì)胞丟失的病理作用[4-6,32,33]，我們目前的研究表明，蘿卜硫素可能有助于預(yù)防糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展和進(jìn)展。
人們?cè)絹?lái)越關(guān)注炎癥反應(yīng)和免疫現(xiàn)象在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病機(jī)制中的作用[34,35]。白細(xì)胞粘附于糖尿病視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)被認(rèn)為是糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)鍵早期事件，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在糖尿病視網(wǎng)膜病變中積聚[34,35]。單核細(xì)胞趨化蛋白1是一種必需的趨化因子，可介導(dǎo)白細(xì)胞向炎性病變的募集[14]。此外，與非糖尿病患者相比，糖尿病視網(wǎng)膜病變中MCP-1的玻璃體水平顯著升高，并且與玻璃體液中的AGE和過(guò)氧化氫水平呈正相關(guān)[36]。這些觀(guān)察結(jié)果表明，蘿卜硫素對(duì)周細(xì)胞中AGE誘導(dǎo)的MCP-1表達(dá)的抑制可能具有臨床相關(guān)性。
Hanlon等[37]報(bào)道，攝入含3.9 mg蘿卜硫素的液化西蘭花后，蘿卜硫素的血漿濃度約為70 nmol / L。 據(jù)報(bào)道十字花科蔬菜（如西蘭花和卷心菜）中的蘿卜硫素含量約為18至75毫克/ 100克[37,38]。因此，對(duì)本實(shí)驗(yàn)中使用的周細(xì)胞具有有益效果的蘿卜硫素濃度（0.1-0.4μmol/ L）可與食用100g十字花科蔬菜后獲得的生理水平相當(dāng)。在本研究中，用0.4μmol/ L蘿卜硫素處理完全阻斷了AGE對(duì)ROS產(chǎn)生，RAGE表達(dá)和DNA合成的影響，而0.4μmol/ L蘿卜硫素對(duì)細(xì)胞凋亡和MCP-1 mRNA水平的作用是部分的。晚期糖基化終產(chǎn)物可能導(dǎo)致周細(xì)胞凋亡和MCP-1基因誘導(dǎo)，部分以ROS非依賴(lài)性方式。盡管與體內(nèi)相比，AGE的體外制備可以產(chǎn)生高度修飾的蛋白質(zhì)，但是在體外條件下形成的非生理性AGE不太可能對(duì)周細(xì)胞產(chǎn)生非特異性和毒性作用。這是因?yàn)椋?）體外制備的AGE的抗原表位實(shí)際上存在于糖尿病患者的血清中，并且（2）此處使用的AGE濃度（100μg/ mL）與糖尿病患者的濃度相當(dāng)[39]。
在這項(xiàng)研究中存在一些局限性，需要額外的工作來(lái)解釋ROS在蘿卜硫素誘導(dǎo)的RAGE抑制和抑制促凋亡和炎癥反應(yīng)中的積極參與。在抗氧化劑如N-乙酰半胱氨酸存在下測(cè)試蘿卜硫素是否也能夠降低RAGE表達(dá)并抑制周細(xì)胞中AGE的有害作用將是有趣的。此外，由于AGE和蘿卜硫素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響是適度的，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的2'-脫氧尿苷5'-三磷酸缺口末端標(biāo)記染色將是有用的。因?yàn)閙RNA水平并不總是與蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)，所以檢查蘿卜硫素是否實(shí)際上可以減少AGE暴露的周細(xì)胞產(chǎn)生MCP-1也是有幫助的。此外，通過(guò)二氫乙錠圖像染色評(píng)估蘿卜硫素對(duì)ROS產(chǎn)生的影響將加強(qiáng)目前的發(fā)現(xiàn)。雖然我們的體外研究結(jié)果表明，食用100克十字花科蔬菜可以防止周細(xì)胞損傷，但需要進(jìn)一步的前瞻性研究來(lái)闡明攝入的蘿卜硫素的量是否有助于預(yù)防糖尿病患者的視網(wǎng)膜病變。
我們目前的研究和其他研究表明，蘿卜硫素可以抑制AGE暴露的周細(xì)胞中DNA合成，細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的減少，部分是通過(guò)其抗氧化特性抑制RAGE。鑒于蘿卜硫素的濃度對(duì)本實(shí)驗(yàn)中使用的周細(xì)胞具有有益作用，它可以與食用100g十字花科蔬菜后獲得的生理水平相當(dāng)。通過(guò)蘿卜硫素封閉周細(xì)胞中的AGE-RAGE軸可能是治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變的新型治療靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。
本文由福山生物整理翻譯，轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明出處。
點(diǎn)擊咨詢(xún)
400-113-6988