在线亚洲精品专区 线路一_成年女人在线线免费视频_中文有码无码人妻丝袜_欧美人人人人草久久

摘要：
我們先前研究已經(jīng)表明，蘿卜硫素不僅抑制晚期糖基化產(chǎn)物（AGEs）的形成，而且對AGE暴露的人臍靜脈和注射AGE的大鼠主動脈的內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）發(fā)揮抗炎作用。在這里，我們考察了富含蘿卜硫素的西蘭花芽的水提取物對AGEs形成的影響，然后研究提取物是否可以減弱腫瘤壞死因子-α（TNF-α）或AGE暴露的HUVEC中的炎癥或氧化應(yīng)激反應(yīng)。將新鮮的西蘭花芽在磷酸鹽緩沖鹽水中打成勻漿，并通過紗布過濾，離心后，獲得澄清的提取物。通過酶聯(lián)免疫吸附測定法測量AGE形成，通過實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)評估基因表達(dá)，用熒光染料測量活性氧（ROS）的產(chǎn)生。5％西蘭花芽提取物可以抑制AGEs的形成，降低單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1），細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）和AGEs受體（RAGE）的基礎(chǔ)基因表達(dá)，并上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞硝酸 HUVEC中的氧化物合成酶（eNOS）mRNA水平。1％花椰菜芽提取物可以減弱TNF-α，上調(diào)HUVEC中的MCP-1，ICAM-1和RAGE mRNA水平。1％西蘭花芽提取物的預(yù)處理防止了AGEs引起的HUVEC中ROS的產(chǎn)生。 本研究表明富含蘿卜硫素的西蘭花芽提取物可抑制AGE-RAGE軸并在HUVEC中表現(xiàn)出抗炎作用。補(bǔ)充富含蘿卜硫素的西蘭花芽提取物可能對血管損傷起到保護(hù)作用。
 
1.引言
葡萄糖，甘油醛和甲基乙二醛等糖類可以與脂質(zhì)，蛋白質(zhì)和核酸的氨基酸進(jìn)行非酶促反應(yīng)，形成稱為“晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）”的衰老大分子，這一過程在炎癥和高血糖存在的條件下已顯示 [1-9]。越來越多的證據(jù)表明，AGEs不僅可以改變大分子的結(jié)構(gòu)完整性和功能，還可以通過與AGEs受體（RAGE）的相互作用引起各種類型細(xì)胞和器官的氧化應(yīng)激的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)其發(fā)展。許多衰老和糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥，包括動脈粥樣硬化性心血管疾病，癌癥生長和轉(zhuǎn)移，骨質(zhì)疏松癥和阿爾茨海默氏病[1-9]，這些結(jié)果表明，AGE-RAGE軸可能是這些破壞性疾病的新型治療靶點。
我們和其他人的試驗結(jié)果共同表明，蘿卜硫素在體外抑制AGEs的形成，并通過減少RAGE的表達(dá)來減少AGE暴露的內(nèi)皮細(xì)胞和AGE輸注的大鼠主動脈中的炎癥反應(yīng)[10-12]。此外，口服富含蘿卜硫素的西蘭花芽提取物已顯示出對致癌物質(zhì)引起的皮膚癌，乳腺癌和胃癌的化學(xué)預(yù)防活性，并減弱對空氣污染物，幽門螺桿菌誘發(fā)的胃炎，紫外線輻射誘發(fā)的皮膚損傷的過敏反應(yīng)，以及人體脂肪肝通過其抗炎作用[13-17]。然而，尚不清楚西蘭花芽提取物是否會對內(nèi)皮細(xì)胞中的AGE-RAGE軸表現(xiàn)出抑制作用。因此，在本研究中，我們檢測了蘿卜硫素前體，富含蘿卜硫苷的花椰菜芽的水提取物對體外AGE形成的影響，然后研究了該提取物是否能減弱腫瘤壞死因子-α（TNF-α）或AGE暴露的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的炎癥反應(yīng)。
 
2.材料和方法
2.1.材料.牛血清白蛋白（BSA）（基本上不含脂肪酸）和D-甘油醛購自Sigma（St.Louis，MO，USA）。TNF-α購自Cell Signaling Technology（Danvers，MA，USA）。
2.2. AGE-BSA的制備。如前所述制備AGE-BSA [10]。 簡言之，將BSA（25mg / ml）在無菌條件下與0.1M甘油醛在0.2M NaPO ₄緩沖液（pH7.4）中，在37℃溫育7天。然后通過用磷酸鹽緩沖鹽水透析除去未摻入的糖。對照非濃縮BSA組在相同條件下孵育，除了如前所述不存在D-甘油醛[10]。
2.3.富含蘿卜硫素的西蘭花芽提取物的制備。富含蘿卜硫素（6μmol的蘿卜硫苷/ g）的西蘭花芽由ca. Fahey[18]等人鑒定，并在日本廣島的Murakami農(nóng)場進(jìn)行培育和存放（Broccoli Super Sprout，Part No.3399642）。富含蘿卜硫素的西蘭花芽從當(dāng)?shù)爻蝎@得。將新鮮的西蘭花芽（50 g）懸浮并在50 ml磷酸鹽緩沖鹽水（pH 7.4）中均質(zhì)化，打漿攪拌并通過紗布過濾，在4℃下以3000 g離心30分鐘后，獲得所得的透明提取物并在-30℃下儲存。稀釋的西蘭花芽提取物用磷酸鹽緩沖鹽水或細(xì)胞培養(yǎng)基制成終濃度為1％和5％的西蘭花芽提取物。
2.4.AGEs的測量。在存在或不存在指定濃度的西蘭花芽提取物的情況下，將BSA（25mg / ml）與1mM甘油醛一起溫育1天，然后如前所述用酶聯(lián)免疫吸附測定法測量AGE水平[19]。測定內(nèi)和測定間變異系數(shù)分別為6％和2.6％。
2.5.細(xì)胞。按照廠家建議，從Lonza Group Ltd.（瑞士巴塞爾）獲得的HUVEC在補(bǔ)充有2％胎牛血清，0.4％牛腦提取物，10ng / ml人表皮生長因子和1μg/ ml氫化可的松的內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。TNF-α，AGEs和/或西蘭花芽提取物的處理在缺乏表皮生長因子和氫化可的松的培養(yǎng)基中進(jìn)行。
2.6.實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）。在存在或不存在指定濃度的西蘭花芽提取物的情況下，用或不用10ng / mlTNF-α處理HUVEC 4小時。然后根據(jù)廠家的說明用RNA水溶性4 PCR試劑盒（AmbionInc.，Austin，TX，USA）提取總RNA。根據(jù)廠家推薦，使用按需測定和TaqMan 5熒光核酸酶化學(xué)（Applied Biosystems，F(xiàn)oster city，CA，USA）法進(jìn)行實時定量RT-PCR。引物的標(biāo)志是人單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1），細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1），RAGE，內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS），β-肌動蛋白和18S rRNA基因的引物ID為Hs00234140 m1，Hs00164932 m1，Hs00542592 g1，Hs01574659 m1，Hs99999903 m1和Hs99999901 s1。
2.7.活性氧（ROS）產(chǎn)生的測量。如前所述[10]，使用熒光探針羧基-H₂ DFFDA（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）測量ROS產(chǎn)生。簡言之，將HUVEC用或不用1％西蘭花芽提取物處理4小時。用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細(xì)胞后，在1μM羧基H₂ DFFDA存在下，將細(xì)胞與100μg/ ml AGEs或100μg/ ml非糖基化BSA一起溫育25分鐘，然后測量熒光強(qiáng)度。
2.8.統(tǒng)計分析。所有值均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。單因素方差分析，然后是圖2（b），2（c）和4（a）的Tukey HSD測試，圖1和2（a）的Games-Howell測試，圖4（c）的Steel-Dwass測試和圖3和4（b）的學(xué)生t檢驗用于統(tǒng)計比較; p <0.05被認(rèn)為是顯著的。
 
3.結(jié)果
我們首先研究了西蘭花芽提取物對AGEs形成的影響。 如圖1所示，用1mM甘油醛孵育BSA 1天，增加了AGEs的形成，其被5％但不是1％的花椰菜芽提取物顯著抑制。
5％西蘭花芽提取物的4小時孵育顯著降低HUVEC中的基礎(chǔ)MCP-1和ICAM-1 mRNA水平，同時其上調(diào)eNOS mRNA水平（圖2）。 然而，除了ICAM-1，1％的西蘭花芽提取物不影響這些基因表達(dá)，通過用1％西蘭花芽提取物處理，基礎(chǔ)ICAM-1 mRNA水平降低至對照細(xì)胞的40％（圖2（b））。
我們接下來研究了1％西蘭花芽提取物對TNF-α暴露的HUVEC中MCP-1，ICAM-1和eNOS基因表達(dá)的影響。如圖3（a）和3（b）所示，1％西蘭花芽提取物顯著抑制TNF-α上調(diào)MCP-1和ICAM-1的mRNA水平。TNF-α降低HUVECs中eNOS基因的表達(dá)，但不受1％西蘭花芽提取物的影響（圖3（c））
我們進(jìn)一步研究了西蘭花芽提取物對HUVEC中RAGE基因表達(dá)的影響。如圖4（a）所示，西蘭花芽提取物劑量依賴性地降低HUVEC中的基礎(chǔ)RAGE mRNA水平。 此外，1％西蘭花芽提取物顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC中RAGE mRNA水平的上調(diào)（圖4（b））。盡管AGEs在載體預(yù)處理的HUVEC中引起ROS產(chǎn)生，但在1％西蘭花芽提取物預(yù)處理的HUVEC中未觀察到AGE的ROS誘導(dǎo)作用（圖4（c））。
 
循證補(bǔ)充和替代醫(yī)學(xué)

圖1：西蘭花芽提取物對體外AGEs形成的影響。在存在或不存在指定濃度的富含蘿卜硫苷的西蘭花芽提取物的情況下，將BSA與1mM甘油醛一起溫育1天，然后用酶聯(lián)免疫吸附測定法測量AGEs的水平。每組N = 3。 **，與載體對照值相比p <0.01。
 
4.討論
在這項研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)富含5％不是1％蘿卜硫素在體外對布魯氏菌顯著抑制AGEs的形成。當(dāng)西蘭花芽在沸水中提取并且提取物用活性白蘿卜素酶處理時，大約一半的蘿卜硫苷（西蘭花芽中的蘿卜硫素的前體）已被證明可轉(zhuǎn)化為蘿卜硫素[20]。因此，如果我們假設(shè)冷水的提取效率約為沸水的1 / 3~2 / 3，那么新鮮西蘭花芽中的蘿卜硫苷會被內(nèi)源性黑芥子酶水解并轉(zhuǎn)化為蘿卜硫素，效率約為50％[18]。用于本實驗的1％和5％花椰菜芽提取物估計含有大約1％，分別為2.5?5和12.5?25μM的蘿卜硫素?；谖覀冎暗陌l(fā)現(xiàn)，25μM但不是0.4μM的蘿卜硫素在體外抑制AGEs的形成[12]，5％花椰菜芽提取物對AGE形成的抑制作用可能主要歸因于其高含量的蘿卜硫素。每天攝入25克富含蘿卜硫苷的西蘭花芽2個月，可顯著降低健康志愿者血清AGEs水平20％，同時伴隨著AGEs與可溶性RAGE的比例下降，RAGE是AGE-RAGE活化的標(biāo)志物 [12,21]。 總之，這些觀察結(jié)果表明，食用富含蘿卜硫素的西蘭花芽提取物可以減少人體內(nèi)AG-RAGE系統(tǒng)的活化。
我們在這里發(fā)現(xiàn)5％西蘭花芽提取物4小時使HUVEC中MCP-1，ICAM-1和RAGE的基礎(chǔ)基因表達(dá)水平降低50-90％，同時它將eNOS mRNA水平增加至對照值的1.5倍。因此，這種濃度的西蘭花芽提取物不太可能對HUVEC產(chǎn)生毒性作用。 然而，由于5％西蘭花芽提取物對未經(jīng)處理的HUVECs的影響很大，我們在TNF-α或AGE暴露的HUVEC實驗中選擇了1％西蘭花芽提取物的濃度。在本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)TNF-α誘導(dǎo)MCP-1，ICAM-1和RAGE mRNA水平的上調(diào)，并且被1％的西蘭花芽提取物顯著減弱。1％西蘭花芽提取物中MCP-1，ICAM-1和RAGE mRNA水平的降低程度在未處理和暴露于TNF-α的HUVEC中幾乎相似。已顯示2.5μM的蘿卜硫素可刺激NF-E2相關(guān)因子-2（Nrf2）的核轉(zhuǎn)位并誘導(dǎo)II相抗氧化酶，從而抑制氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB（NF）-κB）激活[22]。鑒于MCP-1，ICAM-1和RAGE基因表達(dá)受NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控[10,23]，1％西蘭花芽提取物可以減少基礎(chǔ)和TNF-α誘導(dǎo)的MCP-1，ICAM-1和通過抑制NF-κB活化，HUVEC中的RAGE mRNA水平可能依賴于蘿卜硫素誘導(dǎo)的Nrf2激活。為了支持我們的推測，據(jù)報道含有1％西蘭花芽提取物（5μM蘿卜硫素），可抑制HUVEC中氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)，在敲除Nrf2的模型中其有益作用被減弱 [24]。此外，我們先前已經(jīng)證明1.6μM蘿卜硫素還抑制AGE暴露的HUVEC中的氧化應(yīng)激產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)[10]。這些發(fā)現(xiàn)表明，與AGE形成的情況一樣，西蘭花芽提取物在HUVEC中的抗炎作用可能主要歸因于蘿卜硫素。然而，我們不能完全排除西蘭花芽提取物中含有的其他植物化學(xué)物質(zhì)可能發(fā)揮抗炎作用的可能性。事實上，據(jù)報道β-胡蘿卜素與槲皮素或維生素C和E聯(lián)合可以恢復(fù)抗氧化酶活性并抑制苯并[a] 芘暴露的蒙古沙鼠肺部的NF-κB活化[25]。此外，槲皮素和蘿卜硫素在AGE暴露的HUVECs中可以抑制ROS的產(chǎn)生和MCP-1和RAGE基因的表達(dá)[12]。雖然槲皮素是西蘭花芽中含有的主要黃酮類化合物之一（50μg槲皮素/ g西蘭花芽）[26]，但在我們目前的研究中，認(rèn)為槲皮素不太可能起到抗炎作用，因為它幾乎不溶于水[26]，27]。
我們和其他人研究結(jié)果同時表明，RAGE與AGEs的結(jié)合會引起HUVECs中氧化應(yīng)激的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)[28-30]。在這項研究中，1％西蘭花芽提取物不僅降低了未處理和TNF-α處理的HUVEC中的RAGE mRNA水平，而且還阻斷了AGEs引起的ROS產(chǎn)生。因此，西蘭花芽提取物可以通過至少兩種機(jī)制減弱AGE-RAGE途徑的活化：一種是抑制AGE形成，另一種是抑制RAGE表達(dá)。由于AGE-RAGE相互作用介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生可以進(jìn)一步刺激AGEs的形成和誘導(dǎo)RAGE [31-33]，因此西蘭花芽提取物可以打破AGE-RAGE軸和ROS產(chǎn)生之間的惡性循環(huán)。
越來越多的證據(jù)表明，MCP-1和ICAM-1刺激炎癥細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的募集和牢固粘附，從而促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)展和進(jìn)展[34-36]。此外，內(nèi)皮細(xì)胞衍生的一氧化氮不僅可以預(yù)防內(nèi)皮功能障礙，還可以抑制炎癥和血栓形成反應(yīng)，從而在維持血管血管穩(wěn)定中發(fā)揮關(guān)鍵作用[37,38]。此外，受損的內(nèi)皮功能與慢性腎病大鼠動脈組織中Nrf2活性降低有關(guān)[39]，而Nrf2的激活已被證明可增加內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS的表達(dá)和磷酸化[40]。這些觀察表明，西蘭花芽提取物可通過其抗炎特性部分地通過激活Nrf2-NO系統(tǒng)而對血管損傷起到保護(hù)作用。
 
循證補(bǔ)充和替代醫(yī)學(xué)

圖2：西蘭花芽提取物對HUVEC中MCP-1（a），ICAM-1（b）和eNOS mRNA水平（c）的影響。用或不用指定濃度的富含蘿卜硫苷的花椰菜芽提取物處理HUVEC 4小時。然后通過實時PCR轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增總RNA。數(shù)據(jù)通過β-肌動蛋白-RNA-（a和b）或18S rRNA-衍生信號（c）的強(qiáng)度歸一化，然后與載體的對照值相關(guān)。 每組N = 3。 **，與載體對照值相比p <0.01。

圖3：西蘭花芽提取物對暴露于TNF-α的HUVEC中的MCP-1（a），ICAM-1（b），和eNOSmRNA水平（c）的影響。在存在或不存在1％富含蘿卜硫苷的西蘭花芽提取物的情況下，用或不用10ng / ml TNF-α處理HUVEC 4小時。然后通過實時PCR轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增總RNA。 數(shù)據(jù)通過18S rRNA衍生信號的強(qiáng)度歸一化，然后與載體的值相關(guān).N = 3個組。與TNF-α單獨的值相比，##，p <0.01。**，與載體的對照值相比，p <0.01。

圖4：西蘭花芽提取物對HUVEC中RAGE mRNA水平（a和b）和ROS產(chǎn)生（c）的影響。（a和b）在存在或不存在1％的情況下，用或不用10ng / ml TNF-α處理HUVECs 富含蘿卜硫素的西蘭花芽提取物4小時。然后通過實時PCR轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增總RNA。通過β-肌動蛋白mRNA-（a）或18S rRNA衍生的信號（b）的強(qiáng)度對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，然后將其與載體的值相關(guān)聯(lián)。（c）用或不用1％西蘭花芽提取物處理HUVEC 4小時。用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞后，在羧基-H₂ DFFDA存在下，將細(xì)胞與100μg/ ml AGEs或100μg/ ml非糖基化BSA一起溫育25分鐘，然后測量熒光強(qiáng)度。 *和**，分別與載體對照值相比，p <0.05d p <0.01。 ＃，與TNF-α單獨的值相比p <0.05。 N.S：不顯著。
 
5.結(jié)論
     在這項研究中，我們無法澄清西蘭花芽提取物中可能與觀察到的效果有關(guān)的活性成分。然而，本研究的目的是澄清富含蘿卜硫素的西蘭花芽的水提取物是否能夠抑制AGE-RAGE軸并且在HUVEC中表現(xiàn)出抗炎作用，如在蘿卜硫素的情況下[10,12]。我們目前的研究表明富含蘿卜硫素的西蘭花芽提取物可通過幾種機(jī)制發(fā)揮抗血管損傷的有益作用，例如抑制AGE形成，抑制炎癥反應(yīng)，降低RAGE表達(dá)和上調(diào)eNOS mRNA水平。需要進(jìn)一步的縱向臨床研究來闡明富含蘿卜硫素的西蘭花芽提取物的補(bǔ)充是否可以預(yù)防動脈粥樣硬化性心血管疾病的發(fā)展和進(jìn)展。
 

本文由福山生物整理翻譯，轉(zhuǎn)載請注明出處。