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蘿卜硫素與吡哆胺的補充使2型糖尿病中的內(nèi)皮功能紊亂恢復(fù)正常
發(fā)表于：2019-05-13 作者：admin 來源：本站 點擊量：13977
摘要
在本研究中，我們把吡哆胺（PM）和/或蘿卜硫素（SFN）作為治療干預(yù)措施，用于確定NFE2相關(guān)因子2（Nrf2）的激動劑是否可以同晚期糖基化終產(chǎn)物（AGE）形成抑制劑一起使用，達(dá)到減輕2型糖尿病患者的氧化應(yīng)激和改善其內(nèi)皮功能障礙。Goto Kakizaki（GK）大鼠，一種非肥胖型2型糖尿病動物模型，在8周內(nèi)接受或不接受PM和/或SFN治療，并與年齡匹配的Wistar大鼠進(jìn)行比較。在治療結(jié)束時，評估孤立主動脈和腸系膜動脈中一氧化氮（NO）依賴性和非依賴性的血管舒張。還評估了代謝概況、NO生物利用度和血管氧化應(yīng)激、AGE和Nrf2水平。糖尿病GK大鼠的Nrf2水平顯著降低，同時氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能障礙水平也較高。PM和SFN作為單一療法能夠顯著改善主動脈和腸系膜動脈的內(nèi)皮功能障礙，降低血管氧化損傷、AGE和HbA1c水平。此外，在GK大鼠中已證明，SFN+PM能更有效地降低全身游離脂肪酸水平，使內(nèi)皮功能、NO生物利用度和糖化作用正?；?。Nrf2激動劑可與AGE抑制劑和交聯(lián)形成抑制劑聯(lián)用來治療2型糖尿病內(nèi)皮功能障礙。
2型糖尿病與氧化應(yīng)激水平升高和糖基化改變血管功能有關(guān)，因此被認(rèn)為是心血管疾病發(fā)展的主要危險因素。許多的糖尿病并發(fā)癥都與高血糖和活性氧物種（ROS）生成增加有關(guān)，其導(dǎo)致了內(nèi)皮功能紊亂。對血管舒張劑（如乙酰膽堿）的內(nèi)皮依賴性舒張功能受損是1型和2型糖尿病實驗?zāi)Ｐ椭袑?dǎo)管和阻力動脈的共同特征。我們先前發(fā)現(xiàn)糖尿病GK大鼠的氧化應(yīng)激和糖基化增加，而這種變化導(dǎo)向內(nèi)皮功能障礙。
糖尿病的治療進(jìn)展并不能有效地減少糖尿病相關(guān)的血管并發(fā)癥?？紤]到ROS在內(nèi)皮功能中的關(guān)鍵作用，人們已經(jīng)作出了相當(dāng)大的努力來探索降低血管系統(tǒng)中ROS的治療方法。核因子E2（紅系衍生2）相關(guān)因子-2（Nrf2）是一種轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞對氧化應(yīng)激的保護中起著關(guān)鍵作用。Nrf2被稱為抗氧化劑反應(yīng)的“主調(diào)節(jié)器”。通過Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件途徑激動劑誘導(dǎo)內(nèi)源性抗氧化酶可能是獲得足夠水平的抗氧化劑和減少氧化應(yīng)激的一種有趣方法。膳食中的NRF2激動劑，如十字花科蔬菜中發(fā)現(xiàn)的異硫氰酸鹽蘿卜硫素（SFN），可以增加抗氧化防御，降低血壓，抑制腎臟內(nèi)促炎信號通路，并預(yù)防高血糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞代謝紊亂。在糖尿病模型中，Nrf2的激活降低了野生型小鼠的血糖水平，減少了糖尿病相關(guān)腎病，但在Nrf2缺乏的小鼠中則沒有。因此，Nrf2誘導(dǎo)劑在血管疾病中的治療潛力巨大，特別是與長期2型糖尿病有關(guān)的血管疾病。
表1 8個月大的非糖尿病Wistar大鼠（W）、糖尿病Goto-Kakizaki大鼠（GK）、接受蘿卜硫素處理的GK大鼠（GKS）、接受吡哆胺處理的GK大鼠（GKP）和接受蘿卜硫素與吡哆胺處理的GK大鼠（GKSP）的體重和血脂水平。數(shù)據(jù)表示為平均值±SE（n=12每組動物）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs W大鼠。與GK大鼠相比，φφφP<0.001。§P<0.05 vs GKS大鼠。#P<0.05 vs GKP大鼠。
此外，在糖尿病情況下的晚期糖基化加速導(dǎo)致血管并發(fā)癥。幾位作者已經(jīng)證明，抑制晚期糖基化終產(chǎn)物（AGE）形成可能是改善糖尿病血管并發(fā)癥的一種治療策略。吡哆胺（PM）是維生素B6的一種天然衍生物，已被證明是一種有效的蛋白質(zhì)糖化和脂質(zhì)氧化抑制劑。在體外和體內(nèi)，PM均能抑制AGE的形成，對糖尿病腎病和視網(wǎng)膜病變的治療具有潛在的益處。
蘿卜硫素和吡哆胺有不同的作用機制。因此，我們假設(shè)單獨或聯(lián)合使用SFN、PM對2型糖尿病模型Goto-Kakizaki（GK）大鼠的內(nèi)皮依賴性血管反應(yīng)性、氧化應(yīng)激和代謝參數(shù)具有有益影響。在糖尿病進(jìn)展的同時，對脂質(zhì)分布、氧化應(yīng)激、糖基化和一氧化氮（NO）生物利用度進(jìn)行了評價。此外，還評估了主動脈和腸系膜動脈對乙酰膽堿（ACH）和硝普鈉（SNP）的內(nèi)皮依賴性和非依賴性血管敏感性。與Wistar大鼠相比，8個月大的GK大鼠表現(xiàn)出長期糖尿病表型，導(dǎo)管和阻力動脈內(nèi)皮功能障礙，以及氧化應(yīng)激增加。單用SFN和PM可以改善孤立動脈中的NO依賴性血管舒張。順帶一提，SFN和PM通過一種機制使主動脈和腸系膜動脈的內(nèi)皮功能正?；摍C制包括NO生物利用度的增加，以及氧化應(yīng)激和AGE水平的降低?？傊?，這些研究表明，針對引起內(nèi)皮功能障礙的不同機制，抑制AGE形成（PM）和促進(jìn)抗氧化防御系統(tǒng)（SFN）增強應(yīng)是對抗糖尿病大血管并發(fā)癥的有用工具，因其同時作用于最終導(dǎo)致血管損傷的不同機制。
結(jié)論
動物特征。我們實驗中使用的糖尿病大鼠在研究開始時表現(xiàn)出類似的空腹血糖水平。治療前的GK大鼠血糖（GK6M）明顯高于年齡匹配的非糖尿病大鼠（圖1補充）。GK大鼠的體重明顯低于年齡匹配的Wistar大鼠，不同的治療方法并沒有顯著改變這個參數(shù)（表1）。在腹膜內(nèi)葡萄糖耐量試驗（IPGTT）中，GK大鼠與Wistar大鼠相比表現(xiàn)出明顯的葡萄糖不耐（圖1A）。與Wistar大鼠相比，GK大鼠的空腹血糖、葡萄糖曲線下面積（AUC）、HbA1c、總膽固醇和游離脂肪酸（FFA）升高（圖1B、C、D、表1）。如前所述，GK大鼠表現(xiàn)出正常的非HDL膽固醇和甘油三酯水平（表1）。單用SFN或PM治療并沒有顯著改變糖耐量和脂質(zhì)分布評估（圖1A、C，表1）。同時，PM顯著降低了空腹血糖和HbA1c水平（圖1B、D）。事實上，所有的治療方法都能有效降低GK大鼠的HbA1c水平（圖1D）。此外，使用SFN和PM治療8周可有效降低糖尿病大鼠的血液中FFA濃度（表1），并顯著改善葡萄糖耐受性（圖1A、C）。
NO依賴性血管舒張。8個月大的GK大鼠與年齡匹配的Wistar大鼠相比，苯腎上腺素預(yù)收縮后的主動脈環(huán)響應(yīng)乙酰膽堿（ACh）引起的內(nèi)皮介導(dǎo)血管舒張能力受損（圖2A），但對硝普鈉（SNP）引起的非內(nèi)皮依賴性舒張在這兩個物種中相似（圖3A）。事實上，在糖尿病大鼠中，苯腎上腺素預(yù)收縮主動脈環(huán)對乙酰膽堿引起的內(nèi)皮介導(dǎo)血管最大舒張值降低了49%（圖2A）。在GK大鼠和Wistar大鼠中，用NOS抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）和環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛預(yù)孵化后的動脈環(huán)幾乎完全消除了Ach的松弛作用（圖2補充）。在我們的實驗條件下，其他血管擴張劑的殘余成分約為15%。在主動脈中，沒有觀察到不同組間SNP量效曲線在最大舒張值上的差異（圖3A）。所有GK治療組的最大舒張值顯著改善，對Ach的血管反應(yīng)性有所改善（圖2A，表2）。用SFN、PM或SFN+PM治療可顯著改善糖尿病大鼠主動脈內(nèi)皮依賴性血管舒張（圖2A，表2）。這種血管舒張對吲哚美辛不敏感，并被L-NAME阻斷，表明其機制依賴于內(nèi)源性NO釋放（圖2補充）。此外，在所有GK治療組中觀察到SNP敏感性增加（圖3A，表2）。在腸系膜動脈中，糖尿病大鼠的苯腎上腺素預(yù)收縮后動脈環(huán)響應(yīng)Ach引起的內(nèi)皮介導(dǎo)的最大舒張值降低了36%（圖2B）。此外，糖尿病大鼠響應(yīng)SNP引起的最大舒張值下降了39%（圖3B）。用SFN、PM或SFN+PM治療能夠改善內(nèi)皮依賴性血管擴張（圖2B，表3）。類似地，這種作用對吲哚美辛不敏感，并被L-NAME抑制（圖2補充）。表2和表3總結(jié)了最大舒張值和EC50值的詳細(xì)數(shù)據(jù)。這些結(jié)果表明，單用SFN或PM治療可改善糖尿病GK大鼠主動脈和腸系膜動脈的內(nèi)皮依賴性血管舒張。與此相關(guān)，這些療法能夠使內(nèi)皮介導(dǎo)的舒張正?；?，并提高主動脈和腸系膜動脈的SNP敏感性（圖2、3）。
圖1 與非糖尿病Wistar（W）大鼠相比，8個月大的糖尿病Goto-Kakizaki（GK）大鼠蘿卜硫素和吡哆胺處理的效果，腹腔葡萄糖耐量試驗（IPGTT；A）、空腹血糖（B）、葡萄糖曲線下面積（AUC；C）和糖化血紅蛋白（HbA1c）水平（D）。C）計算IPGTT曲線的AUC，以測量葡萄糖耐量受損的程度。數(shù)據(jù)表示為平均值±SE（n=12）。***P<0.001 vs Wistar組；φP<0.05，φφP<0.01，φφφP<0.001 vs GK組。
血管壁的氧化應(yīng)激。我們確定了SFN、PM或兩者對糖尿病血管系統(tǒng)氧化應(yīng)激的潛在影響。有趣的是，糖尿病導(dǎo)致糖尿病大動脈中的超氧化物生成量增加了3倍（p<0.001；圖4B，K）。與GK大鼠相比，用SFN、PM和SFN+PM治療的糖尿病大鼠主動脈中二氫乙啶（DHE，ROS熒光探針）的密度顯著降低（圖4C、D、E、K）。此外，糖尿病GK大鼠腸系膜動脈中的免疫反應(yīng)性硝基酪氨酸（蛋白質(zhì)氧化生物標(biāo)志物）水平也升高（p<0.001；圖4G，L），并且用SFN、PM或兩者治療后，這些水平顯著降低（圖4H，I，J，L）。因此，所有療法都能顯著降低糖尿病GK大鼠主動脈和腸系膜動脈的血管氧化損傷。相應(yīng)地，GK大鼠尿中8-羥基-2’-脫氧鳥苷（8-OHdG，DNA氧化損傷生物標(biāo)志物）的水平明顯高于年齡匹配的Wistar大鼠（圖4M）。對GK大鼠使用SFN、PM或兩者治療8周后，8-OHdG水平顯著降低（圖4M）。
主動脈中的肺血管緊張素和總血管緊張素。血管舒張劑激活磷蛋白（VASP）在Ser239的磷酸化被證明是生物活性NO和NO-cGMP蛋白激酶G信號通路活性的指標(biāo)。為了確定NO生物利用度，我們測量了主動脈中磷酸化血管舒張劑激活磷蛋白（pVASP）和總VASP。GK大鼠的主動脈pVASP/tVASP比率明顯低于Wistar大鼠（圖5A，B）。在糖尿病GK大鼠（GKS，GKP；GKSP；圖5A，B）中，用SFN、PM或兩者治療可顯著提高pVASP/TVSP比率。在腸系膜動脈中觀察到類似的情況（數(shù)據(jù)未列出）。
圖2 與非糖尿病Wistar大鼠（W）相比，蘿卜硫素和吡哆胺處理對GK大鼠主動脈（A）和腸系膜動脈（B）乙酰膽堿舒張反應(yīng)的影響。數(shù)據(jù)表示為平均值±SE（n=12）。*P<0.05，***P<0.001 vs Wistar組；φP<0.05，φφP<0.01，φφφP<0.001 vs GK組；§P<0.05 vs GKS組；#P<0.05 vs GKP組。
圖3 與非糖尿病Wistar大鼠（W）相比，蘿卜硫素和吡哆胺處理對GK大鼠主動脈（A）和腸系膜動脈（B）中硝普鈉舒張反應(yīng)的影響。數(shù)據(jù)表示為平均值±SE（n=12）。*P<0.05，****P<0.001 vs Wistar組；φφP<0.01，φφφP<0.001 vs GK組。
表2 8個月大的不同處理的自發(fā)性糖尿病Goto-Kakizaki（GK）大鼠和年齡匹配的非糖尿病Wistar大鼠離體主動脈的最大舒張反應(yīng)（%）和−logEC50。數(shù)據(jù)表示為平均值±SE（n=12每組動物）。 pEC50值以激動劑濃度的負(fù)對數(shù)（−logEC50）表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs W大鼠。與GK大鼠相比，φφP<0.01，φφφP<0.001。§P<0.05 vs GKS。 #P<0.05 vs GKP。
表3 8個月大的自發(fā)性糖尿病Goto-Kakizaki（GK）大鼠和匹配的非糖尿病Wistar大鼠腸系膜動脈的最大松弛反應(yīng)（%）和−logEC50。數(shù)據(jù)表示為平均值±SE（n=12每組動物）。pEC50值以激動劑濃度的負(fù)對數(shù)（−logEC50）表示。***P<0.001 vs W大鼠。與GK大鼠相比，φP<0.05，φφP<0.01，φφφP<0.01。§P<0.05 vs GKS。#P<0.05 vs GKP。
主動脈和腸系膜動脈中的Nrf2水平。我們隨后量化了不同組大鼠動脈中的Nrf2水平。用Western blot檢測主動脈中的Nrf2水平，以共聚焦顯微鏡觀察腸系膜動脈中的免疫熒光檢來測Nrf2水平。糖尿病大鼠血管中的Nrf2水平明顯低于主動脈和腸系膜動脈中年齡匹配的Wistar大鼠（圖6I，F(xiàn)）。蘿卜硫素治療組（GKS和GKSP）顯著增加了主動脈和腸系膜動脈中的細(xì)胞核Nrf2水平（圖6J，G）。Nrf2激動劑SFN增加糖尿病GK大鼠Nrf2的核定位，這可能導(dǎo)致抗氧化防御增加，促進(jìn)血管氧化應(yīng)激的減少。在糖尿病GK大鼠的主動脈和腸系膜動脈中，SFN顯著增加了Nrf2的表達(dá)（圖6），這表明它同時促進(jìn)了表達(dá)增加和核易位，與其在其他組織中的作用相一致。
主動脈和腸系膜動脈的AGE水平。接下來，我們量化了不同組大鼠動脈中的AGE水平。主動脈和腸系膜動脈的AGE水平用共聚焦顯微鏡測量。糖尿病大鼠主動脈和腸系膜動脈中的AGE水平明顯高于年齡匹配的Wistar大鼠（分別為圖7B、K、G、L）。GK治療組（GKS、GKP和GKSP）主動脈和腸系膜動脈的血管AGE水平顯著降低（圖7K，L）。值得注意的是，PM治療組（GKP，GKSP）血管壁具有正常的AGE水平。
討論
在目前的研究中，蘿卜硫素、吡哆胺及其聯(lián)用對GK大鼠的糖尿病內(nèi)皮功能障礙表現(xiàn)出明顯的治療潛力。用SFN、PM或兩者聯(lián)合治療GK大鼠可顯著降低主動脈和腸系膜動脈的內(nèi)皮功能障礙。在這些血管中，SFN、PM或SFN+PM治療可延緩包括氧化損傷在內(nèi)的糖尿病內(nèi)皮功能障礙病理特征的出現(xiàn)。此外，這兩種相關(guān)療法都能降低FFA水平，也增加了NO生物利用度，這可以部分解釋2型糖尿病長期模型中內(nèi)皮功能的正?；?br /> GK大鼠為非肥胖2型糖尿病動物模型，具有輕度高血糖、高胰島素血癥和胰島素抵抗。長期糖尿病通常與這些動物的胰腺功能喪失有關(guān)，其特征也類似于人類疾病進(jìn)展中的相關(guān)特征。該模型與人類2型糖尿病共有包括異常血管反應(yīng)性在內(nèi)的多種心血管表型，證明其作為研究糖尿病并發(fā)癥的模型是合適的。
在此，我們發(fā)現(xiàn)8個月大的GK大鼠具有高血糖，顯著增加的總膽固醇和循環(huán)FFA水平的特征。內(nèi)皮功能障礙在腸系膜動脈和主動脈動脈中都很明顯，其伴隨著氧化應(yīng)激和糖基化作用升高、NO生物利用度下降和Nrf2水平降低。
Nrf2抗氧化功能在血管疾病中可能很重要。SFN是一種在西蘭花中發(fā)現(xiàn)的Nrf2激動劑，增加抗氧化反應(yīng)元件相關(guān)轉(zhuǎn)錄控制下的保護酶的表達(dá)，并防止由高血糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞代謝功能障礙。在其它研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合西蘭花芽苗中SFN的生物利用度，測定了該化合物的濃度。我們估計，在人體飲食可行的生理劑量下，SFN對治療內(nèi)皮功能障礙具有潛在的治療益處。另一方面，我們最近檢查了2型糖尿病動物模型的AGE水平，發(fā)現(xiàn)血漿和血管壁的AGE水平都在增加。如PM的化合物可以降低高水平的AGE，和這種方法對內(nèi)皮功能有潛在的有益作用。這兩種療法對大血管疾病的治療效果尚未被研究過。在本文中，我們研究了在血管水平上，有或沒有與PM共同抑制年齡形成的SFN的作用。
圖4 與非糖尿病Wistar（W）大鼠相比，蘿卜硫素和吡哆胺處理對GK大鼠全身和血管氧化應(yīng)激的影響。代表性的DHE染色的主動脈段反映了不同處理（A-E）下的氧氣生成。所有的內(nèi)皮都朝上。在相同的條件下，糖尿病患者GK（B）的熒光明顯高于正常血管（Wistar，A）。注意到GK主動脈內(nèi)皮、內(nèi)膜和介質(zhì)中反射O2·−水平的熒光增強。糖尿病GK大鼠服用SFN（GKS，C）、PM（GKP，D）和SFN+PM（GKSP，E）后，DHE熒光降低。面板（K）包含不同動脈組中熒光溴化乙錠信號的量化。具有代表性的腸系膜切片用硝基酪氨酸染色顯示非糖尿病Wistar大鼠（F），糖尿病GK大鼠（G），糖尿病GK大鼠SFN（GKS，H）、PM（GKP，I）和SFN+PM（GKSP，J）處理組。面板（L）包含不同動脈組中綠色熒光的量化。（M）不同組大鼠尿8-羥基脫氧鳥苷（8-OHDG）水平。數(shù)據(jù)表示為平均值±SE（n＝12）。*P<0.05，***P<0.001 vs Wistar組；φP<0.05，φφP<0.01，φφφP<0.001 vs GK組。
單用SFN或PM治療8周并沒有顯著改善甘油三酯、膽固醇和FFA水平。已經(jīng)證明，PM可以糾正糖尿病和肥胖大鼠的高脂血癥和腎病，可能是通過干擾各種AGE/晚期脂質(zhì)氧化最終產(chǎn)物（ALE，由脂質(zhì)氧化形成）的活性羰基中間產(chǎn)物。在不同的動物模型中，更高濃度的PM（400 mg/kg/天）具有這種降脂作用。此外，Nrf2通路具有調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝的功能。Nrf2負(fù)性調(diào)節(jié)許多編碼參與脂質(zhì)生物合成、脂肪酸去飽和與脂肪酸轉(zhuǎn)運的酶的基因。相反，0.5 mg/kg的SFN會損害鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的肝功能并加重的膽固醇水平。此外，在我們的實驗條件下，單用SFN治療不會改變脂質(zhì)分布。
SFN+PM治療對總膽固醇和甘油三酯水平?jīng)]有影響，但卻顯著降低了FFA和HbA1c水平。兩種聯(lián)合治療均能改善葡萄糖耐受性，顯著減少葡萄糖曲線下面積。靶向糖基化和抗氧化防御系統(tǒng)的PM和SFN在降低FFA和HbA1c水平方面非常有效。重要的是，SFN和PM治療對胰島素水平?jīng)]有影響，這解釋了在治療糖尿病大鼠中觀察到的高血糖。事實上，在所有GK治療組中，血糖水平明顯高于Wistar大鼠。然而，在這些條件下，sfn+pm的血管保護作用是明顯的，表明正常血糖的完全恢復(fù)不是血管保護的先決條件。
其他研究者先前報道，在非缺陷Nrf2的野生型小鼠中，Nrf2的激活降低了血糖水平，減少了糖尿病相關(guān)腎病。而這項研究中，SFN治療組（GKS）沒有促進(jìn)血糖水平下降。不同的動物模型和實驗條件可以解釋這些差異。
圖5 蘿卜硫素和吡哆胺處理對pVASP和tVASP表達(dá)水平的影響。為了檢測NO-cGMP信號激活，評估主動脈中總血管舒張劑刺激的磷酸蛋白（tVASP）和磷酸化（ser239）VASP（pVASP）的表達(dá)。用SDS-PAGE法測定主動脈裂解物。（A）不同動脈組的主動脈中總血管緊張素（VASP）和pVASP蛋白水平的典型Western blot條帶。（B）pVASP/總VASP比的平均密度測定數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)表示為平均值±SE（n=12）。***P<0.001 vs Wistar組；φP<0.05，φφφP<0.001 vs GK組。
氧化應(yīng)激在內(nèi)皮功能障礙發(fā)病機制中的作用已被充分確證。糖尿病增加血管系統(tǒng)中的活性氧，損害抗氧化防御酶，并降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化物的水平，創(chuàng)造一個氧化應(yīng)激增加的環(huán)境。在血管模型中，Nrf2通路激動劑通過增加抗氧化/親電反應(yīng)元件介導(dǎo)的II相酶和抗氧化酶表達(dá)（包括NAD（P）H:醌氧化還原酶-1、血紅素氧合酶-1和γ-谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞單位）來恢復(fù)氧化還原平衡。在這項研究中，我們提出的證據(jù)表明，SFN和PM治療在體內(nèi)具有抗氧化作用：在糖尿病GK大鼠中，SFN、PM或SFN+PM降低了尿8-OHdG和組織中O2•−陰離子以及硝基酪氨酸的積累量。這種抗氧化作用是已觀察到的內(nèi)皮功能障礙正?；瘷C制的重要因素。因此，其他研究也報道了不同條件下SFN對氧化應(yīng)激的抑制作用。在糖尿病db/db微血管系統(tǒng)中，用SFN靶向Nrf2通路能有效恢復(fù)正常的氧化還原平衡和對抵抗小動脈的肌源性反應(yīng)。此外，通過介導(dǎo)上調(diào)Nrf2活性，SFN下調(diào)高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠主動脈中血管細(xì)胞粘附分子-1的表達(dá)。我們的數(shù)據(jù)支持一個模型，在該模型中，通過一種涉及Nrf2依賴性的抗氧化能力下降的機制，主動脈和腸系膜動脈中的氧化應(yīng)激增加。我們在活體內(nèi)證明，用SFN靶向Nrf2通路可有效恢復(fù)正常的氧化還原平衡，改善糖尿病血管系統(tǒng)中主動脈和腸系膜動脈對乙酰膽堿的內(nèi)皮反應(yīng)。這些有益的影響被PM增強，而PM是一種AGE/ALE和其交聯(lián)形成的抑制劑。
圖6 與非糖尿病Wistar大鼠相比，蘿卜硫素和吡哆胺對GK大鼠主動脈和腸系膜動脈中Nrf2水平的影響。代表性腸系膜切片顯示非糖尿病性Wistar大鼠（A）、糖尿病性GK大鼠（B）和糖尿病性GK大鼠用SFN（GKS，C）、PM（GKP，D）和SFN+PM（GKSP，E）處理后的Nrf2染色。面板（F）包含不同動脈組中綠色熒光的量化。（G）根據(jù)DAPI染色（藍(lán)色）的定義，定位于核區(qū)的Nrf2標(biāo)簽（綠色）的熒光強度被量化，并表示為從多個腸系膜動脈段匯集的Wistar大鼠的對照平均值的百分比。（H）不同動脈組主動脈中總Nrf2（左面板）和核Nrf2蛋白水平的Western blot條帶。主動脈中總Nrf2水平（I）和核Nrf2水平（J）的平均密度測量數(shù)據(jù)，標(biāo)準(zhǔn)化為各自的負(fù)荷控制。數(shù)據(jù)平均值為±SE。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs Wistar組；φP<0.05，φφP<0.01，φφφP<0.001 vs GK組；#P<0.05，###P<0.001 vs GKP組。
圖7 與非糖尿病Wistar大鼠相比，蘿卜硫素和吡哆胺對GK大鼠主動脈和腸系膜動脈AGE水平的影響。有代表性的主動脈切片顯示非糖尿病Wistar大鼠（A）、糖尿病GK大鼠（B）和糖尿病GK大鼠經(jīng)SFN（GKS，C）、PM（GKP，D）和SFN+PM（GKSP，E）處理后的AGE染色。面板（K）包含不同動脈組中紅色熒光的量化。有代表性的腸系膜切片顯示了非糖尿病Wistar大鼠（F）、糖尿病GK大鼠（G）和糖尿病GK大鼠用SFN（GKS，H）、PM（GKP，I）和SFN+PM（GKSP，J）處理后的AGE染色。面板（L）包含不同動脈組中紅色熒光的量化。數(shù)據(jù)平均值為±SE。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs Wistar組；φP<0.05，φφP<0.01，φφφP<0.001 vs GK組；§p<0.05 vs GKS組。
在糖尿病動物中，氧化應(yīng)激與AGE的累積成比例增加，其導(dǎo)致血管并發(fā)癥的發(fā)展。PM已被證明能抑制AGE的形成和脂源性美拉德產(chǎn)物（一種ALE）的形成。它不會直接與葡糖胺重排反應(yīng)的產(chǎn)物相互作用，但會干擾重排后的氧化反應(yīng)。此外，PM還可以捕獲活性羰基化合物，抑制AGE和ALE加合物。PM抑制肥胖大鼠的脂血癥，腎與血管并發(fā)癥的發(fā)生。PM降低氧化應(yīng)激的部分原因可能是抑制糖基化作用，而糖基化作用是一種直接導(dǎo)致自由基產(chǎn)生的過程。
此外，使用SFN、PM或兩者治療均能顯著降低血管氧化應(yīng)激，同時增加NO生物利用度，這可以部分解釋對血管功能的有益影響。AGE直接阻斷血管內(nèi)皮的NO活性并產(chǎn)生活性氧。糖尿病環(huán)境的特點是血管的NO水平較低，其應(yīng)歸于氧化應(yīng)激和AGE水平增加。SFN和PM對于降低氧化應(yīng)激，正?；疦O生物利用度非常有效。可能只有當(dāng)AGE與ALE水平以及交聯(lián)形成被PM降低，同時抗氧化防御酶（SFN作用）增加時，才有可能促成血管系統(tǒng)中更高水平的NO。
SFN對依賴Nrf2基因的表達(dá)的影響已被充分記錄。重要的是，GK大鼠在血管水平上顯示出Nrf2的缺失。類似地，在小鼠糖尿病動脈和人心臟組織中觀察到Nrf2水平降低。此外，先前的研究表明，衰老與血管系統(tǒng)中的Nrf2功能障礙有關(guān)，這可能加劇與年齡相關(guān)的細(xì)胞氧化應(yīng)激，并增加老化血管對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的敏感性。與這些發(fā)現(xiàn)一致，我們還發(fā)現(xiàn)8個月大的糖尿病GK大鼠主動脈和腸系膜動脈中的Nrf2表達(dá)顯著下調(diào)，同時細(xì)胞核功能顯著下降。Nrf2減少的機制尚不清楚，其解釋也超出了當(dāng)前研究的范圍；然而，我們的數(shù)據(jù)表明，在糖尿病的血管系統(tǒng)中發(fā)生Nrf2信號傳導(dǎo)的中斷，它可能導(dǎo)致谷胱甘肽的消耗和其他抗氧化防御機制的減少。此外，以前的研究表明，Nrf2誘導(dǎo)了乙二醛酶1的表達(dá)，該酶可保護機體免受AGE誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)和DNA損傷，并維持細(xì)胞功能。
利用與抑制AGE/ALE水平和交聯(lián)形成相關(guān)的Nrf2激動劑，并描述其有益作用，可為糖尿病及其血管并發(fā)癥中恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)提供一種新的治療策略。據(jù)推測，這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了新的抗氧化分子的發(fā)現(xiàn)和評估，例如Nrf2激動劑和AGE抑制劑，它們可望在早期抑制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機制。
結(jié)論
總之，我們的研究結(jié)果表明，SFN+PM治療內(nèi)皮功能障礙的益處是多因素的。除了抗氧化功能降低氧化應(yīng)激外，Nrf2還積極調(diào)節(jié)NO生物利用度。這些結(jié)果提供了令人信服的實驗證據(jù)，證明SFN可與PM聯(lián)用或不聯(lián)用，改善內(nèi)皮功能障礙和減輕糖尿病引起的血管損傷。在患有長期糖尿病的動物模型中，隨著Nrf2的激活，糖基化降低，內(nèi)皮功能正常化，這突出了靶向不同機制以實現(xiàn)主要有益結(jié)果的重要性。
綜上所述，我們可以設(shè)想未來的策略，不僅包括早期積極治療高血糖癥，還包括同時使用針對AGE形成的活性化合物，以及能夠特異性地針對反應(yīng)性物種或增強我們抗氧化防御系統(tǒng)的化合物。同時激活Nrf2和抑制AGE/ALE水平與交聯(lián)形成可能是一種潛在治療策略。
方法
藥物。PM、苯腎上腺素、乙酰膽堿、N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）和超氧化物歧化酶-聚乙烯乙二醇購于SIGMA（St. Louis, MO, USA）。血管舒張劑激活磷蛋白（VASP）、磷酸化血管舒張劑激活磷蛋白（pVASP），β-肌動蛋白、Nrf2、AGE（克隆，No. 6D12）和硝基酪氨酸分別購于Cell Signaling Technology （Danvers, MA, USA）、Abcam plc（Cambridge, UK）、Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz, CA, USA）、Upstate Biotechnology（Lake placid, NY, USA）與Transgenic Inc（Kobe, Japan）。蘿卜硫素（SFN，L異構(gòu)體）購于LKT laboratories（St. Paul, MN），DHE購于Invitrogen（Barcelona, Spain）。本研究所用的所有其他化合物與試劑為優(yōu)級純。
實驗動物。Wistar和GK大鼠來自我們當(dāng)?shù)氐姆敝橙后w（葡萄牙科英布拉大學(xué)醫(yī)學(xué)院）。將Wistar和GK糖尿病大鼠分為四個實驗組。（1）組（W；GK）用載體（玉米油）維持8周；（2）組用蘿卜硫素（1 mg/kg/天，腹腔內(nèi)）治療8周（WS；GKS）；（3）組用吡哆胺（100 mg/kg/天，如前）治療8周（WP；GKP）；（4）組用蘿卜硫素和吡哆胺治療8周（WSP；GKSP）。這些動物用一種標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)顆粒飼料進(jìn)行飼養(yǎng)，8個月大時使用。一項初步研究（數(shù)據(jù)未顯示）表明，1 mg/kg在代謝和內(nèi)皮功能方面具有更好的效果，并且接近通過食用西蘭花芽苗提取物在人和小鼠體內(nèi)獲得的生理濃度。
所有動物均按照葡萄牙《實驗動物實驗法》（2004年最后修正案）接受護理，該法基于歐盟指令2010/63/EU對動物實驗采用的實驗動物護理原則。實驗方案由科英布拉大學(xué)醫(yī)學(xué)院ORBEA – IBILI批準(zhǔn)。
代謝和氧化應(yīng)激參數(shù)的測定。禁食15小時后，用氯胺酮/氯丙嗪[氯胺酮氯化物（75 mg/kg，im，Parke Davis，Ann Arbor，mi，USA）和氯丙嗪氯化物（2.65 mg/kg，im，lab.vit_ria，Portugal）]麻醉動物并斬首致死。心臟穿刺取血測定血脂。空腹血清脂質(zhì)（總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯）使用商業(yè)可獲得的試劑盒下雨（奧林巴斯-塔格恩·斯塔卡葡萄牙，Olympus-Diagnóstica Portugal, Produtos de Diagnóstico SA, Portugal，葡萄牙）進(jìn)行定量。血漿游離脂肪酸（FFA）水平使用酶分析試劑盒（Roche Applied Science, Portugal）進(jìn)行評估。將大鼠置于代謝籠中24小時并收集尿液。尿8-羥基-2-脫氧鳥苷使用EIA試劑盒（Cayman Chemical, Europe）測量。
對于葡萄糖耐量試驗，大鼠先前禁食過夜，并給予腹腔注射葡萄糖（1.75 g kg-1體重）。在注射葡萄糖后0、30、60和120分鐘，通過葡萄糖氧化酶法從尾靜脈中取樣，使用葡萄糖儀（Glucometer Elite Bayer，Portugal S.A.）和兼容的反應(yīng)測試條測定血糖。用標(biāo)準(zhǔn)計算機程序（GRAPPAD PRISM PCSoftware version 3.0）計算IPGTT曲線的AUC。糖化血紅蛋白（HbA1c）使用A1C NOW+系統(tǒng)測定（Bayer，Portugal S.A.）。
等長張力研究。主動脈被迅速切除，去除結(jié)締組織。主動脈分為兩段（4-mm寬）。將環(huán)段安裝在不銹鋼三角板之間的單個器官室中，填充含氧（95%氧氣，5%二氧化碳）改良Krebs-Henseleit緩沖液（37°C，pH7.4）（成分單位：mM：NaCl 119；KCl 4.7；CaCl2 1.6；MgSO4 1.2；NaHCO3 25；KH2PO4 1.2；葡萄糖 11.0）。在抑制前列腺素合成的實驗中，吲哚美辛的濃度為10μM。主動脈環(huán)的靜息張力為9.8 mN。平衡60分鐘后，所有血管均預(yù)先用苯腎上腺素進(jìn)行收縮。配體刺激受體介導(dǎo)的NO生物利用度通過對乙酰膽堿（Ach，10-9到10-3 M）的濃度依賴性松弛來評估，而硝普鈉（SNP，10-9到10-4 M）被用作非內(nèi)皮依賴性激動劑。對ACh和SNP的舒張反應(yīng)以亞最大苯腎上腺素誘導(dǎo)收縮的舒張百分比表示，如前所述獲得量效曲線。
根據(jù)Mulvani和Halpern的技術(shù)，切除腸系膜上二級動脈段（約200μm的外徑），使其不含脂肪和粘附結(jié)締組織，并安裝在肌電圖上。等長張力由PowerLab數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)（Adinstruments，UK）記錄和采集，并使用Labchart 7數(shù)據(jù)采集和分析軟件（Adinstruments，UK）記錄在計算機上。動脈段在改良的Krebs-Henseleit溶液中平衡30分鐘，保持在37°C，并用5%的二氧化碳進(jìn)行充氣。根據(jù)Mulvani和Halpern的技術(shù)，將每只血管放置在相當(dāng)于每只個體大鼠體內(nèi)動脈血壓的拉伸下。通過暴露于KCl（125 mM）評估組織收縮性；隨后獲得苯腎上腺素（0.1-30 μM）的累積量效曲線。讓組織重新平衡30分鐘。然后使用腸系膜環(huán)研究對以下一種藥物的反應(yīng)：對乙酰膽堿（Ach，10-9到10-6 M）的反應(yīng)（在存在和不存在吲哚美辛（10 μM））或硝普鈉（SNP，10-9到10-3 M）評估舒張；舒張根據(jù)先前的苯腎上腺素反應(yīng)曲線，在使用苯腎上腺素預(yù)施工后，反應(yīng)達(dá)到最大值的50%左右。在使用腸系膜動脈段的第二系列實驗中，使用L-NAME評估了一氧化氮合酶抑制的急性效應(yīng)。如上文所述獲得對乙酰膽堿的反應(yīng)，隨后在L-NAME（300 μM）存在下重復(fù)。對ACh和SNP的舒張反應(yīng)以亞最大苯腎上腺素誘導(dǎo)收縮的舒張百分比表示，并獲得如前所述的濃度-響應(yīng)曲線。
超氧化物檢測。在37°C的PBS中用DHE（2×10−6 M）在避光加濕室中培養(yǎng)30分鐘未固定的、30 μm厚的近端主動脈段。DHE在與氧反應(yīng)后被氧化成溴化乙錠，溴化乙錠與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合，發(fā)出紅色熒光。對于溴化乙錠的檢測，使用熒光顯微鏡（Leica Dmire200，Wetzlar，德國）獲得圖像。用568 nm濾光片檢測熒光。正常組織和糖尿病組織的處理和成像使用相同的設(shè)置平行進(jìn)行。所有制劑的顯微鏡和照相機設(shè)置均保持不變。熒光定量使用IMAGEJ（1.40 g，NIH）。
腸系膜免疫熒光的評估。將腸系膜動脈切片（6μm）用PBS洗滌，固定在冰凍丙酮中10分鐘。隨后在1% Triton X-100且pH值7.4的PBS中透化，用10%羊血清封閉10分鐘，30分鐘后，在含有0.02% BSA的PBS中稀釋一次抗體（PBS/BSA）。添加一級抗體，并在4°C下將切片孵育過夜。孵育后，用PBS/BSA溶液對切片進(jìn)行廣泛清洗。之后，用二級抗體孵育切片，在PBS/BSA中稀釋1小時。再用甘油凝膠Dako安裝介質(zhì)（Dako, Carpinteria, CA, USA），安裝之前清洗蓋片。免疫染色腸系膜切片用Leica-Dmire200熒光顯微鏡觀察。免疫染色腸系膜切片用DAPI復(fù)染，并按上述方法檢查、拍照和定量DHE熒光。
Western blot分析。用冷PBS清洗內(nèi)皮完整血管段，并在緩沖液中冷卻，緩沖液中含有：Tris-HCl 50、Nacl 150、乙二胺四乙酸（EDTA）1、乙二醇四乙酸（EGTA）0.1、NP-40、0.1%、SDS 0.1%和脫氧膽酸0.5%。苯甲基磺酰氟（1 mM）、抑肽酶（10μg ml-1）、亮蛋白（10μg ml-1）和胃蛋白酶抑制劑（10μg ml-1）均購于Sigma Chemicals（St. Louis, MO, USA），作為蛋白酶抑制劑加入。以標(biāo)準(zhǔn)方式對組織進(jìn)行勻漿，然后在14000×g、4°C條件下離心20分鐘。收集上清液并測定總蛋白濃度。將含有40μg蛋白質(zhì)的樣品加載到12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠上，在聚偏氟乙烯膜上運行并電沉積。預(yù)染分子量標(biāo)記蛋白被用作SDS-PAGE的標(biāo)準(zhǔn)。進(jìn)行麗春紅染色，以驗證轉(zhuǎn)移的質(zhì)量，確保蛋白質(zhì)負(fù)載相同。印跡用5%脫脂牛乳在PBS中封閉1h，用抗VASP、pVASP、β-肌動蛋白或Nrf2的一級抗體處理過夜，再用堿性磷酸酶二級抗體孵育1h，用抗VASP磷酸絲氨酸239抗體分析VASP在Ser239（pVASP）的磷酸化狀態(tài)，這是一種血管cGMP依賴性蛋白激酶-1活性的可靠生化標(biāo)志物。血管緊張素的激活由強度比pVASP/tVASP表示。免疫印跡是用ECF免疫印跡檢測系統(tǒng)（Amersham Biosciences）開發(fā)的。
使用Bio-Rad蛋白質(zhì)分析試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。
統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均采用標(biāo)準(zhǔn)計算機程序（graphpad prism PC軟件版本3.0，ANOVA）進(jìn)行分析，并以平均值±SEM表示（n=12，每組個體動物數(shù)）。采用單因素方差分析，隨后進(jìn)行個體比較的Bonferroni事后檢驗，評估顯著性差異。P<0.05被認(rèn)為是顯著的。用單純形算法對劑量響應(yīng)曲線進(jìn)行非線性回歸擬合。舒張反應(yīng)以苯腎上腺素預(yù)收縮的百分比表示。量效曲線的比較采用雙向方差分析對重復(fù)測量進(jìn)行評估，隨后進(jìn)行個體比較的Bonferroni事后檢驗。
在本研究中，我們把吡哆胺（PM）和/或蘿卜硫素（SFN）作為治療干預(yù)措施，用于確定NFE2相關(guān)因子2（Nrf2）的激動劑是否可以同晚期糖基化終產(chǎn)物（AGE）形成抑制劑一起使用，達(dá)到減輕2型糖尿病患者的氧化應(yīng)激和改善其內(nèi)皮功能障礙。Goto Kakizaki（GK）大鼠，一種非肥胖型2型糖尿病動物模型，在8周內(nèi)接受或不接受PM和/或SFN治療，并與年齡匹配的Wistar大鼠進(jìn)行比較。在治療結(jié)束時，評估孤立主動脈和腸系膜動脈中一氧化氮（NO）依賴性和非依賴性的血管舒張。還評估了代謝概況、NO生物利用度和血管氧化應(yīng)激、AGE和Nrf2水平。糖尿病GK大鼠的Nrf2水平顯著降低，同時氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能障礙水平也較高。PM和SFN作為單一療法能夠顯著改善主動脈和腸系膜動脈的內(nèi)皮功能障礙，降低血管氧化損傷、AGE和HbA1c水平。此外，在GK大鼠中已證明，SFN+PM能更有效地降低全身游離脂肪酸水平，使內(nèi)皮功能、NO生物利用度和糖化作用正?；?。Nrf2激動劑可與AGE抑制劑和交聯(lián)形成抑制劑聯(lián)用來治療2型糖尿病內(nèi)皮功能障礙。
2型糖尿病與氧化應(yīng)激水平升高和糖基化改變血管功能有關(guān)，因此被認(rèn)為是心血管疾病發(fā)展的主要危險因素。許多的糖尿病并發(fā)癥都與高血糖和活性氧物種（ROS）生成增加有關(guān)，其導(dǎo)致了內(nèi)皮功能紊亂。對血管舒張劑（如乙酰膽堿）的內(nèi)皮依賴性舒張功能受損是1型和2型糖尿病實驗?zāi)Ｐ椭袑?dǎo)管和阻力動脈的共同特征。我們先前發(fā)現(xiàn)糖尿病GK大鼠的氧化應(yīng)激和糖基化增加，而這種變化導(dǎo)向內(nèi)皮功能障礙。
糖尿病的治療進(jìn)展并不能有效地減少糖尿病相關(guān)的血管并發(fā)癥?？紤]到ROS在內(nèi)皮功能中的關(guān)鍵作用，人們已經(jīng)作出了相當(dāng)大的努力來探索降低血管系統(tǒng)中ROS的治療方法。核因子E2（紅系衍生2）相關(guān)因子-2（Nrf2）是一種轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞對氧化應(yīng)激的保護中起著關(guān)鍵作用。Nrf2被稱為抗氧化劑反應(yīng)的“主調(diào)節(jié)器”。通過Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件途徑激動劑誘導(dǎo)內(nèi)源性抗氧化酶可能是獲得足夠水平的抗氧化劑和減少氧化應(yīng)激的一種有趣方法。膳食中的NRF2激動劑，如十字花科蔬菜中發(fā)現(xiàn)的異硫氰酸鹽蘿卜硫素（SFN），可以增加抗氧化防御，降低血壓，抑制腎臟內(nèi)促炎信號通路，并預(yù)防高血糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞代謝紊亂。在糖尿病模型中，Nrf2的激活降低了野生型小鼠的血糖水平，減少了糖尿病相關(guān)腎病，但在Nrf2缺乏的小鼠中則沒有。因此，Nrf2誘導(dǎo)劑在血管疾病中的治療潛力巨大，特別是與長期2型糖尿病有關(guān)的血管疾病。
表1 8個月大的非糖尿病Wistar大鼠（W）、糖尿病Goto-Kakizaki大鼠（GK）、接受蘿卜硫素處理的GK大鼠（GKS）、接受吡哆胺處理的GK大鼠（GKP）和接受蘿卜硫素與吡哆胺處理的GK大鼠（GKSP）的體重和血脂水平。數(shù)據(jù)表示為平均值±SE（n=12每組動物）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs W大鼠。與GK大鼠相比，φφφP<0.001。§P<0.05 vs GKS大鼠。#P<0.05 vs GKP大鼠。
此外，在糖尿病情況下的晚期糖基化加速導(dǎo)致血管并發(fā)癥。幾位作者已經(jīng)證明，抑制晚期糖基化終產(chǎn)物（AGE）形成可能是改善糖尿病血管并發(fā)癥的一種治療策略。吡哆胺（PM）是維生素B6的一種天然衍生物，已被證明是一種有效的蛋白質(zhì)糖化和脂質(zhì)氧化抑制劑。在體外和體內(nèi)，PM均能抑制AGE的形成，對糖尿病腎病和視網(wǎng)膜病變的治療具有潛在的益處。
蘿卜硫素和吡哆胺有不同的作用機制。因此，我們假設(shè)單獨或聯(lián)合使用SFN、PM對2型糖尿病模型Goto-Kakizaki（GK）大鼠的內(nèi)皮依賴性血管反應(yīng)性、氧化應(yīng)激和代謝參數(shù)具有有益影響。在糖尿病進(jìn)展的同時，對脂質(zhì)分布、氧化應(yīng)激、糖基化和一氧化氮（NO）生物利用度進(jìn)行了評價。此外，還評估了主動脈和腸系膜動脈對乙酰膽堿（ACH）和硝普鈉（SNP）的內(nèi)皮依賴性和非依賴性血管敏感性。與Wistar大鼠相比，8個月大的GK大鼠表現(xiàn)出長期糖尿病表型，導(dǎo)管和阻力動脈內(nèi)皮功能障礙，以及氧化應(yīng)激增加。單用SFN和PM可以改善孤立動脈中的NO依賴性血管舒張。順帶一提，SFN和PM通過一種機制使主動脈和腸系膜動脈的內(nèi)皮功能正?；摍C制包括NO生物利用度的增加，以及氧化應(yīng)激和AGE水平的降低?？傊?，這些研究表明，針對引起內(nèi)皮功能障礙的不同機制，抑制AGE形成（PM）和促進(jìn)抗氧化防御系統(tǒng)（SFN）增強應(yīng)是對抗糖尿病大血管并發(fā)癥的有用工具，因其同時作用于最終導(dǎo)致血管損傷的不同機制。
結(jié)論
動物特征。我們實驗中使用的糖尿病大鼠在研究開始時表現(xiàn)出類似的空腹血糖水平。治療前的GK大鼠血糖（GK6M）明顯高于年齡匹配的非糖尿病大鼠（圖1補充）。GK大鼠的體重明顯低于年齡匹配的Wistar大鼠，不同的治療方法并沒有顯著改變這個參數(shù)（表1）。在腹膜內(nèi)葡萄糖耐量試驗（IPGTT）中，GK大鼠與Wistar大鼠相比表現(xiàn)出明顯的葡萄糖不耐（圖1A）。與Wistar大鼠相比，GK大鼠的空腹血糖、葡萄糖曲線下面積（AUC）、HbA1c、總膽固醇和游離脂肪酸（FFA）升高（圖1B、C、D、表1）。如前所述，GK大鼠表現(xiàn)出正常的非HDL膽固醇和甘油三酯水平（表1）。單用SFN或PM治療并沒有顯著改變糖耐量和脂質(zhì)分布評估（圖1A、C，表1）。同時，PM顯著降低了空腹血糖和HbA1c水平（圖1B、D）。事實上，所有的治療方法都能有效降低GK大鼠的HbA1c水平（圖1D）。此外，使用SFN和PM治療8周可有效降低糖尿病大鼠的血液中FFA濃度（表1），并顯著改善葡萄糖耐受性（圖1A、C）。
NO依賴性血管舒張。8個月大的GK大鼠與年齡匹配的Wistar大鼠相比，苯腎上腺素預(yù)收縮后的主動脈環(huán)響應(yīng)乙酰膽堿（ACh）引起的內(nèi)皮介導(dǎo)血管舒張能力受損（圖2A），但對硝普鈉（SNP）引起的非內(nèi)皮依賴性舒張在這兩個物種中相似（圖3A）。事實上，在糖尿病大鼠中，苯腎上腺素預(yù)收縮主動脈環(huán)對乙酰膽堿引起的內(nèi)皮介導(dǎo)血管最大舒張值降低了49%（圖2A）。在GK大鼠和Wistar大鼠中，用NOS抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）和環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛預(yù)孵化后的動脈環(huán)幾乎完全消除了Ach的松弛作用（圖2補充）。在我們的實驗條件下，其他血管擴張劑的殘余成分約為15%。在主動脈中，沒有觀察到不同組間SNP量效曲線在最大舒張值上的差異（圖3A）。所有GK治療組的最大舒張值顯著改善，對Ach的血管反應(yīng)性有所改善（圖2A，表2）。用SFN、PM或SFN+PM治療可顯著改善糖尿病大鼠主動脈內(nèi)皮依賴性血管舒張（圖2A，表2）。這種血管舒張對吲哚美辛不敏感，并被L-NAME阻斷，表明其機制依賴于內(nèi)源性NO釋放（圖2補充）。此外，在所有GK治療組中觀察到SNP敏感性增加（圖3A，表2）。在腸系膜動脈中，糖尿病大鼠的苯腎上腺素預(yù)收縮后動脈環(huán)響應(yīng)Ach引起的內(nèi)皮介導(dǎo)的最大舒張值降低了36%（圖2B）。此外，糖尿病大鼠響應(yīng)SNP引起的最大舒張值下降了39%（圖3B）。用SFN、PM或SFN+PM治療能夠改善內(nèi)皮依賴性血管擴張（圖2B，表3）。類似地，這種作用對吲哚美辛不敏感，并被L-NAME抑制（圖2補充）。表2和表3總結(jié)了最大舒張值和EC50值的詳細(xì)數(shù)據(jù)。這些結(jié)果表明，單用SFN或PM治療可改善糖尿病GK大鼠主動脈和腸系膜動脈的內(nèi)皮依賴性血管舒張。與此相關(guān)，這些療法能夠使內(nèi)皮介導(dǎo)的舒張正?；?，并提高主動脈和腸系膜動脈的SNP敏感性（圖2、3）。
圖1 與非糖尿病Wistar（W）大鼠相比，8個月大的糖尿病Goto-Kakizaki（GK）大鼠蘿卜硫素和吡哆胺處理的效果，腹腔葡萄糖耐量試驗（IPGTT；A）、空腹血糖（B）、葡萄糖曲線下面積（AUC；C）和糖化血紅蛋白（HbA1c）水平（D）。C）計算IPGTT曲線的AUC，以測量葡萄糖耐量受損的程度。數(shù)據(jù)表示為平均值±SE（n=12）。***P<0.001 vs Wistar組；φP<0.05，φφP<0.01，φφφP<0.001 vs GK組。
血管壁的氧化應(yīng)激。我們確定了SFN、PM或兩者對糖尿病血管系統(tǒng)氧化應(yīng)激的潛在影響。有趣的是，糖尿病導(dǎo)致糖尿病大動脈中的超氧化物生成量增加了3倍（p<0.001；圖4B，K）。與GK大鼠相比，用SFN、PM和SFN+PM治療的糖尿病大鼠主動脈中二氫乙啶（DHE，ROS熒光探針）的密度顯著降低（圖4C、D、E、K）。此外，糖尿病GK大鼠腸系膜動脈中的免疫反應(yīng)性硝基酪氨酸（蛋白質(zhì)氧化生物標(biāo)志物）水平也升高（p<0.001；圖4G，L），并且用SFN、PM或兩者治療后，這些水平顯著降低（圖4H，I，J，L）。因此，所有療法都能顯著降低糖尿病GK大鼠主動脈和腸系膜動脈的血管氧化損傷。相應(yīng)地，GK大鼠尿中8-羥基-2’-脫氧鳥苷（8-OHdG，DNA氧化損傷生物標(biāo)志物）的水平明顯高于年齡匹配的Wistar大鼠（圖4M）。對GK大鼠使用SFN、PM或兩者治療8周后，8-OHdG水平顯著降低（圖4M）。
主動脈中的肺血管緊張素和總血管緊張素。血管舒張劑激活磷蛋白（VASP）在Ser239的磷酸化被證明是生物活性NO和NO-cGMP蛋白激酶G信號通路活性的指標(biāo)。為了確定NO生物利用度，我們測量了主動脈中磷酸化血管舒張劑激活磷蛋白（pVASP）和總VASP。GK大鼠的主動脈pVASP/tVASP比率明顯低于Wistar大鼠（圖5A，B）。在糖尿病GK大鼠（GKS，GKP；GKSP；圖5A，B）中，用SFN、PM或兩者治療可顯著提高pVASP/TVSP比率。在腸系膜動脈中觀察到類似的情況（數(shù)據(jù)未列出）。
主動脈和腸系膜動脈中的Nrf2水平。我們隨后量化了不同組大鼠動脈中的Nrf2水平。用Western blot檢測主動脈中的Nrf2水平，以共聚焦顯微鏡觀察腸系膜動脈中的免疫熒光檢來測Nrf2水平。糖尿病大鼠血管中的Nrf2水平明顯低于主動脈和腸系膜動脈中年齡匹配的Wistar大鼠（圖6I，F(xiàn)）。蘿卜硫素治療組（GKS和GKSP）顯著增加了主動脈和腸系膜動脈中的細(xì)胞核Nrf2水平（圖6J，G）。Nrf2激動劑SFN增加糖尿病GK大鼠Nrf2的核定位，這可能導(dǎo)致抗氧化防御增加，促進(jìn)血管氧化應(yīng)激的減少。在糖尿病GK大鼠的主動脈和腸系膜動脈中，SFN顯著增加了Nrf2的表達(dá)（圖6），這表明它同時促進(jìn)了表達(dá)增加和核易位，與其在其他組織中的作用相一致。
主動脈和腸系膜動脈的AGE水平。接下來，我們量化了不同組大鼠動脈中的AGE水平。主動脈和腸系膜動脈的AGE水平用共聚焦顯微鏡測量。糖尿病大鼠主動脈和腸系膜動脈中的AGE水平明顯高于年齡匹配的Wistar大鼠（分別為圖7B、K、G、L）。GK治療組（GKS、GKP和GKSP）主動脈和腸系膜動脈的血管AGE水平顯著降低（圖7K，L）。值得注意的是，PM治療組（GKP，GKSP）血管壁具有正常的AGE水平。
討論
在目前的研究中，蘿卜硫素、吡哆胺及其聯(lián)用對GK大鼠的糖尿病內(nèi)皮功能障礙表現(xiàn)出明顯的治療潛力。用SFN、PM或兩者聯(lián)合治療GK大鼠可顯著降低主動脈和腸系膜動脈的內(nèi)皮功能障礙。在這些血管中，SFN、PM或SFN+PM治療可延緩包括氧化損傷在內(nèi)的糖尿病內(nèi)皮功能障礙病理特征的出現(xiàn)。此外，這兩種相關(guān)療法都能降低FFA水平，也增加了NO生物利用度，這可以部分解釋2型糖尿病長期模型中內(nèi)皮功能的正?；?br /> GK大鼠為非肥胖2型糖尿病動物模型，具有輕度高血糖、高胰島素血癥和胰島素抵抗。長期糖尿病通常與這些動物的胰腺功能喪失有關(guān)，其特征也類似于人類疾病進(jìn)展中的相關(guān)特征。該模型與人類2型糖尿病共有包括異常血管反應(yīng)性在內(nèi)的多種心血管表型，證明其作為研究糖尿病并發(fā)癥的模型是合適的。
在此，我們發(fā)現(xiàn)8個月大的GK大鼠具有高血糖，顯著增加的總膽固醇和循環(huán)FFA水平的特征。內(nèi)皮功能障礙在腸系膜動脈和主動脈動脈中都很明顯，其伴隨著氧化應(yīng)激和糖基化作用升高、NO生物利用度下降和Nrf2水平降低。
Nrf2抗氧化功能在血管疾病中可能很重要。SFN是一種在西蘭花中發(fā)現(xiàn)的Nrf2激動劑，增加抗氧化反應(yīng)元件相關(guān)轉(zhuǎn)錄控制下的保護酶的表達(dá)，并防止由高血糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞代謝功能障礙。在其它研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合西蘭花芽苗中SFN的生物利用度，測定了該化合物的濃度。我們估計，在人體飲食可行的生理劑量下，SFN對治療內(nèi)皮功能障礙具有潛在的治療益處。另一方面，我們最近檢查了2型糖尿病動物模型的AGE水平，發(fā)現(xiàn)血漿和血管壁的AGE水平都在增加。如PM的化合物可以降低高水平的AGE，和這種方法對內(nèi)皮功能有潛在的有益作用。這兩種療法對大血管疾病的治療效果尚未被研究過。在本文中，我們研究了在血管水平上，有或沒有與PM共同抑制年齡形成的SFN的作用。
圖4 與非糖尿病Wistar（W）大鼠相比，蘿卜硫素和吡哆胺處理對GK大鼠全身和血管氧化應(yīng)激的影響。代表性的DHE染色的主動脈段反映了不同處理（A-E）下的氧氣生成。所有的內(nèi)皮都朝上。在相同的條件下，糖尿病患者GK（B）的熒光明顯高于正常血管（Wistar，A）。注意到GK主動脈內(nèi)皮、內(nèi)膜和介質(zhì)中反射O2·−水平的熒光增強。糖尿病GK大鼠服用SFN（GKS，C）、PM（GKP，D）和SFN+PM（GKSP，E）后，DHE熒光降低。面板（K）包含不同動脈組中熒光溴化乙錠信號的量化。具有代表性的腸系膜切片用硝基酪氨酸染色顯示非糖尿病Wistar大鼠（F），糖尿病GK大鼠（G），糖尿病GK大鼠SFN（GKS，H）、PM（GKP，I）和SFN+PM（GKSP，J）處理組。面板（L）包含不同動脈組中綠色熒光的量化。（M）不同組大鼠尿8-羥基脫氧鳥苷（8-OHDG）水平。數(shù)據(jù)表示為平均值±SE（n＝12）。*P<0.05，***P<0.001 vs Wistar組；φP<0.05，φφP<0.01，φφφP<0.001 vs GK組。
單用SFN或PM治療8周并沒有顯著改善甘油三酯、膽固醇和FFA水平。已經(jīng)證明，PM可以糾正糖尿病和肥胖大鼠的高脂血癥和腎病，可能是通過干擾各種AGE/晚期脂質(zhì)氧化最終產(chǎn)物（ALE，由脂質(zhì)氧化形成）的活性羰基中間產(chǎn)物。在不同的動物模型中，更高濃度的PM（400 mg/kg/天）具有這種降脂作用。此外，Nrf2通路具有調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝的功能。Nrf2負(fù)性調(diào)節(jié)許多編碼參與脂質(zhì)生物合成、脂肪酸去飽和與脂肪酸轉(zhuǎn)運的酶的基因。相反，0.5 mg/kg的SFN會損害鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的肝功能并加重的膽固醇水平。此外，在我們的實驗條件下，單用SFN治療不會改變脂質(zhì)分布。
SFN+PM治療對總膽固醇和甘油三酯水平?jīng)]有影響，但卻顯著降低了FFA和HbA1c水平。兩種聯(lián)合治療均能改善葡萄糖耐受性，顯著減少葡萄糖曲線下面積。靶向糖基化和抗氧化防御系統(tǒng)的PM和SFN在降低FFA和HbA1c水平方面非常有效。重要的是，SFN和PM治療對胰島素水平?jīng)]有影響，這解釋了在治療糖尿病大鼠中觀察到的高血糖。事實上，在所有GK治療組中，血糖水平明顯高于Wistar大鼠。然而，在這些條件下，sfn+pm的血管保護作用是明顯的，表明正常血糖的完全恢復(fù)不是血管保護的先決條件。
其他研究者先前報道，在非缺陷Nrf2的野生型小鼠中，Nrf2的激活降低了血糖水平，減少了糖尿病相關(guān)腎病。而這項研究中，SFN治療組（GKS）沒有促進(jìn)血糖水平下降。不同的動物模型和實驗條件可以解釋這些差異。
氧化應(yīng)激在內(nèi)皮功能障礙發(fā)病機制中的作用已被充分確證。糖尿病增加血管系統(tǒng)中的活性氧，損害抗氧化防御酶，并降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化物的水平，創(chuàng)造一個氧化應(yīng)激增加的環(huán)境。在血管模型中，Nrf2通路激動劑通過增加抗氧化/親電反應(yīng)元件介導(dǎo)的II相酶和抗氧化酶表達(dá)（包括NAD（P）H:醌氧化還原酶-1、血紅素氧合酶-1和γ-谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞單位）來恢復(fù)氧化還原平衡。在這項研究中，我們提出的證據(jù)表明，SFN和PM治療在體內(nèi)具有抗氧化作用：在糖尿病GK大鼠中，SFN、PM或SFN+PM降低了尿8-OHdG和組織中O2•−陰離子以及硝基酪氨酸的積累量。這種抗氧化作用是已觀察到的內(nèi)皮功能障礙正?；瘷C制的重要因素。因此，其他研究也報道了不同條件下SFN對氧化應(yīng)激的抑制作用。在糖尿病db/db微血管系統(tǒng)中，用SFN靶向Nrf2通路能有效恢復(fù)正常的氧化還原平衡和對抵抗小動脈的肌源性反應(yīng)。此外，通過介導(dǎo)上調(diào)Nrf2活性，SFN下調(diào)高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠主動脈中血管細(xì)胞粘附分子-1的表達(dá)。我們的數(shù)據(jù)支持一個模型，在該模型中，通過一種涉及Nrf2依賴性的抗氧化能力下降的機制，主動脈和腸系膜動脈中的氧化應(yīng)激增加。我們在活體內(nèi)證明，用SFN靶向Nrf2通路可有效恢復(fù)正常的氧化還原平衡，改善糖尿病血管系統(tǒng)中主動脈和腸系膜動脈對乙酰膽堿的內(nèi)皮反應(yīng)。這些有益的影響被PM增強，而PM是一種AGE/ALE和其交聯(lián)形成的抑制劑。
在糖尿病動物中，氧化應(yīng)激與AGE的累積成比例增加，其導(dǎo)致血管并發(fā)癥的發(fā)展。PM已被證明能抑制AGE的形成和脂源性美拉德產(chǎn)物（一種ALE）的形成。它不會直接與葡糖胺重排反應(yīng)的產(chǎn)物相互作用，但會干擾重排后的氧化反應(yīng)。此外，PM還可以捕獲活性羰基化合物，抑制AGE和ALE加合物。PM抑制肥胖大鼠的脂血癥，腎與血管并發(fā)癥的發(fā)生。PM降低氧化應(yīng)激的部分原因可能是抑制糖基化作用，而糖基化作用是一種直接導(dǎo)致自由基產(chǎn)生的過程。
此外，使用SFN、PM或兩者治療均能顯著降低血管氧化應(yīng)激，同時增加NO生物利用度，這可以部分解釋對血管功能的有益影響。AGE直接阻斷血管內(nèi)皮的NO活性并產(chǎn)生活性氧。糖尿病環(huán)境的特點是血管的NO水平較低，其應(yīng)歸于氧化應(yīng)激和AGE水平增加。SFN和PM對于降低氧化應(yīng)激，正?；疦O生物利用度非常有效。可能只有當(dāng)AGE與ALE水平以及交聯(lián)形成被PM降低，同時抗氧化防御酶（SFN作用）增加時，才有可能促成血管系統(tǒng)中更高水平的NO。
SFN對依賴Nrf2基因的表達(dá)的影響已被充分記錄。重要的是，GK大鼠在血管水平上顯示出Nrf2的缺失。類似地，在小鼠糖尿病動脈和人心臟組織中觀察到Nrf2水平降低。此外，先前的研究表明，衰老與血管系統(tǒng)中的Nrf2功能障礙有關(guān)，這可能加劇與年齡相關(guān)的細(xì)胞氧化應(yīng)激，并增加老化血管對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的敏感性。與這些發(fā)現(xiàn)一致，我們還發(fā)現(xiàn)8個月大的糖尿病GK大鼠主動脈和腸系膜動脈中的Nrf2表達(dá)顯著下調(diào)，同時細(xì)胞核功能顯著下降。Nrf2減少的機制尚不清楚，其解釋也超出了當(dāng)前研究的范圍；然而，我們的數(shù)據(jù)表明，在糖尿病的血管系統(tǒng)中發(fā)生Nrf2信號傳導(dǎo)的中斷，它可能導(dǎo)致谷胱甘肽的消耗和其他抗氧化防御機制的減少。此外，以前的研究表明，Nrf2誘導(dǎo)了乙二醛酶1的表達(dá)，該酶可保護機體免受AGE誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)和DNA損傷，并維持細(xì)胞功能。
利用與抑制AGE/ALE水平和交聯(lián)形成相關(guān)的Nrf2激動劑，并描述其有益作用，可為糖尿病及其血管并發(fā)癥中恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)提供一種新的治療策略。據(jù)推測，這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了新的抗氧化分子的發(fā)現(xiàn)和評估，例如Nrf2激動劑和AGE抑制劑，它們可望在早期抑制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機制。
結(jié)論
總之，我們的研究結(jié)果表明，SFN+PM治療內(nèi)皮功能障礙的益處是多因素的。除了抗氧化功能降低氧化應(yīng)激外，Nrf2還積極調(diào)節(jié)NO生物利用度。這些結(jié)果提供了令人信服的實驗證據(jù)，證明SFN可與PM聯(lián)用或不聯(lián)用，改善內(nèi)皮功能障礙和減輕糖尿病引起的血管損傷。在患有長期糖尿病的動物模型中，隨著Nrf2的激活，糖基化降低，內(nèi)皮功能正常化，這突出了靶向不同機制以實現(xiàn)主要有益結(jié)果的重要性。
綜上所述，我們可以設(shè)想未來的策略，不僅包括早期積極治療高血糖癥，還包括同時使用針對AGE形成的活性化合物，以及能夠特異性地針對反應(yīng)性物種或增強我們抗氧化防御系統(tǒng)的化合物。同時激活Nrf2和抑制AGE/ALE水平與交聯(lián)形成可能是一種潛在治療策略。
方法
藥物。PM、苯腎上腺素、乙酰膽堿、N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）和超氧化物歧化酶-聚乙烯乙二醇購于SIGMA（St. Louis, MO, USA）。血管舒張劑激活磷蛋白（VASP）、磷酸化血管舒張劑激活磷蛋白（pVASP），β-肌動蛋白、Nrf2、AGE（克隆，No. 6D12）和硝基酪氨酸分別購于Cell Signaling Technology （Danvers, MA, USA）、Abcam plc（Cambridge, UK）、Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz, CA, USA）、Upstate Biotechnology（Lake placid, NY, USA）與Transgenic Inc（Kobe, Japan）。蘿卜硫素（SFN，L異構(gòu)體）購于LKT laboratories（St. Paul, MN），DHE購于Invitrogen（Barcelona, Spain）。本研究所用的所有其他化合物與試劑為優(yōu)級純。
實驗動物。Wistar和GK大鼠來自我們當(dāng)?shù)氐姆敝橙后w（葡萄牙科英布拉大學(xué)醫(yī)學(xué)院）。將Wistar和GK糖尿病大鼠分為四個實驗組。（1）組（W；GK）用載體（玉米油）維持8周；（2）組用蘿卜硫素（1 mg/kg/天，腹腔內(nèi)）治療8周（WS；GKS）；（3）組用吡哆胺（100 mg/kg/天，如前）治療8周（WP；GKP）；（4）組用蘿卜硫素和吡哆胺治療8周（WSP；GKSP）。這些動物用一種標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)顆粒飼料進(jìn)行飼養(yǎng)，8個月大時使用。一項初步研究（數(shù)據(jù)未顯示）表明，1 mg/kg在代謝和內(nèi)皮功能方面具有更好的效果，并且接近通過食用西蘭花芽苗提取物在人和小鼠體內(nèi)獲得的生理濃度。
所有動物均按照葡萄牙《實驗動物實驗法》（2004年最后修正案）接受護理，該法基于歐盟指令2010/63/EU對動物實驗采用的實驗動物護理原則。實驗方案由科英布拉大學(xué)醫(yī)學(xué)院ORBEA – IBILI批準(zhǔn)。
代謝和氧化應(yīng)激參數(shù)的測定。禁食15小時后，用氯胺酮/氯丙嗪[氯胺酮氯化物（75 mg/kg，im，Parke Davis，Ann Arbor，mi，USA）和氯丙嗪氯化物（2.65 mg/kg，im，lab.vit_ria，Portugal）]麻醉動物并斬首致死。心臟穿刺取血測定血脂。空腹血清脂質(zhì)（總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯）使用商業(yè)可獲得的試劑盒下雨（奧林巴斯-塔格恩·斯塔卡葡萄牙，Olympus-Diagnóstica Portugal, Produtos de Diagnóstico SA, Portugal，葡萄牙）進(jìn)行定量。血漿游離脂肪酸（FFA）水平使用酶分析試劑盒（Roche Applied Science, Portugal）進(jìn)行評估。將大鼠置于代謝籠中24小時并收集尿液。尿8-羥基-2-脫氧鳥苷使用EIA試劑盒（Cayman Chemical, Europe）測量。
對于葡萄糖耐量試驗，大鼠先前禁食過夜，并給予腹腔注射葡萄糖（1.75 g kg-1體重）。在注射葡萄糖后0、30、60和120分鐘，通過葡萄糖氧化酶法從尾靜脈中取樣，使用葡萄糖儀（Glucometer Elite Bayer，Portugal S.A.）和兼容的反應(yīng)測試條測定血糖。用標(biāo)準(zhǔn)計算機程序（GRAPPAD PRISM PCSoftware version 3.0）計算IPGTT曲線的AUC。糖化血紅蛋白（HbA1c）使用A1C NOW+系統(tǒng)測定（Bayer，Portugal S.A.）。
等長張力研究。主動脈被迅速切除，去除結(jié)締組織。主動脈分為兩段（4-mm寬）。將環(huán)段安裝在不銹鋼三角板之間的單個器官室中，填充含氧（95%氧氣，5%二氧化碳）改良Krebs-Henseleit緩沖液（37°C，pH7.4）（成分單位：mM：NaCl 119；KCl 4.7；CaCl2 1.6；MgSO4 1.2；NaHCO3 25；KH2PO4 1.2；葡萄糖 11.0）。在抑制前列腺素合成的實驗中，吲哚美辛的濃度為10μM。主動脈環(huán)的靜息張力為9.8 mN。平衡60分鐘后，所有血管均預(yù)先用苯腎上腺素進(jìn)行收縮。配體刺激受體介導(dǎo)的NO生物利用度通過對乙酰膽堿（Ach，10-9到10-3 M）的濃度依賴性松弛來評估，而硝普鈉（SNP，10-9到10-4 M）被用作非內(nèi)皮依賴性激動劑。對ACh和SNP的舒張反應(yīng)以亞最大苯腎上腺素誘導(dǎo)收縮的舒張百分比表示，如前所述獲得量效曲線。
根據(jù)Mulvani和Halpern的技術(shù)，切除腸系膜上二級動脈段（約200μm的外徑），使其不含脂肪和粘附結(jié)締組織，并安裝在肌電圖上。等長張力由PowerLab數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)（Adinstruments，UK）記錄和采集，并使用Labchart 7數(shù)據(jù)采集和分析軟件（Adinstruments，UK）記錄在計算機上。動脈段在改良的Krebs-Henseleit溶液中平衡30分鐘，保持在37°C，并用5%的二氧化碳進(jìn)行充氣。根據(jù)Mulvani和Halpern的技術(shù)，將每只血管放置在相當(dāng)于每只個體大鼠體內(nèi)動脈血壓的拉伸下。通過暴露于KCl（125 mM）評估組織收縮性；隨后獲得苯腎上腺素（0.1-30 μM）的累積量效曲線。讓組織重新平衡30分鐘。然后使用腸系膜環(huán)研究對以下一種藥物的反應(yīng)：對乙酰膽堿（Ach，10-9到10-6 M）的反應(yīng)（在存在和不存在吲哚美辛（10 μM））或硝普鈉（SNP，10-9到10-3 M）評估舒張；舒張根據(jù)先前的苯腎上腺素反應(yīng)曲線，在使用苯腎上腺素預(yù)施工后，反應(yīng)達(dá)到最大值的50%左右。在使用腸系膜動脈段的第二系列實驗中，使用L-NAME評估了一氧化氮合酶抑制的急性效應(yīng)。如上文所述獲得對乙酰膽堿的反應(yīng)，隨后在L-NAME（300 μM）存在下重復(fù)。對ACh和SNP的舒張反應(yīng)以亞最大苯腎上腺素誘導(dǎo)收縮的舒張百分比表示，并獲得如前所述的濃度-響應(yīng)曲線。
超氧化物檢測。在37°C的PBS中用DHE（2×10−6 M）在避光加濕室中培養(yǎng)30分鐘未固定的、30 μm厚的近端主動脈段。DHE在與氧反應(yīng)后被氧化成溴化乙錠，溴化乙錠與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合，發(fā)出紅色熒光。對于溴化乙錠的檢測，使用熒光顯微鏡（Leica Dmire200，Wetzlar，德國）獲得圖像。用568 nm濾光片檢測熒光。正常組織和糖尿病組織的處理和成像使用相同的設(shè)置平行進(jìn)行。所有制劑的顯微鏡和照相機設(shè)置均保持不變。熒光定量使用IMAGEJ（1.40 g，NIH）。
腸系膜免疫熒光的評估。將腸系膜動脈切片（6μm）用PBS洗滌，固定在冰凍丙酮中10分鐘。隨后在1% Triton X-100且pH值7.4的PBS中透化，用10%羊血清封閉10分鐘，30分鐘后，在含有0.02% BSA的PBS中稀釋一次抗體（PBS/BSA）。添加一級抗體，并在4°C下將切片孵育過夜。孵育后，用PBS/BSA溶液對切片進(jìn)行廣泛清洗。之后，用二級抗體孵育切片，在PBS/BSA中稀釋1小時。再用甘油凝膠Dako安裝介質(zhì)（Dako, Carpinteria, CA, USA），安裝之前清洗蓋片。免疫染色腸系膜切片用Leica-Dmire200熒光顯微鏡觀察。免疫染色腸系膜切片用DAPI復(fù)染，并按上述方法檢查、拍照和定量DHE熒光。
Western blot分析。用冷PBS清洗內(nèi)皮完整血管段，并在緩沖液中冷卻，緩沖液中含有：Tris-HCl 50、Nacl 150、乙二胺四乙酸（EDTA）1、乙二醇四乙酸（EGTA）0.1、NP-40、0.1%、SDS 0.1%和脫氧膽酸0.5%。苯甲基磺酰氟（1 mM）、抑肽酶（10μg ml-1）、亮蛋白（10μg ml-1）和胃蛋白酶抑制劑（10μg ml-1）均購于Sigma Chemicals（St. Louis, MO, USA），作為蛋白酶抑制劑加入。以標(biāo)準(zhǔn)方式對組織進(jìn)行勻漿，然后在14000×g、4°C條件下離心20分鐘。收集上清液并測定總蛋白濃度。將含有40μg蛋白質(zhì)的樣品加載到12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠上，在聚偏氟乙烯膜上運行并電沉積。預(yù)染分子量標(biāo)記蛋白被用作SDS-PAGE的標(biāo)準(zhǔn)。進(jìn)行麗春紅染色，以驗證轉(zhuǎn)移的質(zhì)量，確保蛋白質(zhì)負(fù)載相同。印跡用5%脫脂牛乳在PBS中封閉1h，用抗VASP、pVASP、β-肌動蛋白或Nrf2的一級抗體處理過夜，再用堿性磷酸酶二級抗體孵育1h，用抗VASP磷酸絲氨酸239抗體分析VASP在Ser239（pVASP）的磷酸化狀態(tài)，這是一種血管cGMP依賴性蛋白激酶-1活性的可靠生化標(biāo)志物。血管緊張素的激活由強度比pVASP/tVASP表示。免疫印跡是用ECF免疫印跡檢測系統(tǒng)（Amersham Biosciences）開發(fā)的。
使用Bio-Rad蛋白質(zhì)分析試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。
統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均采用標(biāo)準(zhǔn)計算機程序（graphpad prism PC軟件版本3.0，ANOVA）進(jìn)行分析，并以平均值±SEM表示（n=12，每組個體動物數(shù)）。采用單因素方差分析，隨后進(jìn)行個體比較的Bonferroni事后檢驗，評估顯著性差異。P<0.05被認(rèn)為是顯著的。用單純形算法對劑量響應(yīng)曲線進(jìn)行非線性回歸擬合。舒張反應(yīng)以苯腎上腺素預(yù)收縮的百分比表示。量效曲線的比較采用雙向方差分析對重復(fù)測量進(jìn)行評估，隨后進(jìn)行個體比較的Bonferroni事后檢驗。
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