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阿爾茨海默病治療的新靶點(diǎn)：Nrf2通路與自噬之間的串?dāng)_
發(fā)表于：2021-12-14 作者：admin 來(lái)源：本站 點(diǎn)擊量：16520
原文：Zhang W , Feng C , Jiang H . Novel Target for Treating Alzheimer's Diseases: Crosstalk between the Nrf2 Pathway and Autophagy[J]. Ageing Research Reviews, 2020, 65(1):101207.
翻譯：
亮點(diǎn)：
• p62連接Nrf2通路和自噬以維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。
• Nrf2的激活和自噬有利于AD治療。
• p62-Keap1-Nrf2軸是治療AD的新型潛在機(jī)制。
• 激活p62-Keap1-Nrf2軸的天然化合物是治療AD的有效藥物。
摘要：
在哺乳動(dòng)物中，Keap1-Nrf2-ARE途徑（以下簡(jiǎn)稱“ Nrf2途徑”）和自噬是主要的細(xì)胞內(nèi)防御系統(tǒng)，可對(duì)抗氧化損傷并維持體內(nèi)平衡。p62 / SQSTM1是一種泛素結(jié)合的自噬受體蛋白，它連接Nrf2途徑和自噬。p62的磷酸化顯著增強(qiáng)了其對(duì)Keap1的親和力，從而誘導(dǎo)Keap1釋放Nrf2，而p62-Keap1異二聚體募集了LC3并介導(dǎo)了Keap1在選擇性自噬途徑中的永久降解。最終，Nrf2積累在細(xì)胞質(zhì)中，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中以激活下游編碼抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。由于Nrf2也上調(diào)了p62基因的表達(dá)，因此創(chuàng)建了p62-Keap1-Nrf2正反饋環(huán)，該環(huán)進(jìn)一步增強(qiáng)了對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。研究表明，p62激活的非經(jīng)典Nrf2途徑是神經(jīng)變性疾病的重要標(biāo)志。p62-Keap1-Nrf2正反饋回路和Nrf2通路參與消除AD誘導(dǎo)的ROS和蛋白質(zhì)聚集。因此，維持p62Keap1-Nrf2正反饋環(huán)路（是Nrf2途徑與自噬之間的橋梁）的體內(nèi)平衡可能是治療AD的潛在目標(biāo)。
關(guān)鍵詞：Nrf2通路、自噬、氧化應(yīng)激、p62-Keap1-Nrf2正反饋回路、阿爾茨海默病
1. 前言
活性氧(ROS)是正常有氧代謝的副產(chǎn)物，在多種危險(xiǎn)因素中產(chǎn)生，如環(huán)境應(yīng)激、衰老和疾病。高水平的ROS破壞DNA結(jié)構(gòu)和膜分布，改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡。氧化應(yīng)激反應(yīng)清除體內(nèi)過(guò)多的ROS，維持體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)(Yi et al., 2020; Xia et al., 2020)。核因子、紅細(xì)胞來(lái)源因子2相關(guān)因子(Nrf2)是抗氧化防御的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，與Kelch like ech相關(guān)蛋白1 (Keap1)相互作用。在氧化應(yīng)激條件下,由于過(guò)多的活性氧產(chǎn)量,Nrf2 Keap1分離,進(jìn)入細(xì)胞核,它結(jié)合抗氧化反應(yīng)的元素(ARE)觸發(fā)下游抗氧化酶的表達(dá),如血紅素加氧酶1 (HO1)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和NAD (P) H醌脫氫酶1 (NQO1)。
自噬在真核細(xì)胞中廣泛存在，是一種自我修復(fù)的生物過(guò)程，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝和抗氧化應(yīng)激。自噬負(fù)責(zé)清除長(zhǎng)壽命或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、脂滴和受損的細(xì)胞器，以保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)(Liu et al., 2020)。自噬是一種溶酶體依賴的自我降解途徑。根據(jù)底物運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行降解的方式，自噬途徑通常分為三種不同類型，這三種類型分別是微自噬、伴侶介導(dǎo)的自噬(CMA，只發(fā)生在哺乳動(dòng)物)和巨自噬(Suzuki et al., 2017)。在微自噬過(guò)程中，底物被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w中，并被小的溶酶體膜的內(nèi)陷所隔離，這些內(nèi)陷被擠壓到內(nèi)腔中(Li and Hochstrasser, 2020)。在CMA中，五肽基序(KFERQ)暴露的錯(cuò)誤折疊蛋白被熱休克70 kDa蛋白8 (HSPA8/HSC70)識(shí)別，進(jìn)而與溶酶體相關(guān)膜蛋白2A (LAMP2A)結(jié)合。這些蛋白在溶酶體腔內(nèi)展開(kāi)和降解(Dou et al., 2020)。自噬最典型的形式是巨自噬(以下簡(jiǎn)稱自噬)。自噬的特點(diǎn)是胞質(zhì)成分包裹在稱為自噬小體的雙層膜結(jié)構(gòu)中。然后，自噬體與溶酶體膜融合并被水解酶降解。在營(yíng)養(yǎng)缺乏的情況下，該途徑被激活以提供氨基酸和ATP (Yang et al., 2019)。
p62轉(zhuǎn)錄被氧化應(yīng)激、代謝紊亂、疾病和自噬受阻激活，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中大量p62聚集。p62的聚集物通過(guò)與Nrf2抑制蛋白Keap1直接相互作用，維持Nrf2的慢性激活，并且p62介導(dǎo)Keap1在選擇性自噬途徑中的永久降解(Sanchez-Martin and Komatsu, 2018)。因此，Nrf2信號(hào)通路被激活，導(dǎo)致編碼抗氧化酶的基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)(Deng et al., 2020)。此外，核內(nèi)Nrf2促進(jìn)p62基因的過(guò)表達(dá)，形成p62- keap1 -Nrf2正反饋軸，導(dǎo)致Nrf2的持續(xù)激活。與經(jīng)典途徑相比，p62介導(dǎo)的選擇性自噬調(diào)節(jié)Nrf2信號(hào)通路屬于非經(jīng)典機(jī)制。越來(lái)越多的研究表明，p62-Keap1-Nrf2通路的失調(diào)與神經(jīng)退行性疾病的治療有關(guān)(Shah et al., 2018)。因此，本綜述將闡述Nrf2通路、自噬及其串?dāng)_在AD治療中的作用。
2. Nrf2 通路
2.1 Keap1的基本結(jié)構(gòu)
Keap1的分子量為66 kDa，由624個(gè)氨基酸組成。它是Cullin3 (Cul3)-E3泛素連接酶復(fù)合物的底物蛋白，是一種負(fù)向調(diào)節(jié)Nrf2活性的胞質(zhì)蛋白(Davies et al., 2016)。從結(jié)構(gòu)上看，Keap1由5個(gè)功能區(qū)組成。第一個(gè)區(qū)域是N端區(qū)域(NTR)。第二個(gè)區(qū)域是間質(zhì)區(qū)(IVR)，其中含有大量的半胱氨酸殘基。第三個(gè)區(qū)域是brac -a-brac (BTB)區(qū)域，包括broad complex、tramtrack和brac，其中包括一個(gè)重要的應(yīng)力敏感位點(diǎn)半胱氨酸151 (Cys151)。后兩個(gè)區(qū)域是雙甘氨酸重復(fù)或Keleh重復(fù)(DGR)區(qū)域和C末端區(qū)域(CTR) (Dinkovakostova et al., 2017; Deshmukh et al., 2017)。在這些區(qū)域中，BTB、IVR和Keleh/DGR域是Keap1的重要功能域。BTB結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中一個(gè)進(jìn)化保守的序列。這個(gè)結(jié)構(gòu)域可以與另一個(gè)Keap1分子的BTB區(qū)域結(jié)合，形成一個(gè)同分二聚體，然后與Nrf2結(jié)合。該區(qū)域還可以與Cul3結(jié)合形成E3 Ub連接酶復(fù)合物，導(dǎo)致泛素介導(dǎo)的Nrf2降解(Kansanen et al., 2012; Tao et al., 2017)。在BTB結(jié)構(gòu)域，當(dāng)半胱氨酸殘基的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時(shí)，Nrf2蛋白的泛素化和降解將受到抑制。這一過(guò)程誘導(dǎo)Nrf2與Keap1分離并與ARE結(jié)合以激活編碼抗氧化酶的基因轉(zhuǎn)錄。IVR區(qū)域富含半胱氨酸殘基，對(duì)氧化應(yīng)激敏感，也與Nrf2的穩(wěn)定性有關(guān)。在正常生理?xiàng)l件下，IVR區(qū)域參與泛素介導(dǎo)的Nrf2降解。值得一提的是，Cys273和Cys288在抑制Nrf2活性方面發(fā)揮了重要作用。當(dāng)機(jī)體被親電體和ROS激活時(shí)，IVR結(jié)構(gòu)域發(fā)生轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致Nrf2和Keap1相互分離(Magesh et al., 2012)。DGR結(jié)構(gòu)域(包括6個(gè)Kelch重復(fù))和CTR區(qū)域統(tǒng)稱為DC結(jié)構(gòu)域，是Keap1與細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。Keap1同型二聚體中的DGR結(jié)構(gòu)域與Nrf2中Neh2結(jié)構(gòu)域的DLG和ETGE氨基酸基序相互作用，對(duì)Nrf2活性產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用。在外源性或內(nèi)源性刺激下，通過(guò)半胱氨酸失活誘導(dǎo)Keap1 DGR區(qū)域構(gòu)象變化，誘導(dǎo)Keap1-Nrf2蛋白復(fù)合物解離，釋放Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核。Keap1的基本結(jié)構(gòu)如圖1a所示。
2.2 Nrf2的基本結(jié)構(gòu)
Nrf2分子量為100kda，由624個(gè)氨基酸組成。Nrf2屬于堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper, bZIP)轉(zhuǎn)錄因子家族，其成員保持cap-n-collar (CNC)結(jié)構(gòu)，而人類Nfe2l2位于2q31上(Tavakkoli et al., 2019; Bottino-Rojas et al., 2018)。根據(jù)其生理功能，Nrf2可分為7個(gè)高度保守的ECH同源結(jié)構(gòu)域(Nrf2- ECH同源)，包括Neh1到Neh7 (ECH，與雞Nrf2具有CNC同源性的紅血球來(lái)源蛋白)。亮氨酸CNC-bZIP區(qū)域位于Neh1結(jié)構(gòu)域，可與細(xì)胞核中的一種小的肌肉筋膜性纖維肉瘤(Maf)蛋白(即脊椎動(dòng)物中的MafF、MafG或MafK)結(jié)合，并有助于Nrf2與DNA中的ARE結(jié)合。隨后，抗氧化酶、Ub酶、II期解毒酶和蛋白酶體的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，以抵御細(xì)胞中的氧化應(yīng)激(Karan et al., 2020; Shen et al., 2019)。Neh2結(jié)構(gòu)域是一個(gè)由16個(gè)氨基酸組成的短肽，其氨基酸序列在69~84之間，位于Nrf2的N端。Nrf2的Neh2結(jié)構(gòu)域包含分別與Keap1具有高親和力和低親和力的ETGE和DLG基序;該區(qū)域介導(dǎo)Nrf2的降解并負(fù)調(diào)控Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性(Tian et al., 2018)。Nrf2 C -末端的Neh3區(qū)域是一個(gè)可以結(jié)合CHD6并激活A(yù)RE的重要功能區(qū)域(Zhang et al., 2014)。Neh4和Neh5域可以結(jié)合激活cAMP反應(yīng)元素結(jié)合蛋白(CREB)協(xié)助Nrf2核轉(zhuǎn)運(yùn)和以Nrf2-Maf的形式綁定到ARE (Krajka Ku?niak et al ., 2016)。Neh6結(jié)構(gòu)域具有大量的絲氨酸殘基(Chen et al., 2020)，對(duì)Nrf2轉(zhuǎn)錄有負(fù)向影響，且不依賴于Keap1 (Chowdhry et al., 2013)，該結(jié)構(gòu)域主要參與Nrf2的降解。其調(diào)控機(jī)制是DSGIS和DSAPGS的氨基酸基序可通過(guò)β-轉(zhuǎn)介含重復(fù)蛋白(β-TrCP)識(shí)別，并可誘導(dǎo)Skp1-Cul1-Rbx1/Roc1-β-TrCP Ub連接酶復(fù)合物調(diào)控Nrf2泛素化介導(dǎo)的降解(Cuadrado, 2015)。Neh7結(jié)構(gòu)域識(shí)別視黃素X受體(RXR) (Li et al., 2017)。此外，Nrf2的第40個(gè)氨基酸是一個(gè)磷酸化位點(diǎn)，該位點(diǎn)的磷酸化導(dǎo)致Nrf2從Keap1中解離。Nrf2的基本結(jié)構(gòu)如圖1b所示。
2.3 ARE的基本結(jié)構(gòu)
ARE位于一些細(xì)胞保護(hù)基因(抗氧化和自噬相關(guān)基因)啟動(dòng)子區(qū)域上游5'端，屬于特定的DNA啟動(dòng)子聯(lián)合序列(Jeddi et al., 2017)。ARE被定義為順式作用的DNA增強(qiáng)因子，負(fù)責(zé)觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，以誘導(dǎo)II期解毒酶和抗氧化酶的表達(dá)。ARE廣泛表達(dá)于生物體中，其功能是減輕細(xì)胞或組織的各種損傷，維持體內(nèi)平衡。雖然在不同的細(xì)胞中ARE略有不同，但共同的核苷酸序列為5'- (G/A) TGA (G/C) XXX GC (G/A) -3' (x代表任何核苷酸)。ARE的基本結(jié)構(gòu)如圖1c所示。
2.4 Nrf2信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制
在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，細(xì)胞獲得了抵抗外部毒素和內(nèi)部代謝毒素的能力。最重要的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)(Erukainure et al., 2020)[29]。Keap1-Nrf2- ARE通路是激活Nrf2的典型調(diào)控通路，Nrf2的活性主要由Keap1調(diào)控。在基礎(chǔ)條件下，Keap1的BTB結(jié)構(gòu)域與Cul3 E3 Ub連接酶復(fù)合物結(jié)合，兩個(gè)Keap1分子通過(guò)BTB區(qū)域形成一個(gè)同源二聚體。Keap1-Keap1復(fù)合物通過(guò)Keap1的DGR域與Nrf2的ETGE和DLG基序以1:1的比例直接結(jié)合到Nrf2上(Raghunath et al., 2019)。Nrf2 Neh6域的DSGIS和DSAPGS氨基酸基序與E3 Ub連接酶結(jié)合,然后, Ub-蛋白酶體上得Ub轉(zhuǎn)移到Nrf2ETGE、DLG基序之間的賴氨酸殘基誘導(dǎo)泛素介導(dǎo)的Nrf2降解，因此保持適當(dāng)?shù)臐舛萅rf2(Lee and Ryu, 2017)。
在氧化應(yīng)激條件下，線粒體產(chǎn)生大量的高活性分子，如ROS (Chen et al., 2020);當(dāng)ROS含量超過(guò)細(xì)胞清除能力時(shí)，氧化還原系統(tǒng)出現(xiàn)失衡，導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生氧化損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、組織或器官損傷(Liu et al., 2017; Valavanidis et al., 2013)。因此Nrf2通路被顯著激活，具體機(jī)制如下。一方面，Keap1 IVR區(qū)Cys273和Cys288的巰基被氧化形成二硫鍵(Magesh et al., 2012)，導(dǎo)致空間構(gòu)象的改變。然后，具有較強(qiáng)結(jié)合能力的高親和力ETGE 基序仍然能夠與Keap1緊密結(jié)合，而較弱、低親和力的DLG 基序與Keap1分離。Nrf2的空間定位發(fā)生改變，不能被泛素蛋白酶體降解。另一方面，Keap1 BTB結(jié)構(gòu)域的Cys151被修飾，產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，導(dǎo)致Keap1和Cul3解離(Wang et al., 2020)。這破壞了keap1-cul3 E3 泛素連接酶的活性，并抑制了泛素介導(dǎo)的Nrf2降解。當(dāng)Keap1-Keap1-Nrf2的數(shù)量達(dá)到飽和時(shí)，Keap1同型二聚體在細(xì)胞中不能再生，新生成的Nrf2由于自身的保護(hù)，不再與Keap1結(jié)合。Nrf2遷移到細(xì)胞核并與小Maf蛋白結(jié)合。然后，Nrf2-Maf與ARE結(jié)合，增加抗氧化蛋白和II期解毒酶的轉(zhuǎn)錄激活(Otsuki and Yamamoto, 2019)。當(dāng)氧化還原平衡恢復(fù)后，Nrf2從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)，并通過(guò)泛素化降解(Pandey et al., 2017)。Nrf2通路的具體調(diào)控機(jī)制如圖2所示。
3. 自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制
從機(jī)制上看，自噬主要分為四個(gè)階段，即自噬的啟動(dòng)和誘導(dǎo)、自噬體的擴(kuò)展和形成、自噬體與溶酶體融合和降解以及降解產(chǎn)物的循環(huán)利用(Carlsson and Simonsen, 2015)。在營(yíng)養(yǎng)充足的條件下，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是自噬的重要調(diào)節(jié)因子，其作用是抑制自噬。mTOR存在于細(xì)胞內(nèi)的兩個(gè)復(fù)合物中;這些復(fù)合物是mTOR復(fù)合物1 (mTORC1)和mTOR復(fù)合物2 (mTORC2)。mTORC1復(fù)合物由mTOR、raptor和富含脯氨酸的Akt底物(PRAS40)組成，raptor是mTORC1激活的重要因素。此外，mTOR、rictor、哺乳動(dòng)物應(yīng)激激活的MAP激酶相互作用蛋白(mSIN1)以及與rictor 1和2觀察到的蛋白形成mTORC2復(fù)合物。unc -51樣激酶1 (ULK1)是自噬核心機(jī)制中最上游的激酶，ULK1的磷酸化是自噬激活的重要決定因素。AMP活化蛋白激酶(AMPK)和mTORC1可以直接調(diào)節(jié)ULK1 (Atg1 homologs)的磷酸化，這些蛋白是自噬的重要調(diào)節(jié)蛋白。AMPK正調(diào)控自噬，mTORC1通過(guò)與ULK1結(jié)合抑制ULK1復(fù)合物的磷酸化，從而抑制自噬(Noda, 2017)。
3.1自噬的啟動(dòng)和誘導(dǎo)
正常情況下，自噬被mTORC1抑制，Beclin1與Beclin2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)上形成復(fù)合物。在缺乏營(yíng)養(yǎng)或生長(zhǎng)因子的條件下，自噬被認(rèn)為是非選擇性的，并集中于增加任何胞質(zhì)蛋白和其他大分子的降解，以提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在應(yīng)激條件下，自噬被認(rèn)為是選擇性的，有目的地識(shí)別底物并將其緊密地結(jié)合到新出現(xiàn)的自噬體膜上。相關(guān)機(jī)制如下。mTORC1失活后，由ULK1、ULK2、Atg13、Atg101和局灶粘附激酶家族相互作用蛋白(FIP200) (Neufeld, 2020)組成的ULK1復(fù)合物被AMPK激活后轉(zhuǎn)運(yùn)到ER (Chen et al, 2020)。磷酸化的ULK1復(fù)合物調(diào)控JNK1酶誘導(dǎo)Beclin2的磷酸化，從而改變Beclin2的空間構(gòu)像，將Beclin1釋放到細(xì)胞質(zhì)中(Xue et al., 2015)。Beclin1對(duì)應(yīng)激高度敏感(Kiruthiga et al., 2020)，并與III類磷脂酰肌醇3激酶(IIIPI3K/PIK3C3;酵母中的Vps34)， Atg14L(也稱為BARKOR;酵母中的Atg14), p150(又稱PIK3R4;酵母菌Vps15)和AMBRA1。PI3K (PI3P)的磷酸化參與了自噬的啟動(dòng)(Nascimbeni et al., 2017)。部分PI3P復(fù)合物征募雙FYVE-containing protein 1 (DECP1)，被ER包裹以增強(qiáng)膜的彎曲度，并形成一個(gè)收集自噬相關(guān)蛋白的平臺(tái)。PI3P與WD重復(fù)域磷酸肌醇肽相互作用的另一部分(WIPI, Atg18同源物)在胞漿-液泡(Cvt)通路中發(fā)揮重要作用。這個(gè)階段是自噬前體膜的形成(Cao et al., 2019;Nakatogawa, 2020)。
3.2自噬體的延伸和形成
自噬前體的雙層膜被不斷拉長(zhǎng)以形成自噬體。在延長(zhǎng)階段需要兩個(gè)Atg接合系統(tǒng)被ub -蛋白酶體修飾。一個(gè)系統(tǒng)是Atg12-Atg5-Atg16L共軛系統(tǒng)，錨定自噬體的外膜，另一個(gè)系統(tǒng)是Atg8/LC3共軛系統(tǒng)，同時(shí)連接內(nèi)膜和外膜。Atg12-Atg5-Atg16L復(fù)合物是自噬體形成所必需的。自噬激活后，ub樣蛋白Atg12被e1樣ub激活酶和e2樣ub結(jié)合酶誘導(dǎo)，通過(guò)Atg7和Atg10作用與Atg5結(jié)合。Atg16的低聚物與Atg12-Atg5的共軛物結(jié)合，形成位于外膜的Atg12-Atg5- atg16l復(fù)合物(Liet al., 2020)。在非自噬條件下，LC3(在酵母中也被稱為Atg8同源蛋白)以proLC3的非活性形式存在。自噬激活后，LC3通過(guò)Atg4、Atg7、Atg3的順序作用轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3I。然后Atg12-Atg5-Atg16L復(fù)合物介導(dǎo)LC3I與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合，形成具有膜結(jié)合能力的活性蛋白LC3II。LC3II與p62的LIR結(jié)構(gòu)域相互作用，影響擴(kuò)張吞噬團(tuán)的曲率和自噬前體的形成。自噬前體膜通過(guò)誘導(dǎo)LC3II不斷延伸形成囊狀自噬體，嵌入雙層膜表面(Noda and Inagaki, 2015)。
3.3自噬體與溶酶體的融合和產(chǎn)物降解
自噬體與溶酶體的融合是通過(guò)兩種機(jī)制:一個(gè)機(jī)制是直接的自噬體與溶酶體融合形成自吞噬泡,和其他機(jī)制的結(jié)合與成熟的核內(nèi)體自噬體形成自噬核內(nèi)體,后來(lái)搬到溶酶體與溶酶體融合。細(xì)胞核周圍的微管組織中心(MTOC)含有大量的溶酶體。在壓力作用下，膜附LC3-II蛋白在肌動(dòng)蛋白復(fù)合物的作用下移動(dòng)到MTOC附近。同時(shí)，溶酶體向MTOC移動(dòng)，加速了相互融合的效率。在自噬溶酶體形成初期，ATP為溶酶體膜上的質(zhì)子泵提供能量，增加溶酶體主動(dòng)攝取H+。陽(yáng)離子和陰離子泵可以維持溶酶體中的離子電流平衡(如Ca2+、K+和Cl-)。當(dāng)內(nèi)溶酶體的pH值在4.5 ~ 5.0時(shí)，水解酶被激活，困在自噬體內(nèi)的LC3II蛋白與底物一起最終被降解。自噬體外膜上LC3-II被Atg4降解回收?；诙嗵堑哪さ鞍?如LAMP1和LAMP2)嵌入溶酶體膜表面，可以防止溶酶體自身降解。自噬溶酶體融合后，水解酶降解底物，包括脂肪酸和氨基酸在內(nèi)的水解物參與細(xì)胞內(nèi)循環(huán)，提供能量(Zhao et al., 2020)。具體流程如圖3所示。
4. 細(xì)胞中的p62-Keap1-Nrf2軸
4.1 p62的基本結(jié)構(gòu)
p62，又稱SQSTM1，是一種與ub結(jié)合的自噬受體，分子量為62 kDa。p62主要位于細(xì)胞質(zhì)中，可在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間轉(zhuǎn)運(yùn)。p62含有440個(gè)氨基酸,由9功能域:phox bem1域(PB1), ZZ-type鋅指域(ZZ) TRAF6綁定域(TB),核本地化信號(hào)(NLS),核出口信號(hào)(NES), PEST域,LC3交互領(lǐng)域(LIR), Keap1相互作用域(KIR)和C末端 Ub相關(guān)(UBA)域(Lin et al., 2013)。p62通過(guò)PB1結(jié)構(gòu)域的selfoligomerization形成聚合體，該結(jié)構(gòu)域還與PKC、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5 (MEK5)和鄰近的BRCA1基因1蛋白(NBR1)相互作用，形成異源二聚體。c端UBA結(jié)構(gòu)域，對(duì)Ub具有高親和力的高度保守序列(Katsuragi et al., 2015; Denk et al., 2019)，對(duì)于隔離轉(zhuǎn)運(yùn)到自噬體中的泛素化底物至關(guān)重要。此外，UBA結(jié)構(gòu)域的S403和S407可被靶向形成Ub鏈48K的蛋白聚合物(Zhang et al., 2019)，并被由兩個(gè)亞基組成的26S蛋白酶體識(shí)別，這兩個(gè)亞基是一個(gè)20S蛋白酶體和一個(gè)19S調(diào)節(jié)粒子。19S粒子識(shí)別泛素化的p62蛋白，并通過(guò)狹窄的孔將其轉(zhuǎn)移至20S蛋白酶體，20S蛋白酶體將底物消化為包含2-24個(gè)氨基酸的肽，并為細(xì)胞再利用提供必要的材料(Jakobi et al., 2020; Cohen-Kaplan et al., 2017)。ZZ域與受體相互作用蛋白1 (RIP1)調(diào)節(jié)腫瘤壞死通路和NF-κB信號(hào)(Yan et al ., 2017)。TB結(jié)構(gòu)域結(jié)合TRAF6催化賴氨酸(K)殘基位點(diǎn)(63位)多聚泛素鏈的形成(Kim et al., 2019)。ZZ和TB區(qū)域之間的未知區(qū)域與raptor相互作用，激活雷帕霉素復(fù)合物1的機(jī)制靶點(diǎn)。NLS和NES結(jié)構(gòu)域分別是核定位信號(hào)和核輸出信號(hào)，NLS2的磷酸化在促進(jìn)p62在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間的轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮了重要作用(Pankiv et al., 2010)。阻止p62轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)會(huì)導(dǎo)致泛素化蛋白聚集物在細(xì)胞核內(nèi)積聚，促進(jìn)p62的核易位。研究表明，p62定位于細(xì)胞核中泛素化蛋白聚集物上，提示p62可能被核泛素化蛋白聚集物降解(Wang et al., 2019; Kleine et al., 2012)。PEST結(jié)構(gòu)域包括脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)，也稱為PEST序列。在真核細(xì)胞中，PEST序列被認(rèn)為是直接與泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)相互作用的靶點(diǎn)，并且PEST的磷酸化與蛋白質(zhì)的快速降解和更新有關(guān)。但是，PEST序列不是p62的特征域;在一些代謝酶、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白中也發(fā)現(xiàn)了它(Schnupf et al., 2006)。LIR結(jié)構(gòu)域與LC3結(jié)合，在自噬體的形成和降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Islam et al., 2018)。DPSTGE基序(氨基酸位置349-354)(Deng et al., 2019; Sánchez-Martín et al., 2019)p62的KIR結(jié)構(gòu)域與Nrf2的Neh2結(jié)構(gòu)域的基序ETGE相似，負(fù)責(zé)p62和Keap1在精氨酸380、415和483位的直接相互作用(Lau et al, 2010)。因此Nrf2通路被激活。p62的基本結(jié)構(gòu)如圖4所示。p62是多種細(xì)胞信號(hào)通路中的樞紐蛋白，包括Nrf2、自噬、NF-kB和Caspase 8等通路。本文主要介紹p62在Keap1-Nrf2通路和自噬通路中的作用。
4.2 Nrf2通路與自噬之間的串?dāng)_
據(jù)我們所知，p62是一種自噬適配器蛋白，p62的LIR結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞質(zhì)中與LC3結(jié)合，對(duì)自噬的調(diào)節(jié)和自噬體膜的延伸具有積極作用(Lamark et al., 2017; Jiang and Mizushima, 2015)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，p62參與調(diào)控Nrf2通路，使Nrf2易位到細(xì)胞核，激活下游的抗氧化基因(Bartolini et al., 2018)。p62調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)中的Nrf2主要有3種機(jī)制。(1)磷酸化p62的KIR結(jié)構(gòu)域可能與Keap1的DGR結(jié)構(gòu)域相識(shí)別，形成p62-Keap1復(fù)合物，并被UPS途徑清除;(2) p62通過(guò)組裝p62Keap1復(fù)合物和LC3形成LC3-p62-Keap1復(fù)合物來(lái)控制Keap1的周轉(zhuǎn)率，LC3-p62-Keap1復(fù)合物被選擇性自噬消除(Liao et al., 2019); (3)游離p62直接進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控ARE，啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞受到ROS或親電體刺激時(shí)，p62與Keap1 DGR結(jié)構(gòu)域的結(jié)合親和力可通過(guò)磷酸化p62 KIR區(qū)域內(nèi)的S351/349顯著提高(Schnupf et al., 2006)。此外，p62過(guò)表達(dá)可通過(guò)與Ub鏈48K結(jié)合，通過(guò)UPS清除p62-Keap1復(fù)合物，顯著降低Keap1的半衰期(Copple et al., 2010)。此外，Nrf2的DLG基序與Keap1的DGR結(jié)構(gòu)域相互作用的解離有助于LC3-p62-Keap1聚集體的形成。這些聚集物被63- k連接的多聚素選擇性修飾，并被包裹在自噬體中，通過(guò)自噬途徑促進(jìn)Keap1的降解(Dikic, 2017)。此外，Sestrin-2與ULK1相互作用，誘導(dǎo)p62在S409位點(diǎn)的UBA結(jié)構(gòu)域磷酸化(Ro et al., 2014; Rhee and Bae, 2015);并顯著促進(jìn)LC3-p62-Keap1聚集物的自噬降解，從而上調(diào)Nrf2信號(hào)通路(Yang et al., 2020)。一些研究表明，氧化應(yīng)激介導(dǎo)的p62蛋白水平的升高會(huì)產(chǎn)生p62- keap1 -Nrf2正反饋回路，導(dǎo)致Nrf2的持續(xù)激活(Polonen et al., 2019)。
有趣的是，Nrf2也能刺激自噬。當(dāng)大量的Nrf2把進(jìn)入細(xì)胞核,它是通過(guò)小加結(jié)合蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄上調(diào)自噬相關(guān)基因,包括Atg5 p62, Map1lc3b,啟動(dòng)者中包括的核苷酸序列,從而上調(diào) Atg 5,p62, LC3B蛋白的表達(dá) (Frias et al., 2020;Ho and Gorski, 2019)。最近的研究表明Nrf2與ARE結(jié)合后還可以誘導(dǎo)蛋白酶體、自噬相關(guān)基因、Sestrin2和p62的表達(dá)(Dikic, 2017)。此外，Sestrin2可以通過(guò)抑制mTORC1的表達(dá)來(lái)激活自噬(Pasha et al., 2017)。因此Nrf2可直接或間接觸發(fā)選擇性自噬。綜上所述，Nrf2通路通過(guò)p62-Keap1-Nrf2正反饋回路與自噬之間存在相互調(diào)節(jié)關(guān)系。
5. p62-Keap1-Nrf2 軸在AD中的作用
神經(jīng)退行性疾病也稱為蛋白質(zhì)聚集性疾病。典型的神經(jīng)退行性疾病有阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷頓病(HD)、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)和多發(fā)性硬化癥(MS)。神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制是慢性,漸進(jìn),和不可逆轉(zhuǎn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能的變性(Poga?nik et al., 2020)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，大量的ROS和親電體是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展的主要因素。目前，治療神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)有前景的策略是增加抗氧化基因的表達(dá)，包括解毒蛋白和抗氧化酶(Singh and Devasahayam, 2020)。研究表明Nrf2通路在調(diào)節(jié)神經(jīng)退行性疾病中具有重要意義。已經(jīng)證實(shí)，Nrf2通路的激活可以誘導(dǎo)細(xì)胞抗氧化保護(hù)，減少神經(jīng)損傷，延緩神經(jīng)退行性疾病的病情進(jìn)展(Leung et al., 2019)。自噬通過(guò)參與衰老細(xì)胞器的消除和錯(cuò)誤折疊蛋白的降解，在維持神經(jīng)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用(Corti et al., 2020)。神經(jīng)變性疾病與Nrf2通路抑制和自噬功能障礙有關(guān)，導(dǎo)致ROS積累、細(xì)胞器衰老和錯(cuò)誤折疊蛋白(Darios and Stevanin, 2020; Kim S., Indu et al., 2020)。本文主要闡述了Nrf2通路和自噬在AD中的作用。
5.1 Nrf2通路對(duì)AD的影響
AD的發(fā)病機(jī)制以大腦皮層和海馬的神經(jīng)元和突觸結(jié)構(gòu)受損為特征。AD的主要組織學(xué)特征是細(xì)胞外低聚淀粉樣蛋白肽(Aβ)的積累和沉積以及tau蛋白的過(guò)度磷酸化，它們與神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)的形成并行。這些異常蛋白的增加導(dǎo)致神經(jīng)退行性變、神經(jīng)元丟失，最終導(dǎo)致AD (Fão et al., 2019; Gulisano et al., 2018)。一些研究表明，活性氧(ROS)的產(chǎn)生和神經(jīng)元損傷與活性氧的積累有關(guān)。Nrf2的表達(dá)隨著年齡的增長(zhǎng)而顯著下降，細(xì)胞質(zhì)中的ROS不能立即清除，這是AD的主要原因之一。這一觀察結(jié)果提示Nrf2可能是AD的潛在治療靶點(diǎn)(Kahroba and Davatgaran-Taghipour, 2020)。此外，在AD患者大腦中，Nrf2調(diào)控的抗氧化酶SOD1和GSH-Px活性降低(Omar et al., 1999)。當(dāng)SOD和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSHJournal Px) 在AD模型顯著增加,可以降低氧化應(yīng)激損傷,抑制過(guò)度磷酸化tau,減少炎癥推遲AD發(fā)展,增加AD小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力(Ji et al., 2020; Gu et al., 2020)。同樣，Nrf2敲除顯著影響AD小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶，并表現(xiàn)出與衰老AD患者相同的癥狀。Nrf2相關(guān)通路激活劑對(duì)AD有較好的治療效果(Rojo et al., 2017; Wei et al., 2020)，這表明Nrf2通路在治療AD中是有益的。
5.2自噬對(duì)AD的影響
在AD患者中，選擇性自噬與Aβ和過(guò)度磷酸化tau蛋白的消除有關(guān)。自噬抑制會(huì)降低記憶和認(rèn)知能力，因此自噬受阻是AD的另一個(gè)主要原因(Li et al., 2020)。已證實(shí)用相應(yīng)的激活物觸發(fā)自噬有助于減少AD病理進(jìn)展(Vegh et al., 2019; Song et al., 2020)。此外，Nrf2通路和選擇性自噬參與了一個(gè)正反饋回路。有證據(jù)表明Nrf2的激活與神經(jīng)退行性疾病中多聚素化蛋白p62的調(diào)控有關(guān)。自噬適配器p62直接與Keap1相互作用，從而釋放Nrf2并將其導(dǎo)向細(xì)胞核。然后Nrf2與ARE結(jié)合，增加編碼抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄。有趣的是，Nrf2也會(huì)上調(diào)p62基因轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生p62- keap1 -Nrf2正反饋軸，導(dǎo)致Nrf2的持續(xù)激活(Pajares et al., 2016)。越來(lái)越多的研究表明，自噬的激活和p62-Keap1-Nrf2正反饋回路是改善神經(jīng)退行性疾病發(fā)展的保護(hù)機(jī)制(Buratta et al., 2020; Lattante et al., 2015)。因此，自噬與Nrf2通路之間的串?dāng)_可能是治療神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)新的靶點(diǎn)。其調(diào)節(jié)機(jī)制如圖5所示。
綜上所述，由于衰老可降低Nrf2的活性或抑制自噬，如細(xì)胞外低聚體Aβ、細(xì)胞內(nèi)NFT和過(guò)度磷酸化的tau蛋白不能及時(shí)清除，會(huì)導(dǎo)致大量ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而造成海馬和突觸結(jié)構(gòu)損傷；這是AD的主要發(fā)病機(jī)制。p62-Keap1-Nrf2正反饋回路是Nrf2通路與自噬之間的橋梁，在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。天然活性物質(zhì)可以長(zhǎng)期服用，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生的副作用更少。為了探討利用天然產(chǎn)物靶向Nrf2通路、自噬和p62-Keap1-Nrf2反饋回路治療AD的研究現(xiàn)狀，我們檢索了2018年1月1日至2020年4月20日的相關(guān)英漢文獻(xiàn)。英語(yǔ)文獻(xiàn)在PubMed網(wǎng)站(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行搜索。關(guān)鍵詞“(阿爾茨海默病)和(p62)”共61篇，關(guān)鍵詞“(阿爾茨海默病)和(Keap1 Nrf2)”共20篇，關(guān)鍵詞“(阿爾茨海默病)和(p62)和(Nrf2)”共5篇。中文文獻(xiàn)通過(guò)中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)網(wǎng)站(https://www.cnki.net/)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)網(wǎng)站(http://www.wanfangdata.com.cn/index.html)和VIP網(wǎng)站(http://qikan.cqvip.com/)的高級(jí)搜索進(jìn)行檢索。在主題選項(xiàng)下，關(guān)鍵詞“(阿爾茨海默病)和(p62)”獲得17篇期刊文章，關(guān)鍵詞“(阿爾茨海默病)和(Nrf2)”獲得10篇期刊文章，關(guān)鍵詞“((阿爾茨海默病)和(p62)和(Nrf2)”未獲得任何文章。每篇文章后手動(dòng)檢查排除不符合需求的研究,我們發(fā)現(xiàn)總共有19篇文章關(guān)于天然化合物或中藥配方能夠激活Nrf2途徑治療AD,13個(gè)文章通過(guò)p62調(diào)節(jié)自噬干預(yù)AD,而且只有1篇關(guān)于調(diào)節(jié)Nrf2通路和自噬干預(yù)AD。具體總結(jié)見(jiàn)表1-2。綜上所述，通過(guò)靶向p62-Keap1-Nrf2反饋回路治療AD的策略研究，有望為未來(lái)新藥的開(kāi)發(fā)提供新的前景。
圖1為Keap1 Nrf2的基本結(jié)構(gòu)。a. Keap1含有624個(gè)氨基酸，由5個(gè)功能區(qū)組成。BTB、IVR和Keleh/DGR域是Keap1的重要功能域。IVR結(jié)構(gòu)域含有大量半胱氨酸殘基，其中Cys273和Cys288是重要位點(diǎn)。該區(qū)域?qū)ρ趸瘧?yīng)激敏感，也與Nrf2的穩(wěn)定性有關(guān)。BTB結(jié)構(gòu)域包括一個(gè)重要的應(yīng)激敏感位點(diǎn)(Cys151)，可以形成一個(gè)同源二聚體并與Cul3結(jié)合形成E3 Ub連接酶復(fù)合物。Keap1同型二聚體的DGR結(jié)構(gòu)域與Nrf2的Neh2結(jié)構(gòu)域的DLG和ETGE基序相互作用，對(duì)Nrf2的活性產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用。DGR和CTR統(tǒng)稱為DC區(qū)域，是Keap1與細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白的結(jié)合區(qū)域。b. Nrf2含有624個(gè)氨基酸，可分為7個(gè)Neh結(jié)構(gòu)域。Neh1結(jié)構(gòu)域可以識(shí)別sMaf，并有助于Nrf2與DNA中的ARE結(jié)合。Neh2結(jié)構(gòu)域包含促進(jìn)Nrf2與Keap1結(jié)合的ETGE和DLG基序，介導(dǎo)Nrf2的降解，負(fù)向調(diào)節(jié)Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性。Nrf2 c末端的Neh3區(qū)域是一個(gè)重要的功能區(qū)域，可以結(jié)合CHD6并激活A(yù)RE來(lái)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。Neh4和Neh5結(jié)構(gòu)域可與CREB結(jié)合，協(xié)助Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核。Neh6區(qū)域的DSGIS和DSAPGS基序可以被β-TrCP識(shí)別，這對(duì)Nrf2轉(zhuǎn)錄有負(fù)面影響。Neh7域可以實(shí)現(xiàn)對(duì)RXR的識(shí)別。c. ARE位于啟動(dòng)子抗氧化和自噬相關(guān)基因的上游5'端區(qū)域，包括一個(gè)特定的DNA啟動(dòng)子結(jié)合序列。不同細(xì)胞的ARE略有不同，但共同的核苷酸序列為5'- (G/A) TGA (G/C) XXX GC (G/A) -3' (x代表任何核苷酸)。
圖2 Keap1-Nrf2-ARE通路的調(diào)控機(jī)制。在生理?xiàng)l件下，Keap1的BTB結(jié)構(gòu)域與Cul3 E3 Ub連接酶復(fù)合物結(jié)合，兩個(gè)Keap1分子通過(guò)BTB區(qū)域形成一個(gè)同源二聚體。Keap1-Keap1復(fù)合物與Nrf2在Keap1的DGR域以及Nrf2的ETGE和DLG基序以1:1的比例結(jié)合。Nrf2 Neh6區(qū)域的DSGIS和DSAPGS基序與E3 Ub連接酶結(jié)合，然后將Ub-蛋白酶體上的Ub轉(zhuǎn)移到Nrf2的ETGE和DLG基序之間的賴氨酸殘基上，誘導(dǎo)泛素介導(dǎo)的Nrf2降解。在氧化應(yīng)激條件下，IVR區(qū)域的空間構(gòu)象發(fā)生改變。Nrf2的弱、低親和基序DLG與Keap1分離。Keap1 BTB結(jié)構(gòu)域的Cys151被修飾，導(dǎo)致Keap1和Cul3的解離。游離的Nrf2易位到細(xì)胞核并與小Maf蛋白結(jié)合。Nrf2-Maf與ARE結(jié)合，增加抗氧化蛋白和II期解毒酶的轉(zhuǎn)錄激活。
圖3自噬過(guò)程。自噬可分為四個(gè)主要階段:自噬的啟動(dòng)和誘導(dǎo)、自噬體的擴(kuò)展和形成、自噬體的融合和降解、降解產(chǎn)物的循環(huán)。ULK1復(fù)合物、AMPK和PI3K復(fù)合物誘導(dǎo)自噬的啟動(dòng)。延長(zhǎng)相需要Atg12-Atg5-Atg16L和Atg8/LC3偶聯(lián)體系。溶酶體向MTOC移動(dòng)，加速了自噬體和溶酶體相互融合的效率。包括脂肪酸和氨基酸在內(nèi)的水解產(chǎn)物參與了細(xì)胞內(nèi)的循環(huán)以提供能量。
圖4 p62的基本結(jié)構(gòu)。p62通過(guò)PB1結(jié)構(gòu)域的自寡聚形成聚集體，該結(jié)構(gòu)域還與PKC、MEK5和NBR1相互作用形成異源二聚體。UBA結(jié)構(gòu)域?qū)?8-K聚泛素具有高親和力，S403和S407的磷酸化對(duì)自噬小體中泛素化底物的隔離至關(guān)重要。ZZ域與RIP1調(diào)節(jié)腫瘤壞死通路和NF-κB信號(hào)。TB結(jié)構(gòu)域與TRAF6結(jié)合，催化多聚泛素鏈的形成。NLS域和NES域分別是核定位信號(hào)和核輸出信號(hào)。PEST區(qū)域直接與UPS相互作用，而PEST的磷酸化與蛋白質(zhì)的快速降解和更新有關(guān)。LIR和KIR結(jié)構(gòu)域分別與LC3和Keap1結(jié)合并參與自噬。
圖5神經(jīng)退行性疾病中Nrf2通路與自噬之間的串?dāng)_。Nrf2在氧化應(yīng)激反應(yīng)中主要有3種調(diào)控機(jī)制。(1) Nrf2的弱、低親和力DLG基序與Keap1分離。Keap1的BTB結(jié)構(gòu)域被修改，導(dǎo)致Keap1被UPS途徑清除。(2)磷酸化p62的KIR結(jié)構(gòu)域識(shí)別Keap1的DGR結(jié)構(gòu)域，形成p62-Keap1復(fù)合物，并被UPS途徑清除。(3) p62通過(guò)將p62-Keap1和LC3組裝成LC3-p62-Keap1復(fù)合物來(lái)控制Keap1的周轉(zhuǎn)，并通過(guò)選擇性自噬降解。通過(guò)這些途徑釋放的Nrf2允許其轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，并通過(guò)Maf蛋白與ARE結(jié)合。一方面，增加SOD、CAT、Nqo1和HO1的表達(dá)可以減少ROS的積累。另一方面，促進(jìn)p62、Atg5、LC3和Sestrin2的轉(zhuǎn)錄激活自噬并降解蛋白聚集物。Nrf2通路的激活和選擇性自噬可以緩解AD的發(fā)展。
翻譯：
阿爾茨海默病治療的新靶點(diǎn)：Nrf2通路與自噬之間的串?dāng)_
亮點(diǎn)：
• p62連接Nrf2通路和自噬以維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。
• Nrf2的激活和自噬有利于AD治療。
• p62-Keap1-Nrf2軸是治療AD的新型潛在機(jī)制。
• 激活p62-Keap1-Nrf2軸的天然化合物是治療AD的有效藥物。
摘要：
在哺乳動(dòng)物中，Keap1-Nrf2-ARE途徑（以下簡(jiǎn)稱“ Nrf2途徑”）和自噬是主要的細(xì)胞內(nèi)防御系統(tǒng)，可對(duì)抗氧化損傷并維持體內(nèi)平衡。p62 / SQSTM1是一種泛素結(jié)合的自噬受體蛋白，它連接Nrf2途徑和自噬。p62的磷酸化顯著增強(qiáng)了其對(duì)Keap1的親和力，從而誘導(dǎo)Keap1釋放Nrf2，而p62-Keap1異二聚體募集了LC3并介導(dǎo)了Keap1在選擇性自噬途徑中的永久降解。最終，Nrf2積累在細(xì)胞質(zhì)中，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中以激活下游編碼抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。由于Nrf2也上調(diào)了p62基因的表達(dá)，因此創(chuàng)建了p62-Keap1-Nrf2正反饋環(huán)，該環(huán)進(jìn)一步增強(qiáng)了對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。研究表明，p62激活的非經(jīng)典Nrf2途徑是神經(jīng)變性疾病的重要標(biāo)志。p62-Keap1-Nrf2正反饋回路和Nrf2通路參與消除AD誘導(dǎo)的ROS和蛋白質(zhì)聚集。因此，維持p62Keap1-Nrf2正反饋環(huán)路（是Nrf2途徑與自噬之間的橋梁）的體內(nèi)平衡可能是治療AD的潛在目標(biāo)。
關(guān)鍵詞：Nrf2通路、自噬、氧化應(yīng)激、p62-Keap1-Nrf2正反饋回路、阿爾茨海默病
1. 前言
活性氧(ROS)是正常有氧代謝的副產(chǎn)物，在多種危險(xiǎn)因素中產(chǎn)生，如環(huán)境應(yīng)激、衰老和疾病。高水平的ROS破壞DNA結(jié)構(gòu)和膜分布，改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡。氧化應(yīng)激反應(yīng)清除體內(nèi)過(guò)多的ROS，維持體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)(Yi et al., 2020; Xia et al., 2020)。核因子、紅細(xì)胞來(lái)源因子2相關(guān)因子(Nrf2)是抗氧化防御的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，與Kelch like ech相關(guān)蛋白1 (Keap1)相互作用。在氧化應(yīng)激條件下,由于過(guò)多的活性氧產(chǎn)量,Nrf2 Keap1分離,進(jìn)入細(xì)胞核,它結(jié)合抗氧化反應(yīng)的元素(ARE)觸發(fā)下游抗氧化酶的表達(dá),如血紅素加氧酶1 (HO1)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和NAD (P) H醌脫氫酶1 (NQO1)。
自噬在真核細(xì)胞中廣泛存在，是一種自我修復(fù)的生物過(guò)程，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝和抗氧化應(yīng)激。自噬負(fù)責(zé)清除長(zhǎng)壽命或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、脂滴和受損的細(xì)胞器，以保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)(Liu et al., 2020)。自噬是一種溶酶體依賴的自我降解途徑。根據(jù)底物運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行降解的方式，自噬途徑通常分為三種不同類型，這三種類型分別是微自噬、伴侶介導(dǎo)的自噬(CMA，只發(fā)生在哺乳動(dòng)物)和巨自噬(Suzuki et al., 2017)。在微自噬過(guò)程中，底物被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w中，并被小的溶酶體膜的內(nèi)陷所隔離，這些內(nèi)陷被擠壓到內(nèi)腔中(Li and Hochstrasser, 2020)。在CMA中，五肽基序(KFERQ)暴露的錯(cuò)誤折疊蛋白被熱休克70 kDa蛋白8 (HSPA8/HSC70)識(shí)別，進(jìn)而與溶酶體相關(guān)膜蛋白2A (LAMP2A)結(jié)合。這些蛋白在溶酶體腔內(nèi)展開(kāi)和降解(Dou et al., 2020)。自噬最典型的形式是巨自噬(以下簡(jiǎn)稱自噬)。自噬的特點(diǎn)是胞質(zhì)成分包裹在稱為自噬小體的雙層膜結(jié)構(gòu)中。然后，自噬體與溶酶體膜融合并被水解酶降解。在營(yíng)養(yǎng)缺乏的情況下，該途徑被激活以提供氨基酸和ATP (Yang et al., 2019)。
p62轉(zhuǎn)錄被氧化應(yīng)激、代謝紊亂、疾病和自噬受阻激活，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中大量p62聚集。p62的聚集物通過(guò)與Nrf2抑制蛋白Keap1直接相互作用，維持Nrf2的慢性激活，并且p62介導(dǎo)Keap1在選擇性自噬途徑中的永久降解(Sanchez-Martin and Komatsu, 2018)。因此，Nrf2信號(hào)通路被激活，導(dǎo)致編碼抗氧化酶的基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)(Deng et al., 2020)。此外，核內(nèi)Nrf2促進(jìn)p62基因的過(guò)表達(dá)，形成p62- keap1 -Nrf2正反饋軸，導(dǎo)致Nrf2的持續(xù)激活。與經(jīng)典途徑相比，p62介導(dǎo)的選擇性自噬調(diào)節(jié)Nrf2信號(hào)通路屬于非經(jīng)典機(jī)制。越來(lái)越多的研究表明，p62-Keap1-Nrf2通路的失調(diào)與神經(jīng)退行性疾病的治療有關(guān)(Shah et al., 2018)。因此，本綜述將闡述Nrf2通路、自噬及其串?dāng)_在AD治療中的作用。
2. Nrf2 通路
2.1 Keap1的基本結(jié)構(gòu)
Keap1的分子量為66 kDa，由624個(gè)氨基酸組成。它是Cullin3 (Cul3)-E3泛素連接酶復(fù)合物的底物蛋白，是一種負(fù)向調(diào)節(jié)Nrf2活性的胞質(zhì)蛋白(Davies et al., 2016)。從結(jié)構(gòu)上看，Keap1由5個(gè)功能區(qū)組成。第一個(gè)區(qū)域是N端區(qū)域(NTR)。第二個(gè)區(qū)域是間質(zhì)區(qū)(IVR)，其中含有大量的半胱氨酸殘基。第三個(gè)區(qū)域是brac -a-brac (BTB)區(qū)域，包括broad complex、tramtrack和brac，其中包括一個(gè)重要的應(yīng)力敏感位點(diǎn)半胱氨酸151 (Cys151)。后兩個(gè)區(qū)域是雙甘氨酸重復(fù)或Keleh重復(fù)(DGR)區(qū)域和C末端區(qū)域(CTR) (Dinkovakostova et al., 2017; Deshmukh et al., 2017)。在這些區(qū)域中，BTB、IVR和Keleh/DGR域是Keap1的重要功能域。BTB結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中一個(gè)進(jìn)化保守的序列。這個(gè)結(jié)構(gòu)域可以與另一個(gè)Keap1分子的BTB區(qū)域結(jié)合，形成一個(gè)同分二聚體，然后與Nrf2結(jié)合。該區(qū)域還可以與Cul3結(jié)合形成E3 Ub連接酶復(fù)合物，導(dǎo)致泛素介導(dǎo)的Nrf2降解(Kansanen et al., 2012; Tao et al., 2017)。在BTB結(jié)構(gòu)域，當(dāng)半胱氨酸殘基的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時(shí)，Nrf2蛋白的泛素化和降解將受到抑制。這一過(guò)程誘導(dǎo)Nrf2與Keap1分離并與ARE結(jié)合以激活編碼抗氧化酶的基因轉(zhuǎn)錄。IVR區(qū)域富含半胱氨酸殘基，對(duì)氧化應(yīng)激敏感，也與Nrf2的穩(wěn)定性有關(guān)。在正常生理?xiàng)l件下，IVR區(qū)域參與泛素介導(dǎo)的Nrf2降解。值得一提的是，Cys273和Cys288在抑制Nrf2活性方面發(fā)揮了重要作用。當(dāng)機(jī)體被親電體和ROS激活時(shí)，IVR結(jié)構(gòu)域發(fā)生轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致Nrf2和Keap1相互分離(Magesh et al., 2012)。DGR結(jié)構(gòu)域(包括6個(gè)Kelch重復(fù))和CTR區(qū)域統(tǒng)稱為DC結(jié)構(gòu)域，是Keap1與細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。Keap1同型二聚體中的DGR結(jié)構(gòu)域與Nrf2中Neh2結(jié)構(gòu)域的DLG和ETGE氨基酸基序相互作用，對(duì)Nrf2活性產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用。在外源性或內(nèi)源性刺激下，通過(guò)半胱氨酸失活誘導(dǎo)Keap1 DGR區(qū)域構(gòu)象變化，誘導(dǎo)Keap1-Nrf2蛋白復(fù)合物解離，釋放Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核。Keap1的基本結(jié)構(gòu)如圖1a所示。
2.2 Nrf2的基本結(jié)構(gòu)
Nrf2分子量為100kda，由624個(gè)氨基酸組成。Nrf2屬于堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper, bZIP)轉(zhuǎn)錄因子家族，其成員保持cap-n-collar (CNC)結(jié)構(gòu)，而人類Nfe2l2位于2q31上(Tavakkoli et al., 2019; Bottino-Rojas et al., 2018)。根據(jù)其生理功能，Nrf2可分為7個(gè)高度保守的ECH同源結(jié)構(gòu)域(Nrf2- ECH同源)，包括Neh1到Neh7 (ECH，與雞Nrf2具有CNC同源性的紅血球來(lái)源蛋白)。亮氨酸CNC-bZIP區(qū)域位于Neh1結(jié)構(gòu)域，可與細(xì)胞核中的一種小的肌肉筋膜性纖維肉瘤(Maf)蛋白(即脊椎動(dòng)物中的MafF、MafG或MafK)結(jié)合，并有助于Nrf2與DNA中的ARE結(jié)合。隨后，抗氧化酶、Ub酶、II期解毒酶和蛋白酶體的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，以抵御細(xì)胞中的氧化應(yīng)激(Karan et al., 2020; Shen et al., 2019)。Neh2結(jié)構(gòu)域是一個(gè)由16個(gè)氨基酸組成的短肽，其氨基酸序列在69~84之間，位于Nrf2的N端。Nrf2的Neh2結(jié)構(gòu)域包含分別與Keap1具有高親和力和低親和力的ETGE和DLG基序;該區(qū)域介導(dǎo)Nrf2的降解并負(fù)調(diào)控Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性(Tian et al., 2018)。Nrf2 C -末端的Neh3區(qū)域是一個(gè)可以結(jié)合CHD6并激活A(yù)RE的重要功能區(qū)域(Zhang et al., 2014)。Neh4和Neh5域可以結(jié)合激活cAMP反應(yīng)元素結(jié)合蛋白(CREB)協(xié)助Nrf2核轉(zhuǎn)運(yùn)和以Nrf2-Maf的形式綁定到ARE (Krajka Ku?niak et al ., 2016)。Neh6結(jié)構(gòu)域具有大量的絲氨酸殘基(Chen et al., 2020)，對(duì)Nrf2轉(zhuǎn)錄有負(fù)向影響，且不依賴于Keap1 (Chowdhry et al., 2013)，該結(jié)構(gòu)域主要參與Nrf2的降解。其調(diào)控機(jī)制是DSGIS和DSAPGS的氨基酸基序可通過(guò)β-轉(zhuǎn)介含重復(fù)蛋白(β-TrCP)識(shí)別，并可誘導(dǎo)Skp1-Cul1-Rbx1/Roc1-β-TrCP Ub連接酶復(fù)合物調(diào)控Nrf2泛素化介導(dǎo)的降解(Cuadrado, 2015)。Neh7結(jié)構(gòu)域識(shí)別視黃素X受體(RXR) (Li et al., 2017)。此外，Nrf2的第40個(gè)氨基酸是一個(gè)磷酸化位點(diǎn)，該位點(diǎn)的磷酸化導(dǎo)致Nrf2從Keap1中解離。Nrf2的基本結(jié)構(gòu)如圖1b所示。
2.3 ARE的基本結(jié)構(gòu)
ARE位于一些細(xì)胞保護(hù)基因(抗氧化和自噬相關(guān)基因)啟動(dòng)子區(qū)域上游5'端，屬于特定的DNA啟動(dòng)子聯(lián)合序列(Jeddi et al., 2017)。ARE被定義為順式作用的DNA增強(qiáng)因子，負(fù)責(zé)觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，以誘導(dǎo)II期解毒酶和抗氧化酶的表達(dá)。ARE廣泛表達(dá)于生物體中，其功能是減輕細(xì)胞或組織的各種損傷，維持體內(nèi)平衡。雖然在不同的細(xì)胞中ARE略有不同，但共同的核苷酸序列為5'- (G/A) TGA (G/C) XXX GC (G/A) -3' (x代表任何核苷酸)。ARE的基本結(jié)構(gòu)如圖1c所示。
2.4 Nrf2信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制
在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，細(xì)胞獲得了抵抗外部毒素和內(nèi)部代謝毒素的能力。最重要的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)(Erukainure et al., 2020)[29]。Keap1-Nrf2- ARE通路是激活Nrf2的典型調(diào)控通路，Nrf2的活性主要由Keap1調(diào)控。在基礎(chǔ)條件下，Keap1的BTB結(jié)構(gòu)域與Cul3 E3 Ub連接酶復(fù)合物結(jié)合，兩個(gè)Keap1分子通過(guò)BTB區(qū)域形成一個(gè)同源二聚體。Keap1-Keap1復(fù)合物通過(guò)Keap1的DGR域與Nrf2的ETGE和DLG基序以1:1的比例直接結(jié)合到Nrf2上(Raghunath et al., 2019)。Nrf2 Neh6域的DSGIS和DSAPGS氨基酸基序與E3 Ub連接酶結(jié)合,然后, Ub-蛋白酶體上得Ub轉(zhuǎn)移到Nrf2ETGE、DLG基序之間的賴氨酸殘基誘導(dǎo)泛素介導(dǎo)的Nrf2降解，因此保持適當(dāng)?shù)臐舛萅rf2(Lee and Ryu, 2017)。
在氧化應(yīng)激條件下，線粒體產(chǎn)生大量的高活性分子，如ROS (Chen et al., 2020);當(dāng)ROS含量超過(guò)細(xì)胞清除能力時(shí)，氧化還原系統(tǒng)出現(xiàn)失衡，導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生氧化損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、組織或器官損傷(Liu et al., 2017; Valavanidis et al., 2013)。因此Nrf2通路被顯著激活，具體機(jī)制如下。一方面，Keap1 IVR區(qū)Cys273和Cys288的巰基被氧化形成二硫鍵(Magesh et al., 2012)，導(dǎo)致空間構(gòu)象的改變。然后，具有較強(qiáng)結(jié)合能力的高親和力ETGE 基序仍然能夠與Keap1緊密結(jié)合，而較弱、低親和力的DLG 基序與Keap1分離。Nrf2的空間定位發(fā)生改變，不能被泛素蛋白酶體降解。另一方面，Keap1 BTB結(jié)構(gòu)域的Cys151被修飾，產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，導(dǎo)致Keap1和Cul3解離(Wang et al., 2020)。這破壞了keap1-cul3 E3 泛素連接酶的活性，并抑制了泛素介導(dǎo)的Nrf2降解。當(dāng)Keap1-Keap1-Nrf2的數(shù)量達(dá)到飽和時(shí)，Keap1同型二聚體在細(xì)胞中不能再生，新生成的Nrf2由于自身的保護(hù)，不再與Keap1結(jié)合。Nrf2遷移到細(xì)胞核并與小Maf蛋白結(jié)合。然后，Nrf2-Maf與ARE結(jié)合，增加抗氧化蛋白和II期解毒酶的轉(zhuǎn)錄激活(Otsuki and Yamamoto, 2019)。當(dāng)氧化還原平衡恢復(fù)后，Nrf2從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)，并通過(guò)泛素化降解(Pandey et al., 2017)。Nrf2通路的具體調(diào)控機(jī)制如圖2所示。
3. 自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制
從機(jī)制上看，自噬主要分為四個(gè)階段，即自噬的啟動(dòng)和誘導(dǎo)、自噬體的擴(kuò)展和形成、自噬體與溶酶體融合和降解以及降解產(chǎn)物的循環(huán)利用(Carlsson and Simonsen, 2015)。在營(yíng)養(yǎng)充足的條件下，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是自噬的重要調(diào)節(jié)因子，其作用是抑制自噬。mTOR存在于細(xì)胞內(nèi)的兩個(gè)復(fù)合物中;這些復(fù)合物是mTOR復(fù)合物1 (mTORC1)和mTOR復(fù)合物2 (mTORC2)。mTORC1復(fù)合物由mTOR、raptor和富含脯氨酸的Akt底物(PRAS40)組成，raptor是mTORC1激活的重要因素。此外，mTOR、rictor、哺乳動(dòng)物應(yīng)激激活的MAP激酶相互作用蛋白(mSIN1)以及與rictor 1和2觀察到的蛋白形成mTORC2復(fù)合物。unc -51樣激酶1 (ULK1)是自噬核心機(jī)制中最上游的激酶，ULK1的磷酸化是自噬激活的重要決定因素。AMP活化蛋白激酶(AMPK)和mTORC1可以直接調(diào)節(jié)ULK1 (Atg1 homologs)的磷酸化，這些蛋白是自噬的重要調(diào)節(jié)蛋白。AMPK正調(diào)控自噬，mTORC1通過(guò)與ULK1結(jié)合抑制ULK1復(fù)合物的磷酸化，從而抑制自噬(Noda, 2017)。
3.1自噬的啟動(dòng)和誘導(dǎo)
正常情況下，自噬被mTORC1抑制，Beclin1與Beclin2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)上形成復(fù)合物。在缺乏營(yíng)養(yǎng)或生長(zhǎng)因子的條件下，自噬被認(rèn)為是非選擇性的，并集中于增加任何胞質(zhì)蛋白和其他大分子的降解，以提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在應(yīng)激條件下，自噬被認(rèn)為是選擇性的，有目的地識(shí)別底物并將其緊密地結(jié)合到新出現(xiàn)的自噬體膜上。相關(guān)機(jī)制如下。mTORC1失活后，由ULK1、ULK2、Atg13、Atg101和局灶粘附激酶家族相互作用蛋白(FIP200) (Neufeld, 2020)組成的ULK1復(fù)合物被AMPK激活后轉(zhuǎn)運(yùn)到ER (Chen et al, 2020)。磷酸化的ULK1復(fù)合物調(diào)控JNK1酶誘導(dǎo)Beclin2的磷酸化，從而改變Beclin2的空間構(gòu)像，將Beclin1釋放到細(xì)胞質(zhì)中(Xue et al., 2015)。Beclin1對(duì)應(yīng)激高度敏感(Kiruthiga et al., 2020)，并與III類磷脂酰肌醇3激酶(IIIPI3K/PIK3C3;酵母中的Vps34)， Atg14L(也稱為BARKOR;酵母中的Atg14), p150(又稱PIK3R4;酵母菌Vps15)和AMBRA1。PI3K (PI3P)的磷酸化參與了自噬的啟動(dòng)(Nascimbeni et al., 2017)。部分PI3P復(fù)合物征募雙FYVE-containing protein 1 (DECP1)，被ER包裹以增強(qiáng)膜的彎曲度，并形成一個(gè)收集自噬相關(guān)蛋白的平臺(tái)。PI3P與WD重復(fù)域磷酸肌醇肽相互作用的另一部分(WIPI, Atg18同源物)在胞漿-液泡(Cvt)通路中發(fā)揮重要作用。這個(gè)階段是自噬前體膜的形成(Cao et al., 2019;Nakatogawa, 2020)。
3.2自噬體的延伸和形成
自噬前體的雙層膜被不斷拉長(zhǎng)以形成自噬體。在延長(zhǎng)階段需要兩個(gè)Atg接合系統(tǒng)被ub -蛋白酶體修飾。一個(gè)系統(tǒng)是Atg12-Atg5-Atg16L共軛系統(tǒng)，錨定自噬體的外膜，另一個(gè)系統(tǒng)是Atg8/LC3共軛系統(tǒng)，同時(shí)連接內(nèi)膜和外膜。Atg12-Atg5-Atg16L復(fù)合物是自噬體形成所必需的。自噬激活后，ub樣蛋白Atg12被e1樣ub激活酶和e2樣ub結(jié)合酶誘導(dǎo)，通過(guò)Atg7和Atg10作用與Atg5結(jié)合。Atg16的低聚物與Atg12-Atg5的共軛物結(jié)合，形成位于外膜的Atg12-Atg5- atg16l復(fù)合物(Liet al., 2020)。在非自噬條件下，LC3(在酵母中也被稱為Atg8同源蛋白)以proLC3的非活性形式存在。自噬激活后，LC3通過(guò)Atg4、Atg7、Atg3的順序作用轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3I。然后Atg12-Atg5-Atg16L復(fù)合物介導(dǎo)LC3I與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合，形成具有膜結(jié)合能力的活性蛋白LC3II。LC3II與p62的LIR結(jié)構(gòu)域相互作用，影響擴(kuò)張吞噬團(tuán)的曲率和自噬前體的形成。自噬前體膜通過(guò)誘導(dǎo)LC3II不斷延伸形成囊狀自噬體，嵌入雙層膜表面(Noda and Inagaki, 2015)。
3.3自噬體與溶酶體的融合和產(chǎn)物降解
自噬體與溶酶體的融合是通過(guò)兩種機(jī)制:一個(gè)機(jī)制是直接的自噬體與溶酶體融合形成自吞噬泡,和其他機(jī)制的結(jié)合與成熟的核內(nèi)體自噬體形成自噬核內(nèi)體,后來(lái)搬到溶酶體與溶酶體融合。細(xì)胞核周圍的微管組織中心(MTOC)含有大量的溶酶體。在壓力作用下，膜附LC3-II蛋白在肌動(dòng)蛋白復(fù)合物的作用下移動(dòng)到MTOC附近。同時(shí)，溶酶體向MTOC移動(dòng)，加速了相互融合的效率。在自噬溶酶體形成初期，ATP為溶酶體膜上的質(zhì)子泵提供能量，增加溶酶體主動(dòng)攝取H+。陽(yáng)離子和陰離子泵可以維持溶酶體中的離子電流平衡(如Ca2+、K+和Cl-)。當(dāng)內(nèi)溶酶體的pH值在4.5 ~ 5.0時(shí)，水解酶被激活，困在自噬體內(nèi)的LC3II蛋白與底物一起最終被降解。自噬體外膜上LC3-II被Atg4降解回收?；诙嗵堑哪さ鞍?如LAMP1和LAMP2)嵌入溶酶體膜表面，可以防止溶酶體自身降解。自噬溶酶體融合后，水解酶降解底物，包括脂肪酸和氨基酸在內(nèi)的水解物參與細(xì)胞內(nèi)循環(huán)，提供能量(Zhao et al., 2020)。具體流程如圖3所示。
4. 細(xì)胞中的p62-Keap1-Nrf2軸
4.1 p62的基本結(jié)構(gòu)
p62，又稱SQSTM1，是一種與ub結(jié)合的自噬受體，分子量為62 kDa。p62主要位于細(xì)胞質(zhì)中，可在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間轉(zhuǎn)運(yùn)。p62含有440個(gè)氨基酸,由9功能域:phox bem1域(PB1), ZZ-type鋅指域(ZZ) TRAF6綁定域(TB),核本地化信號(hào)(NLS),核出口信號(hào)(NES), PEST域,LC3交互領(lǐng)域(LIR), Keap1相互作用域(KIR)和C末端 Ub相關(guān)(UBA)域(Lin et al., 2013)。p62通過(guò)PB1結(jié)構(gòu)域的selfoligomerization形成聚合體，該結(jié)構(gòu)域還與PKC、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5 (MEK5)和鄰近的BRCA1基因1蛋白(NBR1)相互作用，形成異源二聚體。c端UBA結(jié)構(gòu)域，對(duì)Ub具有高親和力的高度保守序列(Katsuragi et al., 2015; Denk et al., 2019)，對(duì)于隔離轉(zhuǎn)運(yùn)到自噬體中的泛素化底物至關(guān)重要。此外，UBA結(jié)構(gòu)域的S403和S407可被靶向形成Ub鏈48K的蛋白聚合物(Zhang et al., 2019)，并被由兩個(gè)亞基組成的26S蛋白酶體識(shí)別，這兩個(gè)亞基是一個(gè)20S蛋白酶體和一個(gè)19S調(diào)節(jié)粒子。19S粒子識(shí)別泛素化的p62蛋白，并通過(guò)狹窄的孔將其轉(zhuǎn)移至20S蛋白酶體，20S蛋白酶體將底物消化為包含2-24個(gè)氨基酸的肽，并為細(xì)胞再利用提供必要的材料(Jakobi et al., 2020; Cohen-Kaplan et al., 2017)。ZZ域與受體相互作用蛋白1 (RIP1)調(diào)節(jié)腫瘤壞死通路和NF-κB信號(hào)(Yan et al ., 2017)。TB結(jié)構(gòu)域結(jié)合TRAF6催化賴氨酸(K)殘基位點(diǎn)(63位)多聚泛素鏈的形成(Kim et al., 2019)。ZZ和TB區(qū)域之間的未知區(qū)域與raptor相互作用，激活雷帕霉素復(fù)合物1的機(jī)制靶點(diǎn)。NLS和NES結(jié)構(gòu)域分別是核定位信號(hào)和核輸出信號(hào)，NLS2的磷酸化在促進(jìn)p62在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間的轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮了重要作用(Pankiv et al., 2010)。阻止p62轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)會(huì)導(dǎo)致泛素化蛋白聚集物在細(xì)胞核內(nèi)積聚，促進(jìn)p62的核易位。研究表明，p62定位于細(xì)胞核中泛素化蛋白聚集物上，提示p62可能被核泛素化蛋白聚集物降解(Wang et al., 2019; Kleine et al., 2012)。PEST結(jié)構(gòu)域包括脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)，也稱為PEST序列。在真核細(xì)胞中，PEST序列被認(rèn)為是直接與泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)相互作用的靶點(diǎn)，并且PEST的磷酸化與蛋白質(zhì)的快速降解和更新有關(guān)。但是，PEST序列不是p62的特征域;在一些代謝酶、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白中也發(fā)現(xiàn)了它(Schnupf et al., 2006)。LIR結(jié)構(gòu)域與LC3結(jié)合，在自噬體的形成和降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Islam et al., 2018)。DPSTGE基序(氨基酸位置349-354)(Deng et al., 2019; Sánchez-Martín et al., 2019)p62的KIR結(jié)構(gòu)域與Nrf2的Neh2結(jié)構(gòu)域的基序ETGE相似，負(fù)責(zé)p62和Keap1在精氨酸380、415和483位的直接相互作用(Lau et al, 2010)。因此Nrf2通路被激活。p62的基本結(jié)構(gòu)如圖4所示。p62是多種細(xì)胞信號(hào)通路中的樞紐蛋白，包括Nrf2、自噬、NF-kB和Caspase 8等通路。本文主要介紹p62在Keap1-Nrf2通路和自噬通路中的作用。
4.2 Nrf2通路與自噬之間的串?dāng)_
據(jù)我們所知，p62是一種自噬適配器蛋白，p62的LIR結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞質(zhì)中與LC3結(jié)合，對(duì)自噬的調(diào)節(jié)和自噬體膜的延伸具有積極作用(Lamark et al., 2017; Jiang and Mizushima, 2015)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，p62參與調(diào)控Nrf2通路，使Nrf2易位到細(xì)胞核，激活下游的抗氧化基因(Bartolini et al., 2018)。p62調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)中的Nrf2主要有3種機(jī)制。(1)磷酸化p62的KIR結(jié)構(gòu)域可能與Keap1的DGR結(jié)構(gòu)域相識(shí)別，形成p62-Keap1復(fù)合物，并被UPS途徑清除;(2) p62通過(guò)組裝p62Keap1復(fù)合物和LC3形成LC3-p62-Keap1復(fù)合物來(lái)控制Keap1的周轉(zhuǎn)率，LC3-p62-Keap1復(fù)合物被選擇性自噬消除(Liao et al., 2019); (3)游離p62直接進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控ARE，啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞受到ROS或親電體刺激時(shí)，p62與Keap1 DGR結(jié)構(gòu)域的結(jié)合親和力可通過(guò)磷酸化p62 KIR區(qū)域內(nèi)的S351/349顯著提高(Schnupf et al., 2006)。此外，p62過(guò)表達(dá)可通過(guò)與Ub鏈48K結(jié)合，通過(guò)UPS清除p62-Keap1復(fù)合物，顯著降低Keap1的半衰期(Copple et al., 2010)。此外，Nrf2的DLG基序與Keap1的DGR結(jié)構(gòu)域相互作用的解離有助于LC3-p62-Keap1聚集體的形成。這些聚集物被63- k連接的多聚素選擇性修飾，并被包裹在自噬體中，通過(guò)自噬途徑促進(jìn)Keap1的降解(Dikic, 2017)。此外，Sestrin-2與ULK1相互作用，誘導(dǎo)p62在S409位點(diǎn)的UBA結(jié)構(gòu)域磷酸化(Ro et al., 2014; Rhee and Bae, 2015);并顯著促進(jìn)LC3-p62-Keap1聚集物的自噬降解，從而上調(diào)Nrf2信號(hào)通路(Yang et al., 2020)。一些研究表明，氧化應(yīng)激介導(dǎo)的p62蛋白水平的升高會(huì)產(chǎn)生p62- keap1 -Nrf2正反饋回路，導(dǎo)致Nrf2的持續(xù)激活(Polonen et al., 2019)。
有趣的是，Nrf2也能刺激自噬。當(dāng)大量的Nrf2把進(jìn)入細(xì)胞核,它是通過(guò)小加結(jié)合蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄上調(diào)自噬相關(guān)基因,包括Atg5 p62, Map1lc3b,啟動(dòng)者中包括的核苷酸序列,從而上調(diào) Atg 5,p62, LC3B蛋白的表達(dá) (Frias et al., 2020;Ho and Gorski, 2019)。最近的研究表明Nrf2與ARE結(jié)合后還可以誘導(dǎo)蛋白酶體、自噬相關(guān)基因、Sestrin2和p62的表達(dá)(Dikic, 2017)。此外，Sestrin2可以通過(guò)抑制mTORC1的表達(dá)來(lái)激活自噬(Pasha et al., 2017)。因此Nrf2可直接或間接觸發(fā)選擇性自噬。綜上所述，Nrf2通路通過(guò)p62-Keap1-Nrf2正反饋回路與自噬之間存在相互調(diào)節(jié)關(guān)系。
5. p62-Keap1-Nrf2 軸在AD中的作用
神經(jīng)退行性疾病也稱為蛋白質(zhì)聚集性疾病。典型的神經(jīng)退行性疾病有阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷頓病(HD)、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)和多發(fā)性硬化癥(MS)。神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制是慢性,漸進(jìn),和不可逆轉(zhuǎn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能的變性(Poga?nik et al., 2020)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，大量的ROS和親電體是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展的主要因素。目前，治療神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)有前景的策略是增加抗氧化基因的表達(dá)，包括解毒蛋白和抗氧化酶(Singh and Devasahayam, 2020)。研究表明Nrf2通路在調(diào)節(jié)神經(jīng)退行性疾病中具有重要意義。已經(jīng)證實(shí)，Nrf2通路的激活可以誘導(dǎo)細(xì)胞抗氧化保護(hù)，減少神經(jīng)損傷，延緩神經(jīng)退行性疾病的病情進(jìn)展(Leung et al., 2019)。自噬通過(guò)參與衰老細(xì)胞器的消除和錯(cuò)誤折疊蛋白的降解，在維持神經(jīng)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用(Corti et al., 2020)。神經(jīng)變性疾病與Nrf2通路抑制和自噬功能障礙有關(guān)，導(dǎo)致ROS積累、細(xì)胞器衰老和錯(cuò)誤折疊蛋白(Darios and Stevanin, 2020; Kim S., Indu et al., 2020)。本文主要闡述了Nrf2通路和自噬在AD中的作用。
5.1 Nrf2通路對(duì)AD的影響
AD的發(fā)病機(jī)制以大腦皮層和海馬的神經(jīng)元和突觸結(jié)構(gòu)受損為特征。AD的主要組織學(xué)特征是細(xì)胞外低聚淀粉樣蛋白肽(Aβ)的積累和沉積以及tau蛋白的過(guò)度磷酸化，它們與神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)的形成并行。這些異常蛋白的增加導(dǎo)致神經(jīng)退行性變、神經(jīng)元丟失，最終導(dǎo)致AD (Fão et al., 2019; Gulisano et al., 2018)。一些研究表明，活性氧(ROS)的產(chǎn)生和神經(jīng)元損傷與活性氧的積累有關(guān)。Nrf2的表達(dá)隨著年齡的增長(zhǎng)而顯著下降，細(xì)胞質(zhì)中的ROS不能立即清除，這是AD的主要原因之一。這一觀察結(jié)果提示Nrf2可能是AD的潛在治療靶點(diǎn)(Kahroba and Davatgaran-Taghipour, 2020)。此外，在AD患者大腦中，Nrf2調(diào)控的抗氧化酶SOD1和GSH-Px活性降低(Omar et al., 1999)。當(dāng)SOD和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSHJournal Px) 在AD模型顯著增加,可以降低氧化應(yīng)激損傷,抑制過(guò)度磷酸化tau,減少炎癥推遲AD發(fā)展,增加AD小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力(Ji et al., 2020; Gu et al., 2020)。同樣，Nrf2敲除顯著影響AD小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶，并表現(xiàn)出與衰老AD患者相同的癥狀。Nrf2相關(guān)通路激活劑對(duì)AD有較好的治療效果(Rojo et al., 2017; Wei et al., 2020)，這表明Nrf2通路在治療AD中是有益的。
5.2自噬對(duì)AD的影響
在AD患者中，選擇性自噬與Aβ和過(guò)度磷酸化tau蛋白的消除有關(guān)。自噬抑制會(huì)降低記憶和認(rèn)知能力，因此自噬受阻是AD的另一個(gè)主要原因(Li et al., 2020)。已證實(shí)用相應(yīng)的激活物觸發(fā)自噬有助于減少AD病理進(jìn)展(Vegh et al., 2019; Song et al., 2020)。此外，Nrf2通路和選擇性自噬參與了一個(gè)正反饋回路。有證據(jù)表明Nrf2的激活與神經(jīng)退行性疾病中多聚素化蛋白p62的調(diào)控有關(guān)。自噬適配器p62直接與Keap1相互作用，從而釋放Nrf2并將其導(dǎo)向細(xì)胞核。然后Nrf2與ARE結(jié)合，增加編碼抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄。有趣的是，Nrf2也會(huì)上調(diào)p62基因轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生p62- keap1 -Nrf2正反饋軸，導(dǎo)致Nrf2的持續(xù)激活(Pajares et al., 2016)。越來(lái)越多的研究表明，自噬的激活和p62-Keap1-Nrf2正反饋回路是改善神經(jīng)退行性疾病發(fā)展的保護(hù)機(jī)制(Buratta et al., 2020; Lattante et al., 2015)。因此，自噬與Nrf2通路之間的串?dāng)_可能是治療神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)新的靶點(diǎn)。其調(diào)節(jié)機(jī)制如圖5所示。
綜上所述，由于衰老可降低Nrf2的活性或抑制自噬，如細(xì)胞外低聚體Aβ、細(xì)胞內(nèi)NFT和過(guò)度磷酸化的tau蛋白不能及時(shí)清除，會(huì)導(dǎo)致大量ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而造成海馬和突觸結(jié)構(gòu)損傷；這是AD的主要發(fā)病機(jī)制。p62-Keap1-Nrf2正反饋回路是Nrf2通路與自噬之間的橋梁，在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。天然活性物質(zhì)可以長(zhǎng)期服用，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生的副作用更少。為了探討利用天然產(chǎn)物靶向Nrf2通路、自噬和p62-Keap1-Nrf2反饋回路治療AD的研究現(xiàn)狀，我們檢索了2018年1月1日至2020年4月20日的相關(guān)英漢文獻(xiàn)。英語(yǔ)文獻(xiàn)在PubMed網(wǎng)站(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行搜索。關(guān)鍵詞“(阿爾茨海默病)和(p62)”共61篇，關(guān)鍵詞“(阿爾茨海默病)和(Keap1 Nrf2)”共20篇，關(guān)鍵詞“(阿爾茨海默病)和(p62)和(Nrf2)”共5篇。中文文獻(xiàn)通過(guò)中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)網(wǎng)站(https://www.cnki.net/)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)網(wǎng)站(http://www.wanfangdata.com.cn/index.html)和VIP網(wǎng)站(http://qikan.cqvip.com/)的高級(jí)搜索進(jìn)行檢索。在主題選項(xiàng)下，關(guān)鍵詞“(阿爾茨海默病)和(p62)”獲得17篇期刊文章，關(guān)鍵詞“(阿爾茨海默病)和(Nrf2)”獲得10篇期刊文章，關(guān)鍵詞“((阿爾茨海默病)和(p62)和(Nrf2)”未獲得任何文章。每篇文章后手動(dòng)檢查排除不符合需求的研究,我們發(fā)現(xiàn)總共有19篇文章關(guān)于天然化合物或中藥配方能夠激活Nrf2途徑治療AD,13個(gè)文章通過(guò)p62調(diào)節(jié)自噬干預(yù)AD,而且只有1篇關(guān)于調(diào)節(jié)Nrf2通路和自噬干預(yù)AD。具體總結(jié)見(jiàn)表1-2。綜上所述，通過(guò)靶向p62-Keap1-Nrf2反饋回路治療AD的策略研究，有望為未來(lái)新藥的開(kāi)發(fā)提供新的前景。
圖1為Keap1 Nrf2的基本結(jié)構(gòu)。a. Keap1含有624個(gè)氨基酸，由5個(gè)功能區(qū)組成。BTB、IVR和Keleh/DGR域是Keap1的重要功能域。IVR結(jié)構(gòu)域含有大量半胱氨酸殘基，其中Cys273和Cys288是重要位點(diǎn)。該區(qū)域?qū)ρ趸瘧?yīng)激敏感，也與Nrf2的穩(wěn)定性有關(guān)。BTB結(jié)構(gòu)域包括一個(gè)重要的應(yīng)激敏感位點(diǎn)(Cys151)，可以形成一個(gè)同源二聚體并與Cul3結(jié)合形成E3 Ub連接酶復(fù)合物。Keap1同型二聚體的DGR結(jié)構(gòu)域與Nrf2的Neh2結(jié)構(gòu)域的DLG和ETGE基序相互作用，對(duì)Nrf2的活性產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用。DGR和CTR統(tǒng)稱為DC區(qū)域，是Keap1與細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白的結(jié)合區(qū)域。b. Nrf2含有624個(gè)氨基酸，可分為7個(gè)Neh結(jié)構(gòu)域。Neh1結(jié)構(gòu)域可以識(shí)別sMaf，并有助于Nrf2與DNA中的ARE結(jié)合。Neh2結(jié)構(gòu)域包含促進(jìn)Nrf2與Keap1結(jié)合的ETGE和DLG基序，介導(dǎo)Nrf2的降解，負(fù)向調(diào)節(jié)Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性。Nrf2 c末端的Neh3區(qū)域是一個(gè)重要的功能區(qū)域，可以結(jié)合CHD6并激活A(yù)RE來(lái)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。Neh4和Neh5結(jié)構(gòu)域可與CREB結(jié)合，協(xié)助Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核。Neh6區(qū)域的DSGIS和DSAPGS基序可以被β-TrCP識(shí)別，這對(duì)Nrf2轉(zhuǎn)錄有負(fù)面影響。Neh7域可以實(shí)現(xiàn)對(duì)RXR的識(shí)別。c. ARE位于啟動(dòng)子抗氧化和自噬相關(guān)基因的上游5'端區(qū)域，包括一個(gè)特定的DNA啟動(dòng)子結(jié)合序列。不同細(xì)胞的ARE略有不同，但共同的核苷酸序列為5'- (G/A) TGA (G/C) XXX GC (G/A) -3' (x代表任何核苷酸)。
圖2 Keap1-Nrf2-ARE通路的調(diào)控機(jī)制。在生理?xiàng)l件下，Keap1的BTB結(jié)構(gòu)域與Cul3 E3 Ub連接酶復(fù)合物結(jié)合，兩個(gè)Keap1分子通過(guò)BTB區(qū)域形成一個(gè)同源二聚體。Keap1-Keap1復(fù)合物與Nrf2在Keap1的DGR域以及Nrf2的ETGE和DLG基序以1:1的比例結(jié)合。Nrf2 Neh6區(qū)域的DSGIS和DSAPGS基序與E3 Ub連接酶結(jié)合，然后將Ub-蛋白酶體上的Ub轉(zhuǎn)移到Nrf2的ETGE和DLG基序之間的賴氨酸殘基上，誘導(dǎo)泛素介導(dǎo)的Nrf2降解。在氧化應(yīng)激條件下，IVR區(qū)域的空間構(gòu)象發(fā)生改變。Nrf2的弱、低親和基序DLG與Keap1分離。Keap1 BTB結(jié)構(gòu)域的Cys151被修飾，導(dǎo)致Keap1和Cul3的解離。游離的Nrf2易位到細(xì)胞核并與小Maf蛋白結(jié)合。Nrf2-Maf與ARE結(jié)合，增加抗氧化蛋白和II期解毒酶的轉(zhuǎn)錄激活。
圖3自噬過(guò)程。自噬可分為四個(gè)主要階段:自噬的啟動(dòng)和誘導(dǎo)、自噬體的擴(kuò)展和形成、自噬體的融合和降解、降解產(chǎn)物的循環(huán)。ULK1復(fù)合物、AMPK和PI3K復(fù)合物誘導(dǎo)自噬的啟動(dòng)。延長(zhǎng)相需要Atg12-Atg5-Atg16L和Atg8/LC3偶聯(lián)體系。溶酶體向MTOC移動(dòng)，加速了自噬體和溶酶體相互融合的效率。包括脂肪酸和氨基酸在內(nèi)的水解產(chǎn)物參與了細(xì)胞內(nèi)的循環(huán)以提供能量。
圖4 p62的基本結(jié)構(gòu)。p62通過(guò)PB1結(jié)構(gòu)域的自寡聚形成聚集體，該結(jié)構(gòu)域還與PKC、MEK5和NBR1相互作用形成異源二聚體。UBA結(jié)構(gòu)域?qū)?8-K聚泛素具有高親和力，S403和S407的磷酸化對(duì)自噬小體中泛素化底物的隔離至關(guān)重要。ZZ域與RIP1調(diào)節(jié)腫瘤壞死通路和NF-κB信號(hào)。TB結(jié)構(gòu)域與TRAF6結(jié)合，催化多聚泛素鏈的形成。NLS域和NES域分別是核定位信號(hào)和核輸出信號(hào)。PEST區(qū)域直接與UPS相互作用，而PEST的磷酸化與蛋白質(zhì)的快速降解和更新有關(guān)。LIR和KIR結(jié)構(gòu)域分別與LC3和Keap1結(jié)合并參與自噬。
圖5神經(jīng)退行性疾病中Nrf2通路與自噬之間的串?dāng)_。Nrf2在氧化應(yīng)激反應(yīng)中主要有3種調(diào)控機(jī)制。(1) Nrf2的弱、低親和力DLG基序與Keap1分離。Keap1的BTB結(jié)構(gòu)域被修改，導(dǎo)致Keap1被UPS途徑清除。(2)磷酸化p62的KIR結(jié)構(gòu)域識(shí)別Keap1的DGR結(jié)構(gòu)域，形成p62-Keap1復(fù)合物，并被UPS途徑清除。(3) p62通過(guò)將p62-Keap1和LC3組裝成LC3-p62-Keap1復(fù)合物來(lái)控制Keap1的周轉(zhuǎn)，并通過(guò)選擇性自噬降解。通過(guò)這些途徑釋放的Nrf2允許其轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，并通過(guò)Maf蛋白與ARE結(jié)合。一方面，增加SOD、CAT、Nqo1和HO1的表達(dá)可以減少ROS的積累。另一方面，促進(jìn)p62、Atg5、LC3和Sestrin2的轉(zhuǎn)錄激活自噬并降解蛋白聚集物。Nrf2通路的激活和選擇性自噬可以緩解AD的發(fā)展。
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