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Nrf2：阿爾茨海默氏病治療中的黑馬
發(fā)表于：2021-09-01 作者：admin 來源：本站 點擊量：31488
原文：Osama A , Zhang J , Yao J , et al. Nrf2: a dark horse in Alzheimer's disease treatment[J]. Ageing Research Reviews, 2020, 64.
翻譯：
阿爾茨海默氏?。ˋD）是一種年齡依賴性神經(jīng)退行性疾病，是癡呆癥的主要原因。AD的常見特征包括淀粉樣β肽（Aβ）聚集，高水平的高磷酸化tau蛋白（p-tau）和氧化還原穩(wěn)態(tài)失敗。迄今為止，所有針對Aβ和/或p-tau的藥物臨床試驗均失敗了。在AD大腦中已經(jīng)觀察到轉錄因子Nrf2（核因子-類胡蘿卜素2-p45衍生因子2）及其驅動基因（NQO1，HO-1和GCLC）的表達下降，以及Nrf2相關途徑的改變。Nrf2在維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)和調節(jié)炎癥反應中起關鍵作用。Nrf2激活還提供針對日益增加的病理（包括神經(jīng)退行性疾病）的細胞保護作用。這些證據(jù)表明，Nrf2激活可能是一種新穎的AD治療選擇。有趣的是，最近的研究還表明，Nrf2會干擾AD中的幾種關鍵致病過程，包括Aβ和p-tau途徑。本綜述旨在深入了解Nrf2在AD中的作用。此外，我們還討論了有關Nrf2激活劑用于AD治療的進展和挑戰(zhàn)。
關鍵詞：阿爾茨海默病、Nrf2、 Keap1、β淀粉樣蛋白肽、Tau蛋白、氧化應激
1. 前言
神經(jīng)元主要參與學習、思考、記憶和計劃（Carter等人，2019）。神經(jīng)退行性疾病的主要原因是多種病理因素導致神經(jīng)元功能和生存能力的逐步下降。這些多因素神經(jīng)退行性疾病正在影響全球數(shù)百萬人（Calderon-Garciduenas和Duyckaerts，2017）。神經(jīng)退行性疾病，例如阿爾茨海默氏?。ˋD），被證明與蛋白質折疊錯誤、線粒體損傷和氧化應激（OS）有關。AD是一種不可逆的進行性腦部疾病，會逐漸發(fā)生并導致記憶力減退以及思維和行為下降（Lu等人，2018年; Ossenkoppele等人，2015年）。AD被認為是癡呆癥的主要原因，這是至少兩個認知領域的逐步衰退，并導致正常的社交或職業(yè)活動殘疾。AD通常會影響老年人，但它不是正常的衰老缺陷。AD的特征包括淀粉樣β肽（Aβ）的聚集、高磷酸化tau蛋白（p-tau）的積累、炎性介質的產(chǎn)生、OS以及膽堿能、突觸和認知功能的障礙。遺傳、環(huán)境因素和一般生活方式是與AD相關的病因因素的一部分（Long和Holtzman，2019）。當前，AD影響著超過5000萬人，估計2050年全球發(fā)病率將達到1.5億（Jannat等人，2019）。由于僅部分了解AD的發(fā)病機理，因此AD的治療仍然是一個挑戰(zhàn)（Park等人，2018）。許多III期臨床試驗都失敗了，尤其是針對Aβ產(chǎn)生和聚集的試驗。由于缺乏明顯的療效，最近終止了Crenezumab（NCT03491150）、lanabecestat（NCT02972658）和solanezumab（NCT01900665）臨床試驗。在尋找治療AD的有效藥物方面的系統(tǒng)性失敗，促使科學家們探索新的策略來對抗這種疾病。
AD具有多種病理特征，例如大量的DNA氧化、嚴重的線粒體損傷、廣泛的脂質過氧化作用、高水平的神經(jīng)毒性微量元素以及Aβ的升高（Deibel等，1996; Huang等，1999; Wang等（2005年）。所有這些因素都會增加自由基或活性氧（ROS）的形成，因此，因此AD患者的大腦也受到OS的影響（圖1）。在生理條件下，ROS的動態(tài)平衡受到ROS生成系統(tǒng)和細胞抗氧化網(wǎng)絡的良好調控（Zhang等，2020; Zhang等，2019）?？寡趸烙到y(tǒng)包括幾種酶和小分子，例如血紅素加氧酶-1（HO-1）、超氧化物歧化酶（SOD）酶、谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶（CAT）、硫氧還蛋白（Trx）、硫氧還蛋白還原酶（TrxR）、谷胱甘肽過氧化物酶（Gpx）家族和NAD（P）H：醌氧化還原酶1（NQO1）。在人類AD研究中，患者的大腦顯示出核因子紅系2相關因子2（Nrf2）、SOD1、CAT和Gpx的水平降低（Chenere等，2007; Mota等，2015）。由于Nrf2和這些重要的抗氧化酶含量低，AD大腦容易受到ROS的侵害。在這種情況下，ROS對大腦造成進行性和不可逆的損害。用抗氧化劑（例如維生素E、維生素C和雌激素）直接治療可能在AD中發(fā)揮積極作用，但這些抗氧化劑在臨床患者中的療效仍處于初級階段（Feng和Wang，2012）。通過Nrf2活化來增加抗氧化蛋白的水平已被認為是實現(xiàn)神經(jīng)保護的更好方法（Buendia等人，2016; Chen和Maltagliati，2018）。 Nrf2誘導大約250個基因編碼不同的細胞保護和解毒蛋白的表達。高水平的Nrf2可以緩解AD中ROS和/或線粒體功能障礙引起的損害（Eftekharzadeh等人，2010; Fu等人，2018）。最近的研究表明Nrf2可以預防AD中某些關鍵的早期致病過程，包括Aβ（Cuadrado等，2018; Han等，2019）。已知Nrf2可通過調節(jié)抗氧化蛋白和解毒蛋白發(fā)揮神經(jīng)保護作用，但是Nrf2具有干擾β-分泌酶（BACE1）、Aβ和p-tau的能力是一個有趣的發(fā)現(xiàn)。該領域的一些優(yōu)秀的研究是由不同的研究小組進行的（Bahn等人，2019; Kitaoka等人，2019; Sotolongo等人，2020; Tang等人，2018），在此，我們旨在回顧和討論這些發(fā)現(xiàn)，以提高我們對Nrf2在AD中的作用的認識。理解Nrf2激活劑針對Aβ和p-tau的神經(jīng)保護作用的潛在機制可能有助于新AD藥物的設計和開發(fā)。此外，我們討論了Nrf2激活劑作為AD潛在療法的進展以及開發(fā)Nrf2激活劑的主要挑戰(zhàn)。在藥物設計過程中考慮這些問題可能會增加臨床試驗的成功率。
2. Nrf2的結構和功能
Nrf2蛋白是NFE2L2基因的產(chǎn)物，是研究最多的Cap 'n 'collar基區(qū)亮氨酸拉鏈(b-Zip)轉錄因子家族成員之一。Nrf2自1994年被發(fā)現(xiàn)以來，關于該轉錄因子的研究不斷增多。學術界和產(chǎn)業(yè)界之所以對Nrf2如此感興趣，很大程度上是因為Nrf2具有廣泛的功能。Nrf2是細胞保護系統(tǒng)的主要調控器，即II相解毒酶和抗氧化劑 (Cuadrado et al., 2019)。Nrf2參與NADPH、NQO1、HO-1、膽綠素還原酶、谷胱甘肽家族和硫氧還蛋白系統(tǒng)的轉錄調控。基于Nrf2的轉錄程序的細胞保護作用使細胞適應并在應激條件下生存(Hou et al., 2018)。這些功能會改變代謝和生物能，從而影響中間代謝和線粒體功能(Kitaoka et al., 2019; Merry and Ristow, 2016)。由于Nrf2調控多種抗氧化酶的表達，其抗氧化作用已被廣泛研究(Peng et al., 2015b)。Nrf2在自噬調控中的作用已經(jīng)被許多實驗室解決，他們觀察到Nrf2激活導致自噬增加，而Nrf2缺乏導致自噬減少(Frias et al., 2020; Jo et al., 2014; Komatsu et al., 2010; Pajares et al., 2018)。激活自噬可增加溶酶體介導的蛋白降解和損傷細胞器及感染微生物的清除(Tang et al., 2018)。Nrf2還參與調控另一種類型的細胞死亡，即鐵依賴性脂質過氧化引起的鐵死亡。Fenton反應(圖1c)可能部分解釋了鐵死亡對鐵的依賴，因為具有氧化還原活性的鐵池可以催化脂質過氧化，形成損傷，最終導致細胞死亡。與其他類型的細胞死亡相比，鐵死亡表現(xiàn)出獨特的形態(tài)、生化和遺傳特征(Dixon et al., 2012)。由于脂質過氧化是鐵死亡的核心特征，脂質過氧化物清除劑能有效中和鐵作用(Homma et al., 2019; Matsushita et al., 2015)。有趣的是，到目前為止，所有涉及鐵蛋白作用的基因都受到Nrf2的轉錄調控，包括但不限于Gpx4、Trx、TrxR、HO-1、鐵轉運蛋白和鐵螯合酶。因此，Nrf2可以作為這一過程的主要調控因子。人們對探索鐵死亡在包括AD在內的神經(jīng)退行性疾病中的作用越來越感興趣(Cong et al., 2019; Do Van et al., 2016)。然而，還需要進一步的研究來驗證鐵蛋白增多與神經(jīng)退行性疾病的聯(lián)系。Nrf2激活的另一個顯著特征是炎癥抑制。Nrf2的抗炎能力比預期的更為復雜, 它涉及Nrf2靶基因編碼蛋白的轉錄上調(如白三烯B4脫氫酶) 以及編碼的主要促炎細胞因子(如IL-6和IL-1b)基因的下調 (Dick et al., 2001; Kobayashi et al., 2016)。OS和炎癥是包括癌癥、心血管和神經(jīng)退行性疾病在內的大多數(shù)人類病理的主要因素(Kwak and Kensler, 2010; Liby et al., 2012)。特別是Nrf2在神經(jīng)退行性疾病、糖尿病和腎臟疾病中的作用是目前研究的熱點 (Das et al., 2013; Fao et al., 2019; Matzinger et al., 2018; Yamawaki et al., 2018)。
不幸的是，到目前為止，Nrf2結構還沒有被完全闡明。人類Nrf2蛋白由605個氨基酸組成。由七個區(qū)域組成，命名為Neh1-Neh7 (Nrf2-ECH同源性)。Neh1、Neh3和Neh6位于c端。另一方面(n -端)包含Neh2、Neh4和Neh5結構域。Neh7是由Wang等人發(fā)現(xiàn)的，與Neh5相鄰。Neh1負責DNA結合(圖2a) (Wang et al., 2013)。Neh2通過兩個基序DLG和ETGE與kelch樣ech相關蛋白1 (Keap1)相互作用(Nioi et al. , 2005)。Neh3是一個反激活區(qū)域，可以提高抗氧化反應元件(ARE)依賴基因的轉錄(McMahon et al. , 2004)。Nrf2的keap1獨立降解主要由Neh6區(qū)域介導。Neh7可能與視黃酸受體(RAR α)結合，這種相互作用導致Nrf2-ARE信號通路的負調控(Wang et al. , 2013)。
3. Nrf2調控的分子機制
Nrf2調控大量基因的表達。同時，它也是大量生物分子的靶點。這些生物分子以不同的機制調控Nrf2功能。了解Nrf2的調控機制對于開發(fā)靶向Nrf2的新分子以及了解Nrf2的治療作用具有重要意義。Kwak等人描述了Nrf2通過結合其啟動子區(qū)域激活其表達的能力，這支持了Nrf2自我調節(jié)(autoregulation)的觀點(Kwak et al., 2002; Miao et al., 2005; Rushmore et al., 1990)。Nrf2的調控除了自身調控外，主要分為keap1依賴性和非keap1依賴性調控。這里我們總結了Nrf2調控的機制(圖3)。
3.1. Keap1依賴性調控
自從Itoh等人發(fā)現(xiàn)去除Nrf2的Neh2可以增加Nrf2活性以來，Keap1在Nrf2調控中的作用就已經(jīng)為人所知(Itoh et al., 1999)。人Keap1(基因ID: 9817)蛋白是由624個氨基酸殘基組成的富含半胱氨酸的蛋白，表觀分子量為69.7 kDa (Itoh et al., 1999; Zipper and Mulcahy, 2002)。Keap1有5個具有不同功能的結構域，即N端區(qū)域(NTR;1-60)，C末端區(qū)域CTR(599-624)、BTB(61-179)（Broad complex, Tramtrack and Bric a Brac）/POZ(poxvirus and zinc finger)、雙甘氨酸重復區(qū)DGR (315-598) (double glycine repeat or Kelch repeats）及插入?yún)^(qū)IVR(180-314)（intervening region）。DGR和CTR一起被稱為Keap1-DC，它對Nrf2的Neh2結構域的結合至關重要。人Keap1含有27個半胱氨酸(Cys)殘基，但只有Cys151、Cys226、Cys273、Cys288、Cys434和Cys613對Nrf2激活至關重要(圖2b) (Bryan et al., 2013; Canning et al., 2013; Canning et al., 2015)。
Nrf2是Keap1最具特征的靶蛋白之一。在基礎條件下，Keap1有利于Nrf2蛋白酶體降解，以防止ARE的組成性激活(Huang et al., 2000)。人們提出了不同的模型來理解這種相互作用和調節(jié)的機制。鉸鏈和插銷模型是理解Keap1-Nrf2相互作用的首選模型(圖4)。在這個模型中，Nrf2 ETGE基序首先與Keap1結合。ETGE結構域采用圓轉構象，深深插入Keap1口袋，埋藏面積為420 Å2 (Abiko et al., 2011; Wakabayashi et al., 2004)。然后Nrf2通過其DLG基序在Keap1的第二個獨立結合位點結合。通過對ETGE和DLG的比較，可以看出兩者都與Kelch域口袋的底部相互作用，但其構象和親和力不同。熱力學和動力學分析表明，與Keap1-DLG較弱的相互作用相反，Keap1-ETGE是焓驅動的，開關速率較慢，導致高親和力的相互作用(Hong et al., 2005; McMahon et al., 2003; Tong et al., 2007)。在激活模式下，DLG基序與Keap1分離，導致Nrf2的釋放和轉位到細胞核(Bloom and Jaiswal, 2003)。
Nrf2的另一個keap1依賴性調控是通過p62。p62蛋白也被稱為死骨片1 (SQSTM1)。p62蛋白可以結合多聚泛素化蛋白和自噬機制，靶向自噬的特定載體(Kim et al., 2008; Pankiv et al., 2007)。Komatsu等證明p62通過與Keap1的相互作用破壞Keap1-Nrf2系統(tǒng)(Komatsu et al., 2010)。p62通過其與Nrf2 ETGE相似的STGE基序與Keap1結合。p62高表達導致Nrf2水平升高，反之亦然(Copple et al., 2010)。另一項研究也表明，p62的積累導致Nrf2的一致激活(Inami et al., 2011)。為了理解p62-Keap1結合模型，人們做了很多有價值的工作，結果證明該模型與Keap1的CTR重疊(Komatsu et al., 2010;Lau et al., 2010)。基于編碼p62蛋白的mRNA的存在，缺失了與Keap1結合所必需的Keap1相互作用區(qū)域，Kageyama等人證明，該變異增加了Keap1的數(shù)量，并增強了Nrf2的泛素化。本研究表明，p62 pre-mRNA的剪接負調控小鼠Keap1-Nrf2通路(Kageyama et al., 2018)。然而，關于人類的這種變異還需要更多的研究。BRCA2（PALB2）的伴侶和定位劑二肽基肽酶3（DPP3）也通過ETGE基序與Keap1相互作用，激活Nrf2（Hast et al., 2013）。
3.2. 非Keap1依賴性調控
Nrf2中非keap1依賴性調控也被幾個研究小組研究過。在這方面，Nrf2的翻譯后修飾，包括磷酸化、泛素化和乙酰化得到了很好的表征。Nrf2含有許多蘇氨酸、絲氨酸和酪氨酸殘基，是潛在的磷酸化位點。幾種激酶可能磷酸化Nrf2并調節(jié)其活性(Rojo et al., 2012)。蛋白激酶C (PKC)磷酸化Nrf2的Ser40 (Neh2)，從而破壞與Keap1的關聯(lián)，進而促進Nrf2轉位進入細胞核(Huang et al., 2002)。最近, Fao等人表明，Nrf2在Ser40被c-src依賴激酶磷酸化激活，在Tyr311通過PKCδ磷酸化 (Fao et al ., 2019)。酪蛋白激酶II (CK2)在Nrf2特異序列中也有大約13個潛在的磷酸化位點(Neh4和Neh5) (Pi et al., 2007)。這些位點的磷酸化與易位進入細胞核的Nrf2相連接。研究發(fā)現(xiàn)，在CK2抑制劑存在的情況下，Nrf2易位降低(Patrick L. Apopa et al., 2008)。類似地，蛋白激酶R (PKR)樣內質網(wǎng)激酶(PERK)介導了Thr80的磷酸化并有利于Nrf2的激活(Cullinan and Diehl, 2004)。糖原合成酶激酶-3蛋白(GSK-3磷酸化)使Nrf2的Ser335和Ser338位點磷酸化并導致其降解(Rada et al., 2011; Rojo et al., 2008)。GSK-3蛋白還作用于酪氨酸激酶Fyn的上游，可以磷酸化Nrf2中的Tyr568，導致Nrf2的核積累(Jain and Jaiswal, 2006,2007)。幾種絲裂原活化蛋白(MAP)激酶也顯示了不同Nrf2絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化能力。雖然，c-Jun n末端激酶1 (JNK1)和細胞外調節(jié)蛋白激酶2 (ERK2)介導的磷酸化誘導了Nrf2的激活，但p38通過磷酸化Nrf2促進keap1和Nrf2之間的聯(lián)系，從而阻止其核易位(Keum et al., 2006)。Hrd1 (E3泛素連接酶)又稱滑膜泛素連接酶。Hrd1對內質網(wǎng)相關降解(ERAD)至關重要。Wu等證明Hrd1與Nrf2的Neh4-5結構域相互作用導致Nrf2泛素化并降解(Wu et al., 2014)。CBP/p300介導的Nrf2賴氨酸殘基乙?；?Neh3/Neh1)增加了Nrf2的轉錄功能。另一方面，sirt1介導的去乙?；档土薔rf2信號(Kawai et al., 2011)。
核因子-κB (NF-κB)蛋白是一組結構相關轉錄因子，參與了大量的細胞過程。NF -κB可以抑制相關基因的轉錄,而幾個Nrf2催化劑有能力抑制NF-κB活動(Nair et al ., 2008)。大量證據(jù)還表明，Keap1通過與IκB激酶-β（IKKβ）結合而在NF-κB通路的負調控中起作用，并賦予NF-κB泛素化和降解作用（Kim et al., 2010; Lee et al., 2009）。
Bach1是b-Zip轉錄因子的一部分，與小Maf蛋白形成異源二聚體，并作為Nrf2的誘導抑制因子。Bach1/Maf和Nrf2/Maf競爭性地共享同一結合位點(ARE的順式元素)。因此，靶基因的抑制或激活可能發(fā)生。然而，Bach1的亞細胞定位依賴于Nrf2核輸出信號和Crm1, Crm1由氧化還原敏感的細胞質定位信號(CLS)驅動，因此Bach1主要由Nrf2調控(Silva-Palacios et al., 2018)。Poganik等人引入了一種新的直接調控Nrf2 mRNA的轉錄后模型。他們報告說，HuR和AUF1 ，兩個mRNA結合蛋白質,可以通過靶向mRNA 3?utr專門調控Nrf2。他們的結果表明，HuR可以促進Nrf2 mRNA的成熟并促進其核輸出，而AUF1則穩(wěn)定Nrf2 mRNA。他們還發(fā)現(xiàn)，Nrf2活性的轉錄后調控在整個脊椎動物水平上是保守的(Poganik et al., 2019)。這一發(fā)現(xiàn)為發(fā)現(xiàn)更多遵循類似調控機制的Nrf2調控因子奠定了基礎。
幾項研究已經(jīng)鑒定出一些通過將Nrf2的mRNA靶向3´UTR來調節(jié)Nrf2表達的MicroRNA。這些Nrf2負調節(jié)劑的例子包括但不限于miR28，miR-153，miR-142-5p，miR-27a和miR-144(Narasimhan et al., 2012; Yang et al., 2011)。然而，Nrf2與其靶向miRNA之間的關系是高度復雜的，需要更多的研究來發(fā)現(xiàn)其他參與Nrf2調控的miRNA及其調控機制以及這種調控在AD發(fā)病機制中的作用。綜合來看，參與Nrf2調控的多個因素可以為理解Nrf2參與不同疾病和紊亂的治療提供線索(Cuadrado et al., 2019)。
4. Nrf2在AD中的作用
Nrf2在機體的不同器官(包括大腦)中表達，表達水平各不相同。代謝器官，特別是那些暴露于外部環(huán)境的親電性和氧化劑的器官(如肺和腸) Nrf2水平較高(Riedl et al., 2009)。對人和小鼠大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的研究表明Nrf2在神經(jīng)元、星形膠質細胞和膠質細胞中表達(Cuadrado et al., 2019; Shih et al., 2003)。然而，Nrf2在星形膠質細胞中的表達高于神經(jīng)元。微陣列分析顯示Nrf2激活誘導星形膠質細胞中大量Nrf2靶基因(Lee et al., 2003)。在幾種神經(jīng)退行性實驗模型中，星形細胞Nrf2表達具有神經(jīng)保護作用(Cuadrado et al., 2018; Yu et al., 2019)。Nrf2及其驅動基因(NQO1、HO-1和GCLC)的表達在老年人和AD大腦中均出現(xiàn)下降(Silva-Palacios et al., 2018)。Nrf2通過保護性NFE2L2單倍型的高表達可防止神經(jīng)退行性變。另一方面，Nrf2表達降低與AD風險增加或早期發(fā)病相關(von Otter et al., 2010)。Nrf2介導的抗氧化反應的抑制被發(fā)現(xiàn)是導致過早衰老表型的關鍵因素(Kubben et al., 2016)。 Rojo等比較了Nrf2缺乏、衰老和AD小鼠模型之間的差異。他們發(fā)現(xiàn)了Nrf2缺乏和衰老之間的7個共同特征，以及Nrf2缺乏和AD之間的10個共同特征。作者還注意到不溶性p-tau蛋白和缺氧小鼠nrf2水平升高(Rojo et al., 2017)。本研究提示Nrf2缺乏與衰老/AD密切相關。這些來自不同實驗室的發(fā)現(xiàn)支持了Nrf2可能在腦衰老和AD之間起分子連接作用的假設(Branca et al., 2017)。大量證據(jù)表明Nrf2功能障礙在認知障礙和AD的發(fā)病機制中起作用。Branca等人報道，在AD的APP/PS1小鼠模型中，Nrf2的缺失顯著加重了包括空間學習和記憶在內的認知缺陷(Branca et al., 2017)。Nrf2還可以通過上調參與大自噬(Pajares et al., 2016)和伴侶蛋白介導的自噬(Pajares et al., 2018)的基因表達，幫助清除淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)和tau蛋白。這些發(fā)現(xiàn)可能解釋了在app損傷和tau損傷的神經(jīng)元中Nrf2水平的升高，并提示Nrf2激活可能在疾病進展的輕度認知障礙階段很快發(fā)生。最近，Uruno等人證明Nrf2的誘導通過抑制OS和神經(jīng)炎癥改善了AD小鼠模型中的認知障礙(Uruno et al., 2020)。幾種Nrf2激活因子在終止AD關鍵發(fā)病機制中也顯示出強大的活性，包括抗抑郁藥物和p-tau，以及對神經(jīng)炎癥和線粒體功能的調節(jié)(Ikram et al., 2019; Yang et al., 2018)。這些結果提示Nrf2是AD重要的治療靶點。除了已知的Nrf2在維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中的作用外，我們還進一步了解了Nrf2與AD關鍵發(fā)病因子的相互作用。
4.1. Nrf2和Aβ
AD的組織學特征是細胞外Aβ斑塊沉積(Irvine et al., 2008;Selkoe and Hardy, 2016)。Aβ肽類(~4 kDa)是通過內含體中BACE1和γ-分泌酶順序裂解APP產(chǎn)生的。BACE1是產(chǎn)生Aβ的必要物質，少量的BACE1的增加會引起一個顯著的產(chǎn)量的增加。與分泌酶不同的是，BACE1的水平在AD中被發(fā)現(xiàn)升高，這表明它在AD中對細胞積累起重要作用。因此，BACE1的抑制劑正被尋求作為AD的治療藥物。Aβ易于聚集成寡聚體、原纖維和纖維形式的β-折疊構象。Aβ聚集的過程也涉及ROS的產(chǎn)生，導致神經(jīng)元死亡(Andersen, 2004; Klein et al., 2001)。在AD大腦中發(fā)現(xiàn)了幾種形式的Aβ，尤其是疏水性較強的Aβ，例如Aβ42，由于其高聚集傾向(Thal et al., 2015)。有證據(jù)表明，不同池中的Aβ數(shù)量和溶解度可能與疾病狀態(tài)密切相關(Murphy and LeVine, 2010)。一些靶向聚合體或抑制BACE1的藥物正在臨床試驗中，但它們都沒有獲得美國食品和藥物管理局(FDA)的批準(Dong et al., 2019; Yan and Vassar, 2014)。
APP/PS1小鼠Nrf2基因刪除顯示炎癥反應增強和細胞內APP、β42和β40水平升高。Nrf2缺失的APP/PS1小鼠神經(jīng)元也顯示了核內體、溶酶體和多泡小體的增加(Joshi et al., 2015)。這些發(fā)現(xiàn)為Nrf2在APP/ Aβ處理和積累以及自噬功能障礙中的作用提供了線索。Kerr等人首次提供了體內證據(jù)，證明通過特異性抑制Keap1激活Nrf2，可以防止AD誘導的Aβ42神經(jīng)元毒性(Kerr et al., 2017)。Yu等人的一項研究也顯示，當他們在AD動物模型中使用Nrf2激活劑isoastilbin時，也有類似的效果，并且他們發(fā)現(xiàn)Aβ42和 p tau表達降低(圖4) (Yu et al., 2019)。Li等證明西格列汀和槲皮素的結合能夠降低大鼠的Aβ表達水平(Li et al., 2019b)。Bahn等發(fā)現(xiàn)Nrf2通過與BACE1啟動子中的AREs結合抑制了AD動物模型中BACE1的表達。Nrf2的激活減少了BACE1轉錄和Aβ產(chǎn)物的生成，并改善了認知缺陷。另一方面，Nrf2的缺失增加了BACE1的表達和Aβ生成，并加重了認知障礙。作者還證明，Nrf2對BACE1的調控與ROS抑制無關(Bahn et al., 2019)。本研究不僅將Nrf2的功能與Aβ生成聯(lián)系起來，還揭示了Nrf2抑制BACE1的能力。有趣的是，該研究還發(fā)現(xiàn)Nrf2并不影響細胞分泌酶的活性或表達。這些發(fā)現(xiàn)表明，Nrf2的激活不僅抑制了Aβ的產(chǎn)生，還減少了其聚集所造成的損傷。
4.2. Nrf2和p-tau
MAP家族特別是MAP2和tau調節(jié)神經(jīng)元中不同的細胞骨架過程(Amos and Schlieper, 2005)。Tau蛋白是一種55 kDa的蛋白，具有85個以上的翻譯后修飾位點，如磷酸化、乙酰化和泛素化。雖然其正常功能需要翻譯后磷酸化，但過度磷酸化會破壞其活性(Li and Gotz, 2017; Marciani, 2018; Morishima-Kawashima and Ihara, 2002)。Tau病理的發(fā)生是由于tau蛋白的錯誤折疊導致了β-折疊纖維的產(chǎn)生和積累。Tau病理和β-折疊纖維積累是包括AD在內的幾種神經(jīng)疾病的主要發(fā)病機制(Almansoub et al., 2019)。Tau病理被認為是AD認知能力下降和神經(jīng)退行性變的主要驅動因素(Aschenbrenner et al., 2018; Hanseeuw et al., 2019)。
Jo等研究表明Nrf2可通過誘導核點蛋白52 (nuclear dot protein 52, NDP52)降低p-tau水平。NDP52是一種自噬接頭蛋白，其誘導可促進自噬介導的p-tau蛋白降解(圖4)。Jo等人也揭示了Nrf2活性的機制，即Nrf2與NDP52啟動子中的AREs結合(Jo et al., 2014)。最近，Tang等報道Nrf2調節(jié)選擇性自噬過程，可促進tau的清除。他們觀察到，與年輕的Nrf2−/−動物相比，衰老Nrf2−/−動物中BAG3、NBR1、NDP52和p62的表達顯著減少，這表明Nrf2在衰老過程中對維持這些基因的適當表達水平起著關鍵作用(Tang et al., 2018)。許多Nrf2激活劑，包括蘿卜硫素(Kim et al., 2013)、苯福硫胺(Tapias et al., 2018)、富馬酸二甲酯(Cuadrado et al., 2018)、大蒜素(Zhu et al., 2015)和mini-GAGR (Murphy et al., 2018)對p-tau AD動物模型顯示出積極作用。
4.3. Nrf2 和神經(jīng)炎癥
小膠質細胞是常駐的免疫巨噬細胞樣細胞，它們在急性感染和/或毒性損傷時的激活可能有助于清除受損細胞。在AD中，小膠質細胞可能被長期激活，導致有害的促炎細胞因子和ROS/RNS的持續(xù)分泌。這些過程導致神經(jīng)退行性變。神經(jīng)膠質細胞,位于Aβ斑塊區(qū)域，表明激活的NF-κB、以及促炎細胞因子和趨化因子水平增加( Yin et al., 2017)。同時, NF-?B被發(fā)現(xiàn)調控BACE1表達 (Chen et al., 2012)。Terada等觀察到tau病理與AD患者海馬旁神經(jīng)炎癥呈正相關(Terada et al., 2019)。提示神經(jīng)炎癥可能在AD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。因此，神經(jīng)炎癥的消除可以減輕AD的進展和癥狀(Yang et al., 2019)。Nrf2和NF -κB之間的關系呈現(xiàn)出“陰陽”的概念。盡管在操作系統(tǒng)被激活,Nrf2誘導基因主要是抗炎(包括CD36、IL-17D)而NF –κB作用相反(增加IL-6、COX2和iNOS)。在這種背景下，Nrf2和NF-κB之間的不平衡對AD的發(fā)病機制可能是重要的。因此，Nrf2可能在AD中發(fā)揮重要的抗神經(jīng)炎癥作用。幾項研究證實，Nrf2的激活可以抑制因注射Aβ 或tau引起的小膠質細胞激活，并進一步保護小膠質細胞引發(fā)的神經(jīng)元丟失(Seo et al., 2017; Tom et al., 2019)。
4.4. Nrf2和線粒體功能障礙
線粒體是一種靈活的超微結構細胞器，它控制著關鍵分子元素的生物能量。線粒體的整體動態(tài)本質是由融合和分裂活動控制的。通過抑制線粒體破碎，融合可以延遲細胞凋亡的發(fā)生，而分裂對細胞凋亡有積極作用。線粒體質量控制過程中的失衡可能導致線粒體功能障礙(Cheng and Bai, 2018)。在Nrf2敲除小鼠中觀察到年齡相關的線粒體OS以及線粒體功能受損，而Nrf2的激活增強了線粒體功能(Kitaoka et al., 2019)。Nrf2激活可增加蛋白酶體活性，而蛋白酶體活性可增強動力蛋白相關蛋白1 (Drp1)的降解(Sabouny et al., 2017)。Drp1是dynamin超家族的一種大型GTPase，它是促凋亡蛋白Bax線粒體轉位所必需的酶，并與之結合以增強線粒體外膜通透性。這一過程促進細胞色素c的釋放(Wang et al., 2015)。限制線粒體分裂蛋白的水平有利于線粒體低灌注，從而維持線粒體質量控制系統(tǒng)的功能。 Nrf2還控制線粒體抗凋亡蛋白(如Bcl-2和Bcl-xL)的表達、線粒體動力學、包括生物發(fā)生，通過與過氧化物酶體增殖激活受體-r 共激活劑 1a (PGC-1a)相互作用，以及通過p62依賴、PINK1/ parkino不依賴機制實現(xiàn)線粒體自噬(East et al., 2014; Merry and Ristow, 2016; Navarro et al., 2017)。AD早期出現(xiàn)線粒體功能障礙，導致神經(jīng)退行性變，促進突觸損傷和細胞凋亡。 、APP、Aβ和p-tau可干擾線粒體成分，導致線粒體動力學異常、生物發(fā)生缺陷、自噬減少、線粒體自噬減少、ATP生成受損和氧化損傷增加(Reddy et al., 2018; Sotolongo et al., 2020)。Nrf2可能減少這些損傷并維持線粒體功能(Fu et al., 2018)。Nrf2介導的Drp1降低也可能降低p-tau水平，提高突觸活性(Cieri et al., 2018; Kandimalla et al., 2016)。幾種Nrf2激活因子能夠改善不同AD模型中的線粒體功能障礙(Li et al., 2019a; Liu et al., 2019; Tapias et al., 2018)。Nrf2在線粒體保護中的作用是Nrf2激活在AD治療中的額外有益作用。
4.5. Nrf2和乙酰膽堿酯酶
乙酰膽堿(ACh)是一種有機神經(jīng)遞質，在神經(jīng)末梢釋放。乙酰膽堿乙酰轉移酶(ChAT)以乙酰輔酶A和膽堿為底物在膽堿能神經(jīng)元中產(chǎn)生乙酰膽堿。乙酰膽堿釋放后，通過乙酰膽堿酯酶代謝成膽堿和醋酸鹽。在AD患者的大腦中，已經(jīng)觀察到ACh水平的缺乏和AChE水平的增加。乙酰膽堿酯酶通過快速水解乙酰膽堿能突觸終止沖動傳遞。因此，最小化活性乙酰膽堿酯酶水平可以增強膽堿能功能(Osama et al., 2017; Tabet, 2006)。盡管目前尚無明確證據(jù)表明Nrf2對乙酰膽堿酯酶(AChE)的影響，但在AD小鼠模型中，幾種Nrf2激活因子均對膽堿能功能產(chǎn)生了積極影響，并降低了乙酰膽堿酯酶(AChE)水平，顯著提高了乙酰膽堿酯酶(ACh)和乙酰膽堿酯酶(ChAT)水平(Huanga et al., 2019; Li et al., 2019c; Yu et al., 2019)。假設這些作用可能，至少部分是由于Nrf2的抗凋亡作用，可以防止神經(jīng)元的丟失。Zhang等人發(fā)現(xiàn)，在細胞凋亡開始時，在細胞質中發(fā)現(xiàn)AChE，然后在細胞核或凋亡小體中發(fā)現(xiàn)，并細胞死亡。此外，凋亡細胞中表達的AChE與突觸型AChE相同。此外，使用藥理抑制劑或反義(阻斷乙酰膽堿酯酶的表達)來最小化活性乙酰膽堿酯酶的水平，可以抑制細胞凋亡。他們的結論是，AChE可能是細胞凋亡的標志物和調節(jié)因子(Zhang et al., 2002)。這可能解釋了AD大腦中大量細胞凋亡導致的高水平疼痛。Nrf2的抗凋亡作用可減少膽堿能神經(jīng)元的丟失，從而維持乙酰膽堿的產(chǎn)生，使神經(jīng)認知能力下降最小化。然而，對于AChE在細胞凋亡中的作用以及Nrf2的激活對AChE功能和分布的影響還需要進一步的研究。
5. AD中Nrf2相關通路的研究
一些研究也對AD中的Nrf2相關通路進行了研究，我們在此簡要回顧其中一些。p62是一種細胞內信號蛋白，參與多種細胞環(huán)境。它還通過自噬參與聚合蛋白的降解。對p62基因敲除小鼠的研究表明，它們表現(xiàn)出一些類似AD的神經(jīng)退行性變特征。鄭等研究了AD模型中p62- Keap1-Nrf2關系，發(fā)現(xiàn)AD中p62水平降低可能與Nrf2水平降低有關。作者還推測這可能是AD中tau蛋白過度磷酸化和隨后的神經(jīng)元損傷的原因(Zheng et al., 2012)。Gu等人指出，Nrf2介導的p62信號通路的激活可通過激活自噬來改善由Aβ42損傷引起的細胞死亡(Gu et al., 2018)。Xu等人證實了p62在自噬介導的對致病性微管相關蛋白tau (MAPT)的清除中發(fā)揮的作用，并通過MAPT阻斷了神經(jīng)纖維纏結的積累和病理擴散。他們還表明，p62介導的對不溶性突變體MAPT的清除是非泛素依賴的(Xu et al., 2019)。
多項研究表明，AD中GSK-3β水平升高(Leroy et al., 2007; Ochalek et al., 2017; Pei et al., 1997; Virpi Talman et al., 2016)。GSK-3β抑制蛋白活性的增加直接參與了磷酸化導向的Nrf2的降解(圖4)。GSK-3β抑制蛋白的基因過表達導致神經(jīng)元丟失和記憶缺失，并參與了小鼠tau蛋白的過度磷酸化(Engel et al., 2006; Hernandez ´ et al., 2002)。Tideglusib是GSK-3β抑制因子，能夠通過最小化tau蛋白磷酸化和減少淀粉樣蛋白沉積來改善認知(Sereno et al., 2009)。Cuadrado等研究表明，富馬酸二甲酯可以抑制Keap1和GSK-3β細胞，使Nrf2發(fā)生兩層上調。在動物模型中，富馬酸二甲酯能夠顯著降低tau蛋白磷酸化，并提供抗tau病理的保護(Cuadrado et al., 2018)。這一發(fā)現(xiàn)鼓勵了對這類化合物的研究，它們可能對神經(jīng)退行性疾病的治療有用。
p38 MAPK在AD中被證實上調(Sheng et al., 2001; Sun, 2003)。除了降低Nrf2核易位外，它還可能通過OS激活Aβ(Giraldo et al., 2014)。最近的研究表明，p38的減少和Nrf2水平的升高可以消除SH-SY5Y細胞的神經(jīng)毒性和OS (Amin et al., 2017a; Bach et al., 2011)。AD中NF-κB-p65的水平增加 (Terai et al ., 1996)。幾個不同的AD模型研究表明，抑制NF-κB可以調控的表達Nrf2(Zhao et al., 2018)。Tom等人表明gedunin, Nrf2活化劑，可以通過抑制NF-κB及減少神經(jīng)炎癥，保護細胞免受Aβ42 寡聚體誘導的神經(jīng)毒性 (Tom et al., 2019)。
6. Nrf2激活劑用于AD臨床試驗的影響
自1906年AD出現(xiàn)以來，只有五種藥物被FDA批準用于臨床治療。這五種藥是他克林，利瓦斯明，加蘭他敏，多奈哌齊和美金剛胺。前四種藥物是乙酰膽堿酯酶抑制劑，可以改善認知功能。美金剛胺是一種n -甲基- d -天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑，常用于治療中重度AD。然而，這些藥物都不能終止或逆轉AD的潛在進展。它們只能暫時改善認知功能。他克林、利瓦斯明、加蘭他明和多奈哌齊會產(chǎn)生一系列副作用，包括嘔吐、腹瀉、惡心、頭暈和頭痛。不幸的是，到目前為止，在AD的臨床試驗中，沒有一種影響到Aβ和/或p-tau的分子顯示出顯著的作用(Dong et al., 2019)。所有這些因素使得新的治療策略更具吸引力。如上所述，Nrf2可以通過直接和間接的方式干預Aβ和p-tau。此外，大多數(shù)AD患者是老年人，因此他們也可能患有與AD有共同病理特征的其他年齡相關疾病。Nrf2激活被發(fā)現(xiàn)對幾種與年齡相關的疾病有用(Deshmukh et al., 2017; Francisqueti-Ferron et al., 2019; Silva-Palacios et al., 2018)。多靶點治療被提出，因為乙酰膽堿酯酶抑制劑與抗氧化劑或NMDA受體拮抗劑一起給予治療效果更好(Mangialasche et al., 2010)。但在這種情況下，使用單一的Nrf2激活劑可能對幾種疾病有益，因此可能降低成本、副作用和藥物相互作用。許多天然和合成的Nrf2激活劑已在神經(jīng)退行性疾病的臨床前研究或模型中得到驗證(Dinkova-Kostova et al., 2017; Hou et al., 2019; Hou et al., 2018; Peng et al., 2019a; Peng et al., 2019b; Peng et al., 2015c; Yao et al., 2015)。最近，一些納入AD臨床試驗的藥物被證實能夠激活Nrf2(表1)。2014年，苯磷硫胺被納入AD臨床試驗(NCT02292238)。4年后，Tapias等人在體內模型中表明，苯磷硫胺可以激活Nrf2，并降低P301S AD中的p-tau (Tapias et al., 2018)。同樣，DL-3-n-丁基苯酞(NCT02711683) (Qi et al., 2018)和培哚普利 (NCT02085265) (Kamel et al., 2020)的Nrf2激活作用最近也得到了驗證。從十字花科植物中分離得到的蘿卜硫素進入AD臨床試驗(NCT04213391)可能是開發(fā)基于Nrf2激活的AD新藥的一個很好的步驟。蘿卜硫素通過與Keap1的Cys151相互作用，也是Nrf2親電激活劑。蘿卜硫素具有神經(jīng)保護作用，干預Aβ 和 p tau，并改善急性AD的認知缺陷(Kim et al., 2013)。目前，蘿卜硫素有20多個臨床試驗。然而，蘿卜硫素在室溫下相對不穩(wěn)定。因此，它的合成類似物SFX-01 (Evgen Pharma開發(fā)的藥物)備受關注。這些能力使蘿卜硫素及其類似物成為AD藥物開發(fā)的重要藥物。
在FDA批準的可激活Nrf2的藥物中，富馬酸二甲酯被認為是治療AD的有前景的藥物。2013年，富馬酸二甲酯被FDA批準用于治療多發(fā)性硬化癥。富馬酸二甲酯在不同的AD模型中均表現(xiàn)出積極的作用，因此被認為是藥物重新定位的最佳選擇之一?？偟膩碚f，半不飽和羰基化合物是研究最多的可激活Nrf2的化合物。這類化合物被設計通過與Keap1的半胱氨酸殘基結合來干擾Keap1- nrf2的相互作用(Peng et al., 2015b)。幾種自然產(chǎn)生的藥劑，包括xanthohumol, 6 dehydrogingerdione, cardamonin, 6-shogaol and chlorogenic acid,屬于這一家族，并已被我們實驗室鑒定為通過激活Nrf2來發(fā)揮神經(jīng)保護能力(Bai et al., 2019; Peng et al., 2017; Peng et al., 2015a; Yao et al., 2014; Yao et al., 2019)。
目前，有數(shù)十種天然和合成的Nrf2激活劑可用于進一步深入研究其在AD模型中的作用。表2總結了參與不同臨床試驗并證明對AD動物模型有積極影響的化合物。這些化合物可能是藥物開發(fā)的良好起點?；瘜W修飾也可能有助于改善這些分子的化學和藥理特性，從而達到更好的治療效果。
7. Nrf2治療AD藥物開發(fā)的挑戰(zhàn)
找到一種有效且相對安全的治療AD的新藥不是一件容易的事。此外，通過靶向Nrf2探索這種新的治療方法也使這項任務更具挑戰(zhàn)性。在這里，我們討論幾個問題和考慮開發(fā)Nrf2激活劑的臨床應用。
7.1. 選擇性
Nrf2抑制蛋白Keap1是一個富含Cys的蛋白，有27個Cys殘基，其中一些高度反應。Keap1的這一特性促使許多研究小組設計能夠與Keap1的Cys殘基硫醇基團形成共價鍵的共價抑制劑。在27個Cys殘基中，Cys151、Cys273和Cys288得到了高度關注。Cys273和Cys288在基礎和應激條件下Nrf2的調控中都發(fā)揮了重要作用。另一方面，Cys151在應對各種應激條件方面具有重要作用(Suzuki et al., 2013)。許多親電物種能夠與Keap1的Cys殘基形成共價相互作用，從而抑制Nrf2泛素化。用親電修飾劑隨機或選擇性地攻擊Keap1 Cys殘基被稱為“半胱氨酸編碼”(Cuadrado et al., 2019; Fao et al., 2019)。不幸的是，攻擊Keap1中的Cys殘基并不意味著不能攻擊其他富含半胱氨酸的蛋白質。這種缺乏選擇性是開發(fā)共價Keap1修飾劑的主要問題(Suzuki et al., 2013)。人們正在努力發(fā)現(xiàn)更有選擇性的化合物，蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)抑制劑也在選擇之列。CPUY192018是通過阻斷Nrf2和Keap1的PPI來激活Nrf2的最成功的例子之一(Lu et al., 2019)?；诟蟮闹Ъ芙Y構可能提供更好的選擇性的假設，也研究了五環(huán)邁克爾受體的氰烯酮三萜。Bardoxolone甲基就是這類化合物的一部分，目前正在進行四個臨床試驗(Cuadrado et al., 2019)。Nrf2可以通過其他不同的策略激活，從而提高選擇性。Nrf2激活的途徑之一是使用競爭性抑制劑攻擊Keap1-Nrf2的結合位點。這一策略是實用的和高度選擇性的，因此它可能是減少副作用的一個很好的替代方法(Madden and Itzhaki, 2020)。另一種方法是靶向BTB結構域中的Keap1二聚作用(Zhuang et al., 2009)。BTB結構域也參與了Keap1和Cul3的結合，針對這種Keap1-Cul3的相互作用也可能導致Nrf2的激活。Keap1 IVR域中發(fā)現(xiàn)的靶向3-box也可能干擾Keap1和Cul3的結合(Cleasby et al., 2014)。用新的激活劑靶向這些不同的位點可以增加選擇性，從而減少潛在藥物的副作用。此外，靶向激活AD腦損傷區(qū)域的Nrf2是另一個挑戰(zhàn)，進一步修飾這些化合物可能是提高選擇性的一個有希望的策略。
7.2. AD實驗模型
在藥物發(fā)現(xiàn)領域，實驗模型是非常重要的。這些模型在闡明疾病的病理生理原因和測試候選藥物的臨床前后果方面至關重要。在AD的案例中，對多個物種的神經(jīng)病理學調查顯示，AD似乎是人類特有的(Drummond and Wisniewski, 2016)。對包括恒河猴、狒狒、黑猩猩、食蟹獼猴和狐猴在內的非人類模型的研究表明，它們具有AD的一些共同特征，有助于解開AD病理的一些模糊之處。不幸的是，在這些模型上進行研究可能會花費很長時間，畢竟，它們可能會隨著它們表現(xiàn)出的特征而變化，因為它們沒有受到人類AD的折磨。AD治療學的臨床試驗失敗率極高(>99%)，這可能與缺乏合適的AD動物模型有關。在人工誘導非人類AD模型方面已經(jīng)做了很多工作，包括注射模型和轉基因小鼠模型。這些模型可用于數(shù)百種潛在藥物的AD臨床前測試(Esquerda-Canals et al., 2017)。不幸的是，在數(shù)百種臨床前成功的候選藥物中，只有5種獲得了市場批準。在臨床試驗中未能取得成功可能是因為這些模型考慮了毒性APP和/或tau突變蛋白的表達，而忽略了其他與疾病相關的下降，如與Nrf2相關的穩(wěn)態(tài)功能。雖然Nrf2敲除小鼠表現(xiàn)出與衰老和AD共同的特征(Rojo et al., 2017)，但該模型是否與AD病理更相關還需要更多的努力來驗證。
7.3. 能否通過血腦屏障(BBB)
為了達到預期的藥理學效果，需要考慮許多候選藥物的因素，包括生物利用度、代謝穩(wěn)定性、溶解性和細胞通透性。此外，藥物應表現(xiàn)出更多的親和力，或至少可以達到目標器官的足夠劑量(Krogsgaard-Larsen et al., 2005)。因此，要激活AD神經(jīng)元中的Nrf2，藥物必須以足夠的濃度到達AD腦損傷區(qū)，使其能夠發(fā)揮作用。血腦屏障是保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)的天然屏障，通過阻止神經(jīng)毒性血漿物種、血細胞和病原體進入大腦。不能跨越血腦屏障的藥物獲得AD臨床試驗成功的機會很低(Pardridge, 2019)。細胞培養(yǎng)研究可能大大高估了測試藥物的活性。由于生物利用度低，這些候選藥物在臨床試驗中可能表現(xiàn)出令人失望的結果。分子量< 450道爾頓、極性表面積< 90 A2和氫鍵供體數(shù)< 3的藥物更有可能穿透血BBB (Hanson and Frey, 2008)。這些通用指南為中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的設計和開發(fā)提供了初步考慮。然而，血腦屏障的侵徹能力必須通過實驗來評估。因此，需要在親脂性、分子構型和分子大小之間實現(xiàn)神奇的結合和平衡，才能使藥物通過血腦屏障。
7.4. 確定給藥方案
關于Nrf2激活治療AD的另一個考慮是，老年人和不太健康的受試者對Nrf2激活劑的反應降低(Hammer et al., 2018)。因此，給藥劑量必須考慮患者的年齡和健康狀況。由于Nrf2與其靶基因相比半衰期較短，因此也應通過分析藥物分布和Nrf2基因在可接近細胞或組織中的表達特征來間接推斷合適的給藥方案(Cuadrado et al., 2019)。
8. 結論
Nrf2是抗氧化系統(tǒng)的主要控制器，負責II期相解毒酶和抗氧化蛋白的組成性表達。大量的生物分子參與了Nrf2的調控，這說明了這一途徑的復雜性。AD中Nrf2、p62 GSK-3β,p38和NF -κB-p65水平發(fā)生改變。大量證據(jù)表明，Nrf2具有在各種AD模型中降低OS、炎癥和線粒體功能障礙的能力(圖5)。有趣的是，Nrf2也可以抑制BACE1的表達，并改善Aβ介導的毒性。Nrf2還能降低AD模型中p-tau和認知缺陷的水平。幾種Nrf2激活劑在不同的AD動物模型中顯示了良好的效果。基于這些研究，以及并沒有FDA批準新的藥物用于臨床治療AD， Nrf2激活似乎是一種新穎而有吸引力的治療方法。然而，我們并不認為這種治療方法會比其他方法更容易。Nrf2通路本身復雜，可通過不同的機制激活。此外，Nrf2激活劑的開發(fā)也面臨著許多挑戰(zhàn)。用親電共價抑制劑攻擊Keap1中的Cys殘基是Nrf2激活的最常見機制。不幸的是，這種類型的活化劑通常缺乏選擇性。低選擇性藥物有望引起廣泛的副作用。有幾種方法可以用來解決這個問題，包括開發(fā)PPI抑制劑和非共價Keap1抑制劑。缺乏理想的AD動物模型是AD藥物發(fā)現(xiàn)領域的另一個障礙。到目前為止，關于Nrf2激活在人類AD大腦中的作用的信息很少。最近在AD臨床試驗中加入的Nrf2激活因子，如蘿卜硫素，可能為Nrf2激活在AD中的結果提供有價值的信息。
圖1：AD大腦遭受氧化應激。(a)線粒體功能障礙可能導致ROS產(chǎn)生增加和細胞凋亡。(b)在AD中觀察到廣泛的脂質過氧化。(c) AD大腦還顯示出神經(jīng)毒性微量元素如鐵、鋁、銅和汞的水平提高，這些元素可誘導自由基的形成(鐵就是一個例子)。(d)高水平Aβ(Aβ42;PDB: 5kk3)也可促進AD腦內的氧化應激。(e)高水平的ROS可能攻擊DNA，因此AD腦顯示更多的氧化DNA(鳥嘌呤為例)。
圖2：Nrf2和Keap1蛋白不同結構域的示意圖。(a) Nrf2的七個Neh域及其功能。(b) Keap1的五個代表性區(qū)域和幾個重要的半胱氨酸傳感器在不同區(qū)域發(fā)現(xiàn)。
圖3：Nrf2的keap1依賴性和非依賴調控機制。在基礎條件下，Keap1-Cul3復合物與Nrf2結合并介導其泛素化和降解。p62可能通過與Keap1結合，導致Keap1的自噬降解，從而減少了這一過程，從而增加了細胞核中Nrf2的積累。GSK-3β和p38 MAPK可使Nrf2在Neh6區(qū)域磷酸化并有利于其降解。相反，PKC、CK2 PERK、JNK1和ERK2介導的Nrf2磷酸化促進了Nrf2與Keap1的分離和核積累。在細胞核中，Nrf2與轉錄共激活因子Mafs形成異源二聚體，促進與ARE的穩(wěn)定結合并增強基因轉錄。Fyn激酶可能使Nrf2在Tyr568處磷酸化，有利于其核出口。Bach1與Nrf2競爭結合導致Nrf2轉錄能力下降。NF-κB也通過與ARE結合與Nrf2競爭, 下調其轉錄活性。
圖4：AD中Nrf2與一個高亮區(qū)域(藍色)和p-tau(灰色)相互作用的示意圖。Aβ通過內含體中BACE1和γ-分泌酶的蛋白水解功能從APP中衍生出來。Aβ分泌入組織間液，可導致Nrf2水平降低。Aβ可聚集成寡聚體和原纖維，對細胞功能有許多影響，包括突觸活性受損和腦毛細血管血流量受損。Nrf2的激活降低了BACE1的轉錄水平，從而降低了Aβ的產(chǎn)生。Nrf2還可能降低聚合Aβ的水平，從而減少AD淀粉樣蛋白的病理。錯誤折疊的MAPT和p-tau蛋白的積累可能導致成對螺旋絲的形成(PHF;PDB: 6HRE)，隨后跨突觸傳播到遠處的神經(jīng)元。Nrf2的激活可能會增加參與選擇性自噬過程的p62和NDP52的水平。P62還可以促進不溶性MAPT的降解，從而降低神經(jīng)纖維纏結(NFTs)水平。Nrf2可能預防p-tau誘導的神經(jīng)退行性變，也可能減少p-tau的聚集。因此，Nrf2的激活導致AD tau的病理減少。
圖5：Nrf2在AD中的作用的簡化說明。Nrf2通過(上調/下調)調控多個下游靶點來抑制AD的幾個關鍵致病特征。
翻譯：
Nrf2：阿爾茨海默氏病治療中的黑馬
摘要：阿爾茨海默氏?。ˋD）是一種年齡依賴性神經(jīng)退行性疾病，是癡呆癥的主要原因。AD的常見特征包括淀粉樣β肽（Aβ）聚集，高水平的高磷酸化tau蛋白（p-tau）和氧化還原穩(wěn)態(tài)失敗。迄今為止，所有針對Aβ和/或p-tau的藥物臨床試驗均失敗了。在AD大腦中已經(jīng)觀察到轉錄因子Nrf2（核因子-類胡蘿卜素2-p45衍生因子2）及其驅動基因（NQO1，HO-1和GCLC）的表達下降，以及Nrf2相關途徑的改變。Nrf2在維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)和調節(jié)炎癥反應中起關鍵作用。Nrf2激活還提供針對日益增加的病理（包括神經(jīng)退行性疾病）的細胞保護作用。這些證據(jù)表明，Nrf2激活可能是一種新穎的AD治療選擇。有趣的是，最近的研究還表明，Nrf2會干擾AD中的幾種關鍵致病過程，包括Aβ和p-tau途徑。本綜述旨在深入了解Nrf2在AD中的作用。此外，我們還討論了有關Nrf2激活劑用于AD治療的進展和挑戰(zhàn)。
關鍵詞：阿爾茨海默病、Nrf2、 Keap1、β淀粉樣蛋白肽、Tau蛋白、氧化應激
1. 前言
神經(jīng)元主要參與學習、思考、記憶和計劃（Carter等人，2019）。神經(jīng)退行性疾病的主要原因是多種病理因素導致神經(jīng)元功能和生存能力的逐步下降。這些多因素神經(jīng)退行性疾病正在影響全球數(shù)百萬人（Calderon-Garciduenas和Duyckaerts，2017）。神經(jīng)退行性疾病，例如阿爾茨海默氏?。ˋD），被證明與蛋白質折疊錯誤、線粒體損傷和氧化應激（OS）有關。AD是一種不可逆的進行性腦部疾病，會逐漸發(fā)生并導致記憶力減退以及思維和行為下降（Lu等人，2018年; Ossenkoppele等人，2015年）。AD被認為是癡呆癥的主要原因，這是至少兩個認知領域的逐步衰退，并導致正常的社交或職業(yè)活動殘疾。AD通常會影響老年人，但它不是正常的衰老缺陷。AD的特征包括淀粉樣β肽（Aβ）的聚集、高磷酸化tau蛋白（p-tau）的積累、炎性介質的產(chǎn)生、OS以及膽堿能、突觸和認知功能的障礙。遺傳、環(huán)境因素和一般生活方式是與AD相關的病因因素的一部分（Long和Holtzman，2019）。當前，AD影響著超過5000萬人，估計2050年全球發(fā)病率將達到1.5億（Jannat等人，2019）。由于僅部分了解AD的發(fā)病機理，因此AD的治療仍然是一個挑戰(zhàn)（Park等人，2018）。許多III期臨床試驗都失敗了，尤其是針對Aβ產(chǎn)生和聚集的試驗。由于缺乏明顯的療效，最近終止了Crenezumab（NCT03491150）、lanabecestat（NCT02972658）和solanezumab（NCT01900665）臨床試驗。在尋找治療AD的有效藥物方面的系統(tǒng)性失敗，促使科學家們探索新的策略來對抗這種疾病。
AD具有多種病理特征，例如大量的DNA氧化、嚴重的線粒體損傷、廣泛的脂質過氧化作用、高水平的神經(jīng)毒性微量元素以及Aβ的升高（Deibel等，1996; Huang等，1999; Wang等（2005年）。所有這些因素都會增加自由基或活性氧（ROS）的形成，因此，因此AD患者的大腦也受到OS的影響（圖1）。在生理條件下，ROS的動態(tài)平衡受到ROS生成系統(tǒng)和細胞抗氧化網(wǎng)絡的良好調控（Zhang等，2020; Zhang等，2019）?？寡趸烙到y(tǒng)包括幾種酶和小分子，例如血紅素加氧酶-1（HO-1）、超氧化物歧化酶（SOD）酶、谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶（CAT）、硫氧還蛋白（Trx）、硫氧還蛋白還原酶（TrxR）、谷胱甘肽過氧化物酶（Gpx）家族和NAD（P）H：醌氧化還原酶1（NQO1）。在人類AD研究中，患者的大腦顯示出核因子紅系2相關因子2（Nrf2）、SOD1、CAT和Gpx的水平降低（Chenere等，2007; Mota等，2015）。由于Nrf2和這些重要的抗氧化酶含量低，AD大腦容易受到ROS的侵害。在這種情況下，ROS對大腦造成進行性和不可逆的損害。用抗氧化劑（例如維生素E、維生素C和雌激素）直接治療可能在AD中發(fā)揮積極作用，但這些抗氧化劑在臨床患者中的療效仍處于初級階段（Feng和Wang，2012）。通過Nrf2活化來增加抗氧化蛋白的水平已被認為是實現(xiàn)神經(jīng)保護的更好方法（Buendia等人，2016; Chen和Maltagliati，2018）。 Nrf2誘導大約250個基因編碼不同的細胞保護和解毒蛋白的表達。高水平的Nrf2可以緩解AD中ROS和/或線粒體功能障礙引起的損害（Eftekharzadeh等人，2010; Fu等人，2018）。最近的研究表明Nrf2可以預防AD中某些關鍵的早期致病過程，包括Aβ（Cuadrado等，2018; Han等，2019）。已知Nrf2可通過調節(jié)抗氧化蛋白和解毒蛋白發(fā)揮神經(jīng)保護作用，但是Nrf2具有干擾β-分泌酶（BACE1）、Aβ和p-tau的能力是一個有趣的發(fā)現(xiàn)。該領域的一些優(yōu)秀的研究是由不同的研究小組進行的（Bahn等人，2019; Kitaoka等人，2019; Sotolongo等人，2020; Tang等人，2018），在此，我們旨在回顧和討論這些發(fā)現(xiàn)，以提高我們對Nrf2在AD中的作用的認識。理解Nrf2激活劑針對Aβ和p-tau的神經(jīng)保護作用的潛在機制可能有助于新AD藥物的設計和開發(fā)。此外，我們討論了Nrf2激活劑作為AD潛在療法的進展以及開發(fā)Nrf2激活劑的主要挑戰(zhàn)。在藥物設計過程中考慮這些問題可能會增加臨床試驗的成功率。
2. Nrf2的結構和功能
Nrf2蛋白是NFE2L2基因的產(chǎn)物，是研究最多的Cap 'n 'collar基區(qū)亮氨酸拉鏈(b-Zip)轉錄因子家族成員之一。Nrf2自1994年被發(fā)現(xiàn)以來，關于該轉錄因子的研究不斷增多。學術界和產(chǎn)業(yè)界之所以對Nrf2如此感興趣，很大程度上是因為Nrf2具有廣泛的功能。Nrf2是細胞保護系統(tǒng)的主要調控器，即II相解毒酶和抗氧化劑 (Cuadrado et al., 2019)。Nrf2參與NADPH、NQO1、HO-1、膽綠素還原酶、谷胱甘肽家族和硫氧還蛋白系統(tǒng)的轉錄調控。基于Nrf2的轉錄程序的細胞保護作用使細胞適應并在應激條件下生存(Hou et al., 2018)。這些功能會改變代謝和生物能，從而影響中間代謝和線粒體功能(Kitaoka et al., 2019; Merry and Ristow, 2016)。由于Nrf2調控多種抗氧化酶的表達，其抗氧化作用已被廣泛研究(Peng et al., 2015b)。Nrf2在自噬調控中的作用已經(jīng)被許多實驗室解決，他們觀察到Nrf2激活導致自噬增加，而Nrf2缺乏導致自噬減少(Frias et al., 2020; Jo et al., 2014; Komatsu et al., 2010; Pajares et al., 2018)。激活自噬可增加溶酶體介導的蛋白降解和損傷細胞器及感染微生物的清除(Tang et al., 2018)。Nrf2還參與調控另一種類型的細胞死亡，即鐵依賴性脂質過氧化引起的鐵死亡。Fenton反應(圖1c)可能部分解釋了鐵死亡對鐵的依賴，因為具有氧化還原活性的鐵池可以催化脂質過氧化，形成損傷，最終導致細胞死亡。與其他類型的細胞死亡相比，鐵死亡表現(xiàn)出獨特的形態(tài)、生化和遺傳特征(Dixon et al., 2012)。由于脂質過氧化是鐵死亡的核心特征，脂質過氧化物清除劑能有效中和鐵作用(Homma et al., 2019; Matsushita et al., 2015)。有趣的是，到目前為止，所有涉及鐵蛋白作用的基因都受到Nrf2的轉錄調控，包括但不限于Gpx4、Trx、TrxR、HO-1、鐵轉運蛋白和鐵螯合酶。因此，Nrf2可以作為這一過程的主要調控因子。人們對探索鐵死亡在包括AD在內的神經(jīng)退行性疾病中的作用越來越感興趣(Cong et al., 2019; Do Van et al., 2016)。然而，還需要進一步的研究來驗證鐵蛋白增多與神經(jīng)退行性疾病的聯(lián)系。Nrf2激活的另一個顯著特征是炎癥抑制。Nrf2的抗炎能力比預期的更為復雜, 它涉及Nrf2靶基因編碼蛋白的轉錄上調(如白三烯B4脫氫酶) 以及編碼的主要促炎細胞因子(如IL-6和IL-1b)基因的下調 (Dick et al., 2001; Kobayashi et al., 2016)。OS和炎癥是包括癌癥、心血管和神經(jīng)退行性疾病在內的大多數(shù)人類病理的主要因素(Kwak and Kensler, 2010; Liby et al., 2012)。特別是Nrf2在神經(jīng)退行性疾病、糖尿病和腎臟疾病中的作用是目前研究的熱點 (Das et al., 2013; Fao et al., 2019; Matzinger et al., 2018; Yamawaki et al., 2018)。
不幸的是，到目前為止，Nrf2結構還沒有被完全闡明。人類Nrf2蛋白由605個氨基酸組成。由七個區(qū)域組成，命名為Neh1-Neh7 (Nrf2-ECH同源性)。Neh1、Neh3和Neh6位于c端。另一方面(n -端)包含Neh2、Neh4和Neh5結構域。Neh7是由Wang等人發(fā)現(xiàn)的，與Neh5相鄰。Neh1負責DNA結合(圖2a) (Wang et al., 2013)。Neh2通過兩個基序DLG和ETGE與kelch樣ech相關蛋白1 (Keap1)相互作用(Nioi et al. , 2005)。Neh3是一個反激活區(qū)域，可以提高抗氧化反應元件(ARE)依賴基因的轉錄(McMahon et al. , 2004)。Nrf2的keap1獨立降解主要由Neh6區(qū)域介導。Neh7可能與視黃酸受體(RAR α)結合，這種相互作用導致Nrf2-ARE信號通路的負調控(Wang et al. , 2013)。
3. Nrf2調控的分子機制
Nrf2調控大量基因的表達。同時，它也是大量生物分子的靶點。這些生物分子以不同的機制調控Nrf2功能。了解Nrf2的調控機制對于開發(fā)靶向Nrf2的新分子以及了解Nrf2的治療作用具有重要意義。Kwak等人描述了Nrf2通過結合其啟動子區(qū)域激活其表達的能力，這支持了Nrf2自我調節(jié)(autoregulation)的觀點(Kwak et al., 2002; Miao et al., 2005; Rushmore et al., 1990)。Nrf2的調控除了自身調控外，主要分為keap1依賴性和非keap1依賴性調控。這里我們總結了Nrf2調控的機制(圖3)。
3.1. Keap1依賴性調控
自從Itoh等人發(fā)現(xiàn)去除Nrf2的Neh2可以增加Nrf2活性以來，Keap1在Nrf2調控中的作用就已經(jīng)為人所知(Itoh et al., 1999)。人Keap1(基因ID: 9817)蛋白是由624個氨基酸殘基組成的富含半胱氨酸的蛋白，表觀分子量為69.7 kDa (Itoh et al., 1999; Zipper and Mulcahy, 2002)。Keap1有5個具有不同功能的結構域，即N端區(qū)域(NTR;1-60)，C末端區(qū)域CTR(599-624)、BTB(61-179)（Broad complex, Tramtrack and Bric a Brac）/POZ(poxvirus and zinc finger)、雙甘氨酸重復區(qū)DGR (315-598) (double glycine repeat or Kelch repeats）及插入?yún)^(qū)IVR(180-314)（intervening region）。DGR和CTR一起被稱為Keap1-DC，它對Nrf2的Neh2結構域的結合至關重要。人Keap1含有27個半胱氨酸(Cys)殘基，但只有Cys151、Cys226、Cys273、Cys288、Cys434和Cys613對Nrf2激活至關重要(圖2b) (Bryan et al., 2013; Canning et al., 2013; Canning et al., 2015)。
Nrf2是Keap1最具特征的靶蛋白之一。在基礎條件下，Keap1有利于Nrf2蛋白酶體降解，以防止ARE的組成性激活(Huang et al., 2000)。人們提出了不同的模型來理解這種相互作用和調節(jié)的機制。鉸鏈和插銷模型是理解Keap1-Nrf2相互作用的首選模型(圖4)。在這個模型中，Nrf2 ETGE基序首先與Keap1結合。ETGE結構域采用圓轉構象，深深插入Keap1口袋，埋藏面積為420 Å2 (Abiko et al., 2011; Wakabayashi et al., 2004)。然后Nrf2通過其DLG基序在Keap1的第二個獨立結合位點結合。通過對ETGE和DLG的比較，可以看出兩者都與Kelch域口袋的底部相互作用，但其構象和親和力不同。熱力學和動力學分析表明，與Keap1-DLG較弱的相互作用相反，Keap1-ETGE是焓驅動的，開關速率較慢，導致高親和力的相互作用(Hong et al., 2005; McMahon et al., 2003; Tong et al., 2007)。在激活模式下，DLG基序與Keap1分離，導致Nrf2的釋放和轉位到細胞核(Bloom and Jaiswal, 2003)。
Nrf2的另一個keap1依賴性調控是通過p62。p62蛋白也被稱為死骨片1 (SQSTM1)。p62蛋白可以結合多聚泛素化蛋白和自噬機制，靶向自噬的特定載體(Kim et al., 2008; Pankiv et al., 2007)。Komatsu等證明p62通過與Keap1的相互作用破壞Keap1-Nrf2系統(tǒng)(Komatsu et al., 2010)。p62通過其與Nrf2 ETGE相似的STGE基序與Keap1結合。p62高表達導致Nrf2水平升高，反之亦然(Copple et al., 2010)。另一項研究也表明，p62的積累導致Nrf2的一致激活(Inami et al., 2011)。為了理解p62-Keap1結合模型，人們做了很多有價值的工作，結果證明該模型與Keap1的CTR重疊(Komatsu et al., 2010;Lau et al., 2010)。基于編碼p62蛋白的mRNA的存在，缺失了與Keap1結合所必需的Keap1相互作用區(qū)域，Kageyama等人證明，該變異增加了Keap1的數(shù)量，并增強了Nrf2的泛素化。本研究表明，p62 pre-mRNA的剪接負調控小鼠Keap1-Nrf2通路(Kageyama et al., 2018)。然而，關于人類的這種變異還需要更多的研究。BRCA2（PALB2）的伴侶和定位劑二肽基肽酶3（DPP3）也通過ETGE基序與Keap1相互作用，激活Nrf2（Hast et al., 2013）。
3.2. 非Keap1依賴性調控
Nrf2中非keap1依賴性調控也被幾個研究小組研究過。在這方面，Nrf2的翻譯后修飾，包括磷酸化、泛素化和乙酰化得到了很好的表征。Nrf2含有許多蘇氨酸、絲氨酸和酪氨酸殘基，是潛在的磷酸化位點。幾種激酶可能磷酸化Nrf2并調節(jié)其活性(Rojo et al., 2012)。蛋白激酶C (PKC)磷酸化Nrf2的Ser40 (Neh2)，從而破壞與Keap1的關聯(lián)，進而促進Nrf2轉位進入細胞核(Huang et al., 2002)。最近, Fao等人表明，Nrf2在Ser40被c-src依賴激酶磷酸化激活，在Tyr311通過PKCδ磷酸化 (Fao et al ., 2019)。酪蛋白激酶II (CK2)在Nrf2特異序列中也有大約13個潛在的磷酸化位點(Neh4和Neh5) (Pi et al., 2007)。這些位點的磷酸化與易位進入細胞核的Nrf2相連接。研究發(fā)現(xiàn)，在CK2抑制劑存在的情況下，Nrf2易位降低(Patrick L. Apopa et al., 2008)。類似地，蛋白激酶R (PKR)樣內質網(wǎng)激酶(PERK)介導了Thr80的磷酸化并有利于Nrf2的激活(Cullinan and Diehl, 2004)。糖原合成酶激酶-3蛋白(GSK-3磷酸化)使Nrf2的Ser335和Ser338位點磷酸化并導致其降解(Rada et al., 2011; Rojo et al., 2008)。GSK-3蛋白還作用于酪氨酸激酶Fyn的上游，可以磷酸化Nrf2中的Tyr568，導致Nrf2的核積累(Jain and Jaiswal, 2006,2007)。幾種絲裂原活化蛋白(MAP)激酶也顯示了不同Nrf2絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化能力。雖然，c-Jun n末端激酶1 (JNK1)和細胞外調節(jié)蛋白激酶2 (ERK2)介導的磷酸化誘導了Nrf2的激活，但p38通過磷酸化Nrf2促進keap1和Nrf2之間的聯(lián)系，從而阻止其核易位(Keum et al., 2006)。Hrd1 (E3泛素連接酶)又稱滑膜泛素連接酶。Hrd1對內質網(wǎng)相關降解(ERAD)至關重要。Wu等證明Hrd1與Nrf2的Neh4-5結構域相互作用導致Nrf2泛素化并降解(Wu et al., 2014)。CBP/p300介導的Nrf2賴氨酸殘基乙?；?Neh3/Neh1)增加了Nrf2的轉錄功能。另一方面，sirt1介導的去乙?；档土薔rf2信號(Kawai et al., 2011)。
核因子-κB (NF-κB)蛋白是一組結構相關轉錄因子，參與了大量的細胞過程。NF -κB可以抑制相關基因的轉錄,而幾個Nrf2催化劑有能力抑制NF-κB活動(Nair et al ., 2008)。大量證據(jù)還表明，Keap1通過與IκB激酶-β（IKKβ）結合而在NF-κB通路的負調控中起作用，并賦予NF-κB泛素化和降解作用（Kim et al., 2010; Lee et al., 2009）。
Bach1是b-Zip轉錄因子的一部分，與小Maf蛋白形成異源二聚體，并作為Nrf2的誘導抑制因子。Bach1/Maf和Nrf2/Maf競爭性地共享同一結合位點(ARE的順式元素)。因此，靶基因的抑制或激活可能發(fā)生。然而，Bach1的亞細胞定位依賴于Nrf2核輸出信號和Crm1, Crm1由氧化還原敏感的細胞質定位信號(CLS)驅動，因此Bach1主要由Nrf2調控(Silva-Palacios et al., 2018)。Poganik等人引入了一種新的直接調控Nrf2 mRNA的轉錄后模型。他們報告說，HuR和AUF1 ，兩個mRNA結合蛋白質,可以通過靶向mRNA 3?utr專門調控Nrf2。他們的結果表明，HuR可以促進Nrf2 mRNA的成熟并促進其核輸出，而AUF1則穩(wěn)定Nrf2 mRNA。他們還發(fā)現(xiàn)，Nrf2活性的轉錄后調控在整個脊椎動物水平上是保守的(Poganik et al., 2019)。這一發(fā)現(xiàn)為發(fā)現(xiàn)更多遵循類似調控機制的Nrf2調控因子奠定了基礎。
幾項研究已經(jīng)鑒定出一些通過將Nrf2的mRNA靶向3´UTR來調節(jié)Nrf2表達的MicroRNA。這些Nrf2負調節(jié)劑的例子包括但不限于miR28，miR-153，miR-142-5p，miR-27a和miR-144(Narasimhan et al., 2012; Yang et al., 2011)。然而，Nrf2與其靶向miRNA之間的關系是高度復雜的，需要更多的研究來發(fā)現(xiàn)其他參與Nrf2調控的miRNA及其調控機制以及這種調控在AD發(fā)病機制中的作用。綜合來看，參與Nrf2調控的多個因素可以為理解Nrf2參與不同疾病和紊亂的治療提供線索(Cuadrado et al., 2019)。
4. Nrf2在AD中的作用
Nrf2在機體的不同器官(包括大腦)中表達，表達水平各不相同。代謝器官，特別是那些暴露于外部環(huán)境的親電性和氧化劑的器官(如肺和腸) Nrf2水平較高(Riedl et al., 2009)。對人和小鼠大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的研究表明Nrf2在神經(jīng)元、星形膠質細胞和膠質細胞中表達(Cuadrado et al., 2019; Shih et al., 2003)。然而，Nrf2在星形膠質細胞中的表達高于神經(jīng)元。微陣列分析顯示Nrf2激活誘導星形膠質細胞中大量Nrf2靶基因(Lee et al., 2003)。在幾種神經(jīng)退行性實驗模型中，星形細胞Nrf2表達具有神經(jīng)保護作用(Cuadrado et al., 2018; Yu et al., 2019)。Nrf2及其驅動基因(NQO1、HO-1和GCLC)的表達在老年人和AD大腦中均出現(xiàn)下降(Silva-Palacios et al., 2018)。Nrf2通過保護性NFE2L2單倍型的高表達可防止神經(jīng)退行性變。另一方面，Nrf2表達降低與AD風險增加或早期發(fā)病相關(von Otter et al., 2010)。Nrf2介導的抗氧化反應的抑制被發(fā)現(xiàn)是導致過早衰老表型的關鍵因素(Kubben et al., 2016)。 Rojo等比較了Nrf2缺乏、衰老和AD小鼠模型之間的差異。他們發(fā)現(xiàn)了Nrf2缺乏和衰老之間的7個共同特征，以及Nrf2缺乏和AD之間的10個共同特征。作者還注意到不溶性p-tau蛋白和缺氧小鼠nrf2水平升高(Rojo et al., 2017)。本研究提示Nrf2缺乏與衰老/AD密切相關。這些來自不同實驗室的發(fā)現(xiàn)支持了Nrf2可能在腦衰老和AD之間起分子連接作用的假設(Branca et al., 2017)。大量證據(jù)表明Nrf2功能障礙在認知障礙和AD的發(fā)病機制中起作用。Branca等人報道，在AD的APP/PS1小鼠模型中，Nrf2的缺失顯著加重了包括空間學習和記憶在內的認知缺陷(Branca et al., 2017)。Nrf2還可以通過上調參與大自噬(Pajares et al., 2016)和伴侶蛋白介導的自噬(Pajares et al., 2018)的基因表達，幫助清除淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)和tau蛋白。這些發(fā)現(xiàn)可能解釋了在app損傷和tau損傷的神經(jīng)元中Nrf2水平的升高，并提示Nrf2激活可能在疾病進展的輕度認知障礙階段很快發(fā)生。最近，Uruno等人證明Nrf2的誘導通過抑制OS和神經(jīng)炎癥改善了AD小鼠模型中的認知障礙(Uruno et al., 2020)。幾種Nrf2激活因子在終止AD關鍵發(fā)病機制中也顯示出強大的活性，包括抗抑郁藥物和p-tau，以及對神經(jīng)炎癥和線粒體功能的調節(jié)(Ikram et al., 2019; Yang et al., 2018)。這些結果提示Nrf2是AD重要的治療靶點。除了已知的Nrf2在維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中的作用外，我們還進一步了解了Nrf2與AD關鍵發(fā)病因子的相互作用。
4.1. Nrf2和Aβ
AD的組織學特征是細胞外Aβ斑塊沉積(Irvine et al., 2008;Selkoe and Hardy, 2016)。Aβ肽類(~4 kDa)是通過內含體中BACE1和γ-分泌酶順序裂解APP產(chǎn)生的。BACE1是產(chǎn)生Aβ的必要物質，少量的BACE1的增加會引起一個顯著的產(chǎn)量的增加。與分泌酶不同的是，BACE1的水平在AD中被發(fā)現(xiàn)升高，這表明它在AD中對細胞積累起重要作用。因此，BACE1的抑制劑正被尋求作為AD的治療藥物。Aβ易于聚集成寡聚體、原纖維和纖維形式的β-折疊構象。Aβ聚集的過程也涉及ROS的產(chǎn)生，導致神經(jīng)元死亡(Andersen, 2004; Klein et al., 2001)。在AD大腦中發(fā)現(xiàn)了幾種形式的Aβ，尤其是疏水性較強的Aβ，例如Aβ42，由于其高聚集傾向(Thal et al., 2015)。有證據(jù)表明，不同池中的Aβ數(shù)量和溶解度可能與疾病狀態(tài)密切相關(Murphy and LeVine, 2010)。一些靶向聚合體或抑制BACE1的藥物正在臨床試驗中，但它們都沒有獲得美國食品和藥物管理局(FDA)的批準(Dong et al., 2019; Yan and Vassar, 2014)。
APP/PS1小鼠Nrf2基因刪除顯示炎癥反應增強和細胞內APP、β42和β40水平升高。Nrf2缺失的APP/PS1小鼠神經(jīng)元也顯示了核內體、溶酶體和多泡小體的增加(Joshi et al., 2015)。這些發(fā)現(xiàn)為Nrf2在APP/ Aβ處理和積累以及自噬功能障礙中的作用提供了線索。Kerr等人首次提供了體內證據(jù)，證明通過特異性抑制Keap1激活Nrf2，可以防止AD誘導的Aβ42神經(jīng)元毒性(Kerr et al., 2017)。Yu等人的一項研究也顯示，當他們在AD動物模型中使用Nrf2激活劑isoastilbin時，也有類似的效果，并且他們發(fā)現(xiàn)Aβ42和 p tau表達降低(圖4) (Yu et al., 2019)。Li等證明西格列汀和槲皮素的結合能夠降低大鼠的Aβ表達水平(Li et al., 2019b)。Bahn等發(fā)現(xiàn)Nrf2通過與BACE1啟動子中的AREs結合抑制了AD動物模型中BACE1的表達。Nrf2的激活減少了BACE1轉錄和Aβ產(chǎn)物的生成，并改善了認知缺陷。另一方面，Nrf2的缺失增加了BACE1的表達和Aβ生成，并加重了認知障礙。作者還證明，Nrf2對BACE1的調控與ROS抑制無關(Bahn et al., 2019)。本研究不僅將Nrf2的功能與Aβ生成聯(lián)系起來，還揭示了Nrf2抑制BACE1的能力。有趣的是，該研究還發(fā)現(xiàn)Nrf2并不影響細胞分泌酶的活性或表達。這些發(fā)現(xiàn)表明，Nrf2的激活不僅抑制了Aβ的產(chǎn)生，還減少了其聚集所造成的損傷。
4.2. Nrf2和p-tau
MAP家族特別是MAP2和tau調節(jié)神經(jīng)元中不同的細胞骨架過程(Amos and Schlieper, 2005)。Tau蛋白是一種55 kDa的蛋白，具有85個以上的翻譯后修飾位點，如磷酸化、乙酰化和泛素化。雖然其正常功能需要翻譯后磷酸化，但過度磷酸化會破壞其活性(Li and Gotz, 2017; Marciani, 2018; Morishima-Kawashima and Ihara, 2002)。Tau病理的發(fā)生是由于tau蛋白的錯誤折疊導致了β-折疊纖維的產(chǎn)生和積累。Tau病理和β-折疊纖維積累是包括AD在內的幾種神經(jīng)疾病的主要發(fā)病機制(Almansoub et al., 2019)。Tau病理被認為是AD認知能力下降和神經(jīng)退行性變的主要驅動因素(Aschenbrenner et al., 2018; Hanseeuw et al., 2019)。
Jo等研究表明Nrf2可通過誘導核點蛋白52 (nuclear dot protein 52, NDP52)降低p-tau水平。NDP52是一種自噬接頭蛋白，其誘導可促進自噬介導的p-tau蛋白降解(圖4)。Jo等人也揭示了Nrf2活性的機制，即Nrf2與NDP52啟動子中的AREs結合(Jo et al., 2014)。最近，Tang等報道Nrf2調節(jié)選擇性自噬過程，可促進tau的清除。他們觀察到，與年輕的Nrf2−/−動物相比，衰老Nrf2−/−動物中BAG3、NBR1、NDP52和p62的表達顯著減少，這表明Nrf2在衰老過程中對維持這些基因的適當表達水平起著關鍵作用(Tang et al., 2018)。許多Nrf2激活劑，包括蘿卜硫素(Kim et al., 2013)、苯福硫胺(Tapias et al., 2018)、富馬酸二甲酯(Cuadrado et al., 2018)、大蒜素(Zhu et al., 2015)和mini-GAGR (Murphy et al., 2018)對p-tau AD動物模型顯示出積極作用。
4.3. Nrf2 和神經(jīng)炎癥
小膠質細胞是常駐的免疫巨噬細胞樣細胞，它們在急性感染和/或毒性損傷時的激活可能有助于清除受損細胞。在AD中，小膠質細胞可能被長期激活，導致有害的促炎細胞因子和ROS/RNS的持續(xù)分泌。這些過程導致神經(jīng)退行性變。神經(jīng)膠質細胞,位于Aβ斑塊區(qū)域，表明激活的NF-κB、以及促炎細胞因子和趨化因子水平增加( Yin et al., 2017)。同時, NF-?B被發(fā)現(xiàn)調控BACE1表達 (Chen et al., 2012)。Terada等觀察到tau病理與AD患者海馬旁神經(jīng)炎癥呈正相關(Terada et al., 2019)。提示神經(jīng)炎癥可能在AD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。因此，神經(jīng)炎癥的消除可以減輕AD的進展和癥狀(Yang et al., 2019)。Nrf2和NF -κB之間的關系呈現(xiàn)出“陰陽”的概念。盡管在操作系統(tǒng)被激活,Nrf2誘導基因主要是抗炎(包括CD36、IL-17D)而NF –κB作用相反(增加IL-6、COX2和iNOS)。在這種背景下，Nrf2和NF-κB之間的不平衡對AD的發(fā)病機制可能是重要的。因此，Nrf2可能在AD中發(fā)揮重要的抗神經(jīng)炎癥作用。幾項研究證實，Nrf2的激活可以抑制因注射Aβ 或tau引起的小膠質細胞激活，并進一步保護小膠質細胞引發(fā)的神經(jīng)元丟失(Seo et al., 2017; Tom et al., 2019)。
4.4. Nrf2和線粒體功能障礙
線粒體是一種靈活的超微結構細胞器，它控制著關鍵分子元素的生物能量。線粒體的整體動態(tài)本質是由融合和分裂活動控制的。通過抑制線粒體破碎，融合可以延遲細胞凋亡的發(fā)生，而分裂對細胞凋亡有積極作用。線粒體質量控制過程中的失衡可能導致線粒體功能障礙(Cheng and Bai, 2018)。在Nrf2敲除小鼠中觀察到年齡相關的線粒體OS以及線粒體功能受損，而Nrf2的激活增強了線粒體功能(Kitaoka et al., 2019)。Nrf2激活可增加蛋白酶體活性，而蛋白酶體活性可增強動力蛋白相關蛋白1 (Drp1)的降解(Sabouny et al., 2017)。Drp1是dynamin超家族的一種大型GTPase，它是促凋亡蛋白Bax線粒體轉位所必需的酶，并與之結合以增強線粒體外膜通透性。這一過程促進細胞色素c的釋放(Wang et al., 2015)。限制線粒體分裂蛋白的水平有利于線粒體低灌注，從而維持線粒體質量控制系統(tǒng)的功能。 Nrf2還控制線粒體抗凋亡蛋白(如Bcl-2和Bcl-xL)的表達、線粒體動力學、包括生物發(fā)生，通過與過氧化物酶體增殖激活受體-r 共激活劑 1a (PGC-1a)相互作用，以及通過p62依賴、PINK1/ parkino不依賴機制實現(xiàn)線粒體自噬(East et al., 2014; Merry and Ristow, 2016; Navarro et al., 2017)。AD早期出現(xiàn)線粒體功能障礙，導致神經(jīng)退行性變，促進突觸損傷和細胞凋亡。 、APP、Aβ和p-tau可干擾線粒體成分，導致線粒體動力學異常、生物發(fā)生缺陷、自噬減少、線粒體自噬減少、ATP生成受損和氧化損傷增加(Reddy et al., 2018; Sotolongo et al., 2020)。Nrf2可能減少這些損傷并維持線粒體功能(Fu et al., 2018)。Nrf2介導的Drp1降低也可能降低p-tau水平，提高突觸活性(Cieri et al., 2018; Kandimalla et al., 2016)。幾種Nrf2激活因子能夠改善不同AD模型中的線粒體功能障礙(Li et al., 2019a; Liu et al., 2019; Tapias et al., 2018)。Nrf2在線粒體保護中的作用是Nrf2激活在AD治療中的額外有益作用。
4.5. Nrf2和乙酰膽堿酯酶
乙酰膽堿(ACh)是一種有機神經(jīng)遞質，在神經(jīng)末梢釋放。乙酰膽堿乙酰轉移酶(ChAT)以乙酰輔酶A和膽堿為底物在膽堿能神經(jīng)元中產(chǎn)生乙酰膽堿。乙酰膽堿釋放后，通過乙酰膽堿酯酶代謝成膽堿和醋酸鹽。在AD患者的大腦中，已經(jīng)觀察到ACh水平的缺乏和AChE水平的增加。乙酰膽堿酯酶通過快速水解乙酰膽堿能突觸終止沖動傳遞。因此，最小化活性乙酰膽堿酯酶水平可以增強膽堿能功能(Osama et al., 2017; Tabet, 2006)。盡管目前尚無明確證據(jù)表明Nrf2對乙酰膽堿酯酶(AChE)的影響，但在AD小鼠模型中，幾種Nrf2激活因子均對膽堿能功能產(chǎn)生了積極影響，并降低了乙酰膽堿酯酶(AChE)水平，顯著提高了乙酰膽堿酯酶(ACh)和乙酰膽堿酯酶(ChAT)水平(Huanga et al., 2019; Li et al., 2019c; Yu et al., 2019)。假設這些作用可能，至少部分是由于Nrf2的抗凋亡作用，可以防止神經(jīng)元的丟失。Zhang等人發(fā)現(xiàn)，在細胞凋亡開始時，在細胞質中發(fā)現(xiàn)AChE，然后在細胞核或凋亡小體中發(fā)現(xiàn)，并細胞死亡。此外，凋亡細胞中表達的AChE與突觸型AChE相同。此外，使用藥理抑制劑或反義(阻斷乙酰膽堿酯酶的表達)來最小化活性乙酰膽堿酯酶的水平，可以抑制細胞凋亡。他們的結論是，AChE可能是細胞凋亡的標志物和調節(jié)因子(Zhang et al., 2002)。這可能解釋了AD大腦中大量細胞凋亡導致的高水平疼痛。Nrf2的抗凋亡作用可減少膽堿能神經(jīng)元的丟失，從而維持乙酰膽堿的產(chǎn)生，使神經(jīng)認知能力下降最小化。然而，對于AChE在細胞凋亡中的作用以及Nrf2的激活對AChE功能和分布的影響還需要進一步的研究。
5. AD中Nrf2相關通路的研究
一些研究也對AD中的Nrf2相關通路進行了研究，我們在此簡要回顧其中一些。p62是一種細胞內信號蛋白，參與多種細胞環(huán)境。它還通過自噬參與聚合蛋白的降解。對p62基因敲除小鼠的研究表明，它們表現(xiàn)出一些類似AD的神經(jīng)退行性變特征。鄭等研究了AD模型中p62- Keap1-Nrf2關系，發(fā)現(xiàn)AD中p62水平降低可能與Nrf2水平降低有關。作者還推測這可能是AD中tau蛋白過度磷酸化和隨后的神經(jīng)元損傷的原因(Zheng et al., 2012)。Gu等人指出，Nrf2介導的p62信號通路的激活可通過激活自噬來改善由Aβ42損傷引起的細胞死亡(Gu et al., 2018)。Xu等人證實了p62在自噬介導的對致病性微管相關蛋白tau (MAPT)的清除中發(fā)揮的作用，并通過MAPT阻斷了神經(jīng)纖維纏結的積累和病理擴散。他們還表明，p62介導的對不溶性突變體MAPT的清除是非泛素依賴的(Xu et al., 2019)。
多項研究表明，AD中GSK-3β水平升高(Leroy et al., 2007; Ochalek et al., 2017; Pei et al., 1997; Virpi Talman et al., 2016)。GSK-3β抑制蛋白活性的增加直接參與了磷酸化導向的Nrf2的降解(圖4)。GSK-3β抑制蛋白的基因過表達導致神經(jīng)元丟失和記憶缺失，并參與了小鼠tau蛋白的過度磷酸化(Engel et al., 2006; Hernandez ´ et al., 2002)。Tideglusib是GSK-3β抑制因子，能夠通過最小化tau蛋白磷酸化和減少淀粉樣蛋白沉積來改善認知(Sereno et al., 2009)。Cuadrado等研究表明，富馬酸二甲酯可以抑制Keap1和GSK-3β細胞，使Nrf2發(fā)生兩層上調。在動物模型中，富馬酸二甲酯能夠顯著降低tau蛋白磷酸化，并提供抗tau病理的保護(Cuadrado et al., 2018)。這一發(fā)現(xiàn)鼓勵了對這類化合物的研究，它們可能對神經(jīng)退行性疾病的治療有用。
p38 MAPK在AD中被證實上調(Sheng et al., 2001; Sun, 2003)。除了降低Nrf2核易位外，它還可能通過OS激活Aβ(Giraldo et al., 2014)。最近的研究表明，p38的減少和Nrf2水平的升高可以消除SH-SY5Y細胞的神經(jīng)毒性和OS (Amin et al., 2017a; Bach et al., 2011)。AD中NF-κB-p65的水平增加 (Terai et al ., 1996)。幾個不同的AD模型研究表明，抑制NF-κB可以調控的表達Nrf2(Zhao et al., 2018)。Tom等人表明gedunin, Nrf2活化劑，可以通過抑制NF-κB及減少神經(jīng)炎癥，保護細胞免受Aβ42 寡聚體誘導的神經(jīng)毒性 (Tom et al., 2019)。
6. Nrf2激活劑用于AD臨床試驗的影響
自1906年AD出現(xiàn)以來，只有五種藥物被FDA批準用于臨床治療。這五種藥是他克林，利瓦斯明，加蘭他敏，多奈哌齊和美金剛胺。前四種藥物是乙酰膽堿酯酶抑制劑，可以改善認知功能。美金剛胺是一種n -甲基- d -天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑，常用于治療中重度AD。然而，這些藥物都不能終止或逆轉AD的潛在進展。它們只能暫時改善認知功能。他克林、利瓦斯明、加蘭他明和多奈哌齊會產(chǎn)生一系列副作用，包括嘔吐、腹瀉、惡心、頭暈和頭痛。不幸的是，到目前為止，在AD的臨床試驗中，沒有一種影響到Aβ和/或p-tau的分子顯示出顯著的作用(Dong et al., 2019)。所有這些因素使得新的治療策略更具吸引力。如上所述，Nrf2可以通過直接和間接的方式干預Aβ和p-tau。此外，大多數(shù)AD患者是老年人，因此他們也可能患有與AD有共同病理特征的其他年齡相關疾病。Nrf2激活被發(fā)現(xiàn)對幾種與年齡相關的疾病有用(Deshmukh et al., 2017; Francisqueti-Ferron et al., 2019; Silva-Palacios et al., 2018)。多靶點治療被提出，因為乙酰膽堿酯酶抑制劑與抗氧化劑或NMDA受體拮抗劑一起給予治療效果更好(Mangialasche et al., 2010)。但在這種情況下，使用單一的Nrf2激活劑可能對幾種疾病有益，因此可能降低成本、副作用和藥物相互作用。許多天然和合成的Nrf2激活劑已在神經(jīng)退行性疾病的臨床前研究或模型中得到驗證(Dinkova-Kostova et al., 2017; Hou et al., 2019; Hou et al., 2018; Peng et al., 2019a; Peng et al., 2019b; Peng et al., 2015c; Yao et al., 2015)。最近，一些納入AD臨床試驗的藥物被證實能夠激活Nrf2(表1)。2014年，苯磷硫胺被納入AD臨床試驗(NCT02292238)。4年后，Tapias等人在體內模型中表明，苯磷硫胺可以激活Nrf2，并降低P301S AD中的p-tau (Tapias et al., 2018)。同樣，DL-3-n-丁基苯酞(NCT02711683) (Qi et al., 2018)和培哚普利 (NCT02085265) (Kamel et al., 2020)的Nrf2激活作用最近也得到了驗證。從十字花科植物中分離得到的蘿卜硫素進入AD臨床試驗(NCT04213391)可能是開發(fā)基于Nrf2激活的AD新藥的一個很好的步驟。蘿卜硫素通過與Keap1的Cys151相互作用，也是Nrf2親電激活劑。蘿卜硫素具有神經(jīng)保護作用，干預Aβ 和 p tau，并改善急性AD的認知缺陷(Kim et al., 2013)。目前，蘿卜硫素有20多個臨床試驗。然而，蘿卜硫素在室溫下相對不穩(wěn)定。因此，它的合成類似物SFX-01 (Evgen Pharma開發(fā)的藥物)備受關注。這些能力使蘿卜硫素及其類似物成為AD藥物開發(fā)的重要藥物。
在FDA批準的可激活Nrf2的藥物中，富馬酸二甲酯被認為是治療AD的有前景的藥物。2013年，富馬酸二甲酯被FDA批準用于治療多發(fā)性硬化癥。富馬酸二甲酯在不同的AD模型中均表現(xiàn)出積極的作用，因此被認為是藥物重新定位的最佳選擇之一?？偟膩碚f，半不飽和羰基化合物是研究最多的可激活Nrf2的化合物。這類化合物被設計通過與Keap1的半胱氨酸殘基結合來干擾Keap1- nrf2的相互作用(Peng et al., 2015b)。幾種自然產(chǎn)生的藥劑，包括xanthohumol, 6 dehydrogingerdione, cardamonin, 6-shogaol and chlorogenic acid,屬于這一家族，并已被我們實驗室鑒定為通過激活Nrf2來發(fā)揮神經(jīng)保護能力(Bai et al., 2019; Peng et al., 2017; Peng et al., 2015a; Yao et al., 2014; Yao et al., 2019)。
目前，有數(shù)十種天然和合成的Nrf2激活劑可用于進一步深入研究其在AD模型中的作用。表2總結了參與不同臨床試驗并證明對AD動物模型有積極影響的化合物。這些化合物可能是藥物開發(fā)的良好起點?；瘜W修飾也可能有助于改善這些分子的化學和藥理特性，從而達到更好的治療效果。
7. Nrf2治療AD藥物開發(fā)的挑戰(zhàn)
找到一種有效且相對安全的治療AD的新藥不是一件容易的事。此外，通過靶向Nrf2探索這種新的治療方法也使這項任務更具挑戰(zhàn)性。在這里，我們討論幾個問題和考慮開發(fā)Nrf2激活劑的臨床應用。
7.1. 選擇性
Nrf2抑制蛋白Keap1是一個富含Cys的蛋白，有27個Cys殘基，其中一些高度反應。Keap1的這一特性促使許多研究小組設計能夠與Keap1的Cys殘基硫醇基團形成共價鍵的共價抑制劑。在27個Cys殘基中，Cys151、Cys273和Cys288得到了高度關注。Cys273和Cys288在基礎和應激條件下Nrf2的調控中都發(fā)揮了重要作用。另一方面，Cys151在應對各種應激條件方面具有重要作用(Suzuki et al., 2013)。許多親電物種能夠與Keap1的Cys殘基形成共價相互作用，從而抑制Nrf2泛素化。用親電修飾劑隨機或選擇性地攻擊Keap1 Cys殘基被稱為“半胱氨酸編碼”(Cuadrado et al., 2019; Fao et al., 2019)。不幸的是，攻擊Keap1中的Cys殘基并不意味著不能攻擊其他富含半胱氨酸的蛋白質。這種缺乏選擇性是開發(fā)共價Keap1修飾劑的主要問題(Suzuki et al., 2013)。人們正在努力發(fā)現(xiàn)更有選擇性的化合物，蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)抑制劑也在選擇之列。CPUY192018是通過阻斷Nrf2和Keap1的PPI來激活Nrf2的最成功的例子之一(Lu et al., 2019)?；诟蟮闹Ъ芙Y構可能提供更好的選擇性的假設，也研究了五環(huán)邁克爾受體的氰烯酮三萜。Bardoxolone甲基就是這類化合物的一部分，目前正在進行四個臨床試驗(Cuadrado et al., 2019)。Nrf2可以通過其他不同的策略激活，從而提高選擇性。Nrf2激活的途徑之一是使用競爭性抑制劑攻擊Keap1-Nrf2的結合位點。這一策略是實用的和高度選擇性的，因此它可能是減少副作用的一個很好的替代方法(Madden and Itzhaki, 2020)。另一種方法是靶向BTB結構域中的Keap1二聚作用(Zhuang et al., 2009)。BTB結構域也參與了Keap1和Cul3的結合，針對這種Keap1-Cul3的相互作用也可能導致Nrf2的激活。Keap1 IVR域中發(fā)現(xiàn)的靶向3-box也可能干擾Keap1和Cul3的結合(Cleasby et al., 2014)。用新的激活劑靶向這些不同的位點可以增加選擇性，從而減少潛在藥物的副作用。此外，靶向激活AD腦損傷區(qū)域的Nrf2是另一個挑戰(zhàn)，進一步修飾這些化合物可能是提高選擇性的一個有希望的策略。
7.2. AD實驗模型
在藥物發(fā)現(xiàn)領域，實驗模型是非常重要的。這些模型在闡明疾病的病理生理原因和測試候選藥物的臨床前后果方面至關重要。在AD的案例中，對多個物種的神經(jīng)病理學調查顯示，AD似乎是人類特有的(Drummond and Wisniewski, 2016)。對包括恒河猴、狒狒、黑猩猩、食蟹獼猴和狐猴在內的非人類模型的研究表明，它們具有AD的一些共同特征，有助于解開AD病理的一些模糊之處。不幸的是，在這些模型上進行研究可能會花費很長時間，畢竟，它們可能會隨著它們表現(xiàn)出的特征而變化，因為它們沒有受到人類AD的折磨。AD治療學的臨床試驗失敗率極高(>99%)，這可能與缺乏合適的AD動物模型有關。在人工誘導非人類AD模型方面已經(jīng)做了很多工作，包括注射模型和轉基因小鼠模型。這些模型可用于數(shù)百種潛在藥物的AD臨床前測試(Esquerda-Canals et al., 2017)。不幸的是，在數(shù)百種臨床前成功的候選藥物中，只有5種獲得了市場批準。在臨床試驗中未能取得成功可能是因為這些模型考慮了毒性APP和/或tau突變蛋白的表達，而忽略了其他與疾病相關的下降，如與Nrf2相關的穩(wěn)態(tài)功能。雖然Nrf2敲除小鼠表現(xiàn)出與衰老和AD共同的特征(Rojo et al., 2017)，但該模型是否與AD病理更相關還需要更多的努力來驗證。
7.3. 能否通過血腦屏障(BBB)
為了達到預期的藥理學效果，需要考慮許多候選藥物的因素，包括生物利用度、代謝穩(wěn)定性、溶解性和細胞通透性。此外，藥物應表現(xiàn)出更多的親和力，或至少可以達到目標器官的足夠劑量(Krogsgaard-Larsen et al., 2005)。因此，要激活AD神經(jīng)元中的Nrf2，藥物必須以足夠的濃度到達AD腦損傷區(qū)，使其能夠發(fā)揮作用。血腦屏障是保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)的天然屏障，通過阻止神經(jīng)毒性血漿物種、血細胞和病原體進入大腦。不能跨越血腦屏障的藥物獲得AD臨床試驗成功的機會很低(Pardridge, 2019)。細胞培養(yǎng)研究可能大大高估了測試藥物的活性。由于生物利用度低，這些候選藥物在臨床試驗中可能表現(xiàn)出令人失望的結果。分子量< 450道爾頓、極性表面積< 90 A2和氫鍵供體數(shù)< 3的藥物更有可能穿透血BBB (Hanson and Frey, 2008)。這些通用指南為中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的設計和開發(fā)提供了初步考慮。然而，血腦屏障的侵徹能力必須通過實驗來評估。因此，需要在親脂性、分子構型和分子大小之間實現(xiàn)神奇的結合和平衡，才能使藥物通過血腦屏障。
7.4. 確定給藥方案
關于Nrf2激活治療AD的另一個考慮是，老年人和不太健康的受試者對Nrf2激活劑的反應降低(Hammer et al., 2018)。因此，給藥劑量必須考慮患者的年齡和健康狀況。由于Nrf2與其靶基因相比半衰期較短，因此也應通過分析藥物分布和Nrf2基因在可接近細胞或組織中的表達特征來間接推斷合適的給藥方案(Cuadrado et al., 2019)。
8. 結論
Nrf2是抗氧化系統(tǒng)的主要控制器，負責II期相解毒酶和抗氧化蛋白的組成性表達。大量的生物分子參與了Nrf2的調控，這說明了這一途徑的復雜性。AD中Nrf2、p62 GSK-3β,p38和NF -κB-p65水平發(fā)生改變。大量證據(jù)表明，Nrf2具有在各種AD模型中降低OS、炎癥和線粒體功能障礙的能力(圖5)。有趣的是，Nrf2也可以抑制BACE1的表達，并改善Aβ介導的毒性。Nrf2還能降低AD模型中p-tau和認知缺陷的水平。幾種Nrf2激活劑在不同的AD動物模型中顯示了良好的效果。基于這些研究，以及并沒有FDA批準新的藥物用于臨床治療AD， Nrf2激活似乎是一種新穎而有吸引力的治療方法。然而，我們并不認為這種治療方法會比其他方法更容易。Nrf2通路本身復雜，可通過不同的機制激活。此外，Nrf2激活劑的開發(fā)也面臨著許多挑戰(zhàn)。用親電共價抑制劑攻擊Keap1中的Cys殘基是Nrf2激活的最常見機制。不幸的是，這種類型的活化劑通常缺乏選擇性。低選擇性藥物有望引起廣泛的副作用。有幾種方法可以用來解決這個問題，包括開發(fā)PPI抑制劑和非共價Keap1抑制劑。缺乏理想的AD動物模型是AD藥物發(fā)現(xiàn)領域的另一個障礙。到目前為止，關于Nrf2激活在人類AD大腦中的作用的信息很少。最近在AD臨床試驗中加入的Nrf2激活因子，如蘿卜硫素，可能為Nrf2激活在AD中的結果提供有價值的信息。
圖1：AD大腦遭受氧化應激。(a)線粒體功能障礙可能導致ROS產(chǎn)生增加和細胞凋亡。(b)在AD中觀察到廣泛的脂質過氧化。(c) AD大腦還顯示出神經(jīng)毒性微量元素如鐵、鋁、銅和汞的水平提高，這些元素可誘導自由基的形成(鐵就是一個例子)。(d)高水平Aβ(Aβ42;PDB: 5kk3)也可促進AD腦內的氧化應激。(e)高水平的ROS可能攻擊DNA，因此AD腦顯示更多的氧化DNA(鳥嘌呤為例)。
圖2：Nrf2和Keap1蛋白不同結構域的示意圖。(a) Nrf2的七個Neh域及其功能。(b) Keap1的五個代表性區(qū)域和幾個重要的半胱氨酸傳感器在不同區(qū)域發(fā)現(xiàn)。
圖3：Nrf2的keap1依賴性和非依賴調控機制。在基礎條件下，Keap1-Cul3復合物與Nrf2結合并介導其泛素化和降解。p62可能通過與Keap1結合，導致Keap1的自噬降解，從而減少了這一過程，從而增加了細胞核中Nrf2的積累。GSK-3β和p38 MAPK可使Nrf2在Neh6區(qū)域磷酸化并有利于其降解。相反，PKC、CK2 PERK、JNK1和ERK2介導的Nrf2磷酸化促進了Nrf2與Keap1的分離和核積累。在細胞核中，Nrf2與轉錄共激活因子Mafs形成異源二聚體，促進與ARE的穩(wěn)定結合并增強基因轉錄。Fyn激酶可能使Nrf2在Tyr568處磷酸化，有利于其核出口。Bach1與Nrf2競爭結合導致Nrf2轉錄能力下降。NF-κB也通過與ARE結合與Nrf2競爭, 下調其轉錄活性。
圖4：AD中Nrf2與一個高亮區(qū)域(藍色)和p-tau(灰色)相互作用的示意圖。Aβ通過內含體中BACE1和γ-分泌酶的蛋白水解功能從APP中衍生出來。Aβ分泌入組織間液，可導致Nrf2水平降低。Aβ可聚集成寡聚體和原纖維，對細胞功能有許多影響，包括突觸活性受損和腦毛細血管血流量受損。Nrf2的激活降低了BACE1的轉錄水平，從而降低了Aβ的產(chǎn)生。Nrf2還可能降低聚合Aβ的水平，從而減少AD淀粉樣蛋白的病理。錯誤折疊的MAPT和p-tau蛋白的積累可能導致成對螺旋絲的形成(PHF;PDB: 6HRE)，隨后跨突觸傳播到遠處的神經(jīng)元。Nrf2的激活可能會增加參與選擇性自噬過程的p62和NDP52的水平。P62還可以促進不溶性MAPT的降解，從而降低神經(jīng)纖維纏結(NFTs)水平。Nrf2可能預防p-tau誘導的神經(jīng)退行性變，也可能減少p-tau的聚集。因此，Nrf2的激活導致AD tau的病理減少。
圖5：Nrf2在AD中的作用的簡化說明。Nrf2通過(上調/下調)調控多個下游靶點來抑制AD的幾個關鍵致病特征。
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