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Nrf2缺乏對(duì)老年骨骼肌線粒體氧化應(yīng)激的影響
發(fā)表于：2021-07-06 作者：admin 來(lái)源：本站 點(diǎn)擊量：10927
原文：Yu K , Tamura Y , Takahashi K , et al. Effects of Nrf2 deficiency on mitochondrial oxidative stress in aged skeletal muscle[J]. Physiological Reports, 2019, 7(3).
翻譯：
2日本東京日本體育科學(xué)大學(xué)運(yùn)動(dòng)生理學(xué)系
3日本東京大學(xué)體育科學(xué)系
4日本筑波大學(xué)綜合人類科學(xué)研究科
關(guān)鍵詞 衰老，線粒體，氧化應(yīng)激，骨骼肌肉
摘要 氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙與衰老過(guò)程有關(guān)。然而，核因子紅細(xì)胞系2相關(guān)因子2（Nrf2）在衰老過(guò)程中對(duì)骨骼肌的作用仍有待闡明。在目前的研究中，我們?cè)u(píng)估了缺乏Nrf2，它被稱為氧化還原穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子，是否會(huì)促進(jìn)骨骼肌中與年齡相關(guān)的線粒體功能障礙和肌肉萎縮。在這里，我們揭示了在老年Nrf2敲除的（KO）小鼠中，由于Nrf2-靶向抗氧化基因的表達(dá)降低，線粒體中氧化應(yīng)激的標(biāo)志物4-羥基壬烯醛和蛋白質(zhì)羰基強(qiáng)烈升高。線粒體呼吸隨著衰老而下降，然而，敲除Nrf2 和年齡匹配的野生型小鼠之間沒(méi)有差異。類似地，與年輕野生型小鼠相比，老年野生型和敲除Nrf2 小鼠中的細(xì)胞色素c氧化酶活性較低。老年敲除Nrf2 小鼠肌肉中Mfn1和Mfn2 mRNA的表達(dá)較低。在老化的敲除Nrf2小鼠中，每消耗氧氣的線粒體活性氧產(chǎn)生增加。敲除Nrf2 對(duì)體重歸一化的肌肉質(zhì)量沒(méi)有影響。這些結(jié)果表明，Nrf2缺乏會(huì)加劇與年齡相關(guān)的線粒體氧化應(yīng)激，但不會(huì)影響骨骼肌呼吸功能的下降。
引言
衰老的特征在于骨骼肌質(zhì)量和功能的喪失，這種現(xiàn)象稱為肌肉減少癥。這種肌肉功能的喪失導(dǎo)致身體虛弱和死亡的風(fēng)險(xiǎn)增加（Cruz-Jentoft等，2010）。因此，了解肌肉萎縮隨老化的機(jī)制對(duì)于識(shí)別治療目標(biāo)和促進(jìn)健康非常重要。衰老過(guò)程被認(rèn)為是由氧化應(yīng)激驅(qū)動(dòng)的，最初由Harman 于1956年提出作為自由基理論。鑒于線粒體電子傳遞鏈?zhǔn)腔钚匝酰≧OS）的主要來(lái)源，線粒體被認(rèn)為在肌肉減少癥中起著至關(guān)重要的作用。與該假設(shè)一致，許多研究表明老年骨骼肌中ROS產(chǎn)生增加，與線粒體功能障礙和線粒體細(xì)胞凋亡易感性增加相關(guān)（Chabi等2008; Dai等2014）。然而，升高的ROS產(chǎn)生是否與肌肉萎縮和衰老有因果關(guān)系仍待澄清。
Nrf2是一種轉(zhuǎn)錄因子，被認(rèn)為是抗氧化基因的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子（Motohashi和Yamamoto 2004）。響應(yīng)于氧化應(yīng)激，Nrf2易位到細(xì)胞核中并與其靶抗氧化基因的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合。我們以前曾報(bào)道Nrf2缺乏會(huì)加重年輕小鼠骨骼肌中去神經(jīng)支配誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，而對(duì)肌肉質(zhì)量的損失幾乎沒(méi)有影響（Kitaoka等，2016）。然而，據(jù)報(bào)道，Nrf2缺乏對(duì)抗氧化酶的影響在老年骨骼肌中比在幼小動(dòng)物肌肉中更大（Miller等，2012）。有趣的是，Nrf2的消融導(dǎo)致與年齡相關(guān)的氧化應(yīng)激狀態(tài)中的肌肉再生受損（Narasimhan等，2014）。為了探討Nrf2信號(hào)可能參與衰老過(guò)程，我們?cè)u(píng)估了Nrf2的缺乏是否促進(jìn)骨骼肌中與年齡相關(guān)的線粒體氧化應(yīng)激和肌肉萎縮。
方法
動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
敲除Nrf2小鼠獲自Jackson 實(shí)驗(yàn)室（Bar Harbor，ME）。如先前報(bào)道的那樣通過(guò)尾部DNA的PCR分析對(duì)小鼠進(jìn)行基因分型（Kitaoka等，2016）。將動(dòng)物分組飼養(yǎng)（每籠3-4只），在空調(diào)房間中，在12小時(shí)光照，12小時(shí)黑暗環(huán)境中循環(huán)，隨意給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和水。使用老年雄性（22個(gè)月大）Nrf2敲除小鼠和年輕（4個(gè)月大）和年齡匹配（22個(gè)月大）雄性野生型C57BL / 6J（WT）小鼠（每組n = 6-7）。通過(guò)頸脫位使動(dòng)物安樂(lè)死，迅速取出肌肉，快速冷凍，并在-80℃下儲(chǔ)存。所有實(shí)驗(yàn)均由東京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)。
RNA分離和實(shí)時(shí)定量PCR
在Trizol試劑（Life Technologies，Gaithersburg，MD）中將腓腸肌在冰上勻漿，然后用氯仿分離成有機(jī)相和水相。在用乙醇沉淀后，使用RNeasy Mini試劑盒（Qiagen）從水相中分離總RNA。在通過(guò)分光光度法（Nanodrop ND1000，Thermo Scientific，Waltham，MA）測(cè)量RNA濃度后，使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA）進(jìn)行第一鏈cDNA合成。Nrf2，Nqo1（NAD（P）H醌氧化還原酶1），Cat（過(guò)氧化氫酶），Gclc（谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基），Sod1（超氧化物歧化酶1），Sod2，F(xiàn)is1（裂變，線粒體1），Drp1的表達(dá)（啟動(dòng)相關(guān)蛋白1），Mfn1（mitofusin 1），Mfn2，Opa1（視神經(jīng)萎縮1）使用Thermal Cycler Dice Real-Time System和SYBR Premix Ex taq II（Takara Bio，Shiga，Japan）定量。所有樣品一式兩份進(jìn)行。Tbp（TATA盒結(jié)合蛋白）用作對(duì)照基因，其表達(dá)在各組之間沒(méi)有改變。上述基因的正向和反向引物如表1所示。
線粒體分離
如前所述使用差速離心分離線粒體級(jí)分（Tamura等，2015）。簡(jiǎn)言之，將股四頭肌肌肉在線粒體分離緩沖液（67mm蔗糖，50mm Tris，50mm KCl，10mm EDTA和0.2％（w / v）無(wú)脂肪酸的牛血清白蛋白，pH7.4）中輕度均質(zhì)化。將勻漿在4℃下以700g離心15分鐘，并將上清液在12,000g下離心20分鐘。洗滌沉淀，并重懸于線粒體分離緩沖液中。在分離程序后，使用二辛可寧酸（BCA）蛋白質(zhì)測(cè)定法（Pierce，Rockford，IL）定量樣品的總蛋白質(zhì)含量。線粒體樣品用于分析4-HNE，蛋白質(zhì)羰基，線粒體呼吸和ROS產(chǎn)生。我們通過(guò)蛋白質(zhì)印跡使用針對(duì)甘油醛-3-磷酸脫氫酶（細(xì)胞溶質(zhì)標(biāo)記物）和細(xì)胞色素c氧化酶（COX）亞基IV（線粒體標(biāo)記物;數(shù)據(jù)未顯示）的抗體證實(shí)了線粒體部分的純度。此外，通過(guò)在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中添加外源細(xì)胞色素來(lái)驗(yàn)證我們的線粒體分離方法的完整性。
整個(gè)肌肉裂解物
腓腸肌在放射免疫沉淀試驗(yàn)（RIPA）緩沖液（25 mmol / L Tris HCl，pH 7.6,150 mmol / L NaCl，1％NP-40，1％脫氧膽酸鈉和0.1％十二烷基硫酸鈉[SDS]）中均質(zhì)化，用蛋白酶抑制劑物（Complete Mini，ETDA-free，Roche Applied Science，Indianapolis，IN）和磷酸酶抑制劑（PhosSTOP，Roche Applied Science）混合。使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定法（Pierce）定量樣品的總蛋白質(zhì)含量。
蛋白質(zhì)印跡
將等量的蛋白質(zhì)加載到10％SDS-PAGE凝膠上并通過(guò)電泳分離。 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，蛋白質(zhì)印跡使用4-HNE（4-羥基壬烯醛; ab48506） ，Total OXPHOS Rodent WB Antibody Cocktail （ab110413），F(xiàn)is1（ab96764），Drp1（ab56788），Mfn2（ab 124773） 來(lái)自美國(guó)劍橋；Opa1（#612606）來(lái)自日本東京。胭脂紅染色用于驗(yàn)證一致負(fù)荷。使用C印跡掃描儀（LI-COR，Lincoln，NE）掃描并定量印跡。
蛋白質(zhì)羰基含量
用市售試劑盒（＃ROIK03; SHIMA 實(shí)驗(yàn)室，東京，日本）測(cè)量蛋白質(zhì)羰基含量。在如上所述將線粒體蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，使膜與二硝基苯肼（DNPH）反應(yīng)，然后進(jìn)行Western印跡。
酶活性
將脛骨前肌在100（v / w）的100mmol / L磷酸鉀緩沖液中勻漿。按照已建立的方案（Spinazzi等，2012），通過(guò)分光光度法測(cè)量檸檬酸合酶（CS）和COX的最大活性。如前所述（Hadwan，2018）使用分光光度法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活性。使用Superoxide Dismutase Assay Kit（706002，Cayman，Ann Arbor，MI）按照制造商的說(shuō)明測(cè)定總SOD（Mn-SOD和Cu / Zn-SOD）活性。
線粒體呼吸
將新鮮分離的線粒體（60μg）在反應(yīng)緩沖液（250mmol / L蔗糖，10mmol / L Tris，1mmol / L MgCl 2）中溫育。 使用具有MitoXpress Xtra熒光傳感器試劑（Agilent Technology，Santa Clara，CA）的Tecan Spark多模板讀數(shù)器測(cè)量線粒體氧消耗，以測(cè)量溶解氧水平（Ex：380nm / Em：670nm）。通過(guò)添加10mmol / L琥珀酸鹽和1mol / L魚藤酮和2.5mmol / L ADP來(lái)刺激復(fù)合物II驅(qū)動(dòng)的III期呼吸。使用操作軟件計(jì)算每分鐘的相對(duì)熒光變化。
線粒體活性氧生成
將新鮮分離的線粒體（20μg）在線粒體呼吸緩沖液和50μl/ L 2'7'-二氯熒光素（DCF）中孵育。通過(guò)添加10mmol / L琥珀酸鹽和11mol / L魚藤酮和2.5mmol / L ADP，在狀態(tài)III呼吸條件下測(cè)量ROS發(fā)射。使用Tecan多模板讀數(shù)器測(cè)量相對(duì)熒光變化（Ex：480nm / Em：520nm）。
統(tǒng)計(jì)分析
數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）。進(jìn)行單向方差分析（ANOVA），然后進(jìn)行Bonferroni多重比較試驗(yàn)（GraphPad Prism 6.0，La Jolla，CA）。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性定義為P <0.05。
結(jié)果
骨骼肌質(zhì)量和肌肉減少指數(shù)
動(dòng)物特征如圖1所示。老年敲除Nrf2小鼠體重比老年野生型小鼠輕（圖1A）。為了研究衰老和Nrf2缺乏對(duì)骨骼肌質(zhì)量的影響，我們測(cè)量了腓腸肌和脛骨前肌的絕對(duì)質(zhì)量，以及肌肉減少指數(shù)（肌肉質(zhì)量/體重）。與老年野生型小鼠相比，老年敲除Nrf2小鼠的絕對(duì)肌肉質(zhì)量較低（圖1B）。衰老降低肌肉減少指數(shù)，然而，Nrf2缺乏沒(méi)有影響（圖1C）。
圖1 老年敲除Nrf2小鼠的體重，骨骼肌質(zhì)量和肌肉減少指數(shù)。 （A）體重。（B）腓腸肌和脛骨前肌肉質(zhì)量。 （C）肌肉減少指數(shù)（每體重肌肉質(zhì)量）。 數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。每組n = 6-7。* P <0.05 ** P <0.01，與年輕野生型有顯著差異。＃P <0.05 ## P <0.01，與老年野生型相比有顯著差異。WT，野生型; KO，敲除。
圖2.老年敲除Nrf2小鼠中的Nrf2靶抗氧化基因。 數(shù)據(jù)表示為平均值±每組SEM n = 5-7。* P <0.05 ** P <0.01，與年輕野生型有顯著差異。＃P <0.05 ## P <0.01，與老年野生型的差異。 WT，野生型；KO，敲除。
抗氧化基因表達(dá)和氧化應(yīng)激
與野生型小鼠相比，通過(guò)不可檢測(cè)的mRNA表達(dá)證實(shí)Nrf2的敲除。衰老對(duì)Nrf2及其主要靶基因（Nqo1，Cat，Gclc，Sod1和Sod2）的mRNA表達(dá)沒(méi)有影響。Nrf2靶向抗氧化基因的表達(dá)在老年敲除Nrf2肌肉中減少，除Sod2，其他沒(méi)有改變（圖2）。為了檢測(cè)線粒體氧化損傷，我們測(cè)量了線粒體組分中4-HNE（脂質(zhì)過(guò)氧化標(biāo)記物）和蛋白質(zhì)羰基含量（蛋白質(zhì)氧化標(biāo)記物）的水平。敲除Nrf2小鼠顯示4-HNE（圖3A）和蛋白質(zhì)羰基含量顯著增加（圖3B）。與年輕野生型小鼠相比，敲除Nrf2小鼠的過(guò)氧化氫酶活性較低，而總SOD活性未改變（圖4）。
線粒體功能和動(dòng)力學(xué)
為了檢測(cè)線粒體含量，我們首先測(cè)量了CS和COX的最大活性，代表了TCA循環(huán)和電子傳遞鏈。老年野生型和敲除Nrf2小鼠的COX活性較低，而各組間CS活性無(wú)差異（圖4）。接下來(lái)，我們測(cè)量線粒體呼吸和ROS產(chǎn)生作為線粒體功能的指標(biāo)。隨著年齡的增長(zhǎng)，線粒體呼吸減少，而老年敲除Nrf2小鼠的ROS產(chǎn)生更高（圖5A和B）。為了進(jìn)一步評(píng)估線粒體質(zhì)量，我們?cè)u(píng)估了線粒體動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。老年肌肉中Drp1 mRNA較高，而老年敲除Nrf2小鼠中Mfn1和Mfn2 mRNA較低（圖6）。在蛋白質(zhì)水平，敲除Nrf2導(dǎo)致線粒體復(fù)合物I和II減少，而III，IV和V保持不變（圖7A）。雖然Mfn2蛋白含量的下降接近顯著性（P = 0.10），但Nrf2缺乏對(duì)線粒體融合和裂變蛋白沒(méi)有影響（圖7B）。
圖3.老年敲除Nrf2小鼠的線粒體氧化應(yīng)激。 A）線粒體4-HNE含量。 B）線粒體蛋白質(zhì)羰基。 數(shù)據(jù)表示為平均值±每組SEM n = 5-7。 * P <0.05 ** P <0.01，與年輕野生型有顯著差異。 ＃P <0.05，與老年野生型的差異。WT，野生型；KO，淘汰賽
圖4.老年敲除Nrf2小鼠中的酶活性。 數(shù)據(jù)表示為平均值±每組SEM n = 5-7。 * P <0.05 ** P <0.01，與年輕野生型有顯著差異。 WT，野生型; KO，淘汰賽。
圖5.老年敲除Nrf2小鼠的線粒體功能。 A）線粒體呼吸期間的耗氧率。 B）每消耗氧氣的線粒體ROS產(chǎn)生。 數(shù)據(jù)表示為平均值±每組SEM n = 5-7。 * P <0.05 ** P <0.01，與年輕野生型有顯著差異。 ＃P <0.05，與老年野生型的差異。 WT，野生型; KO，淘汰賽。
圖6.老年敲除Nrf2小鼠中的線粒體動(dòng)力學(xué)基因。 數(shù)據(jù)表示為平均值±每組SEM n = 5-7。 * P <0.05，與年輕野生型有顯著差異。 ## P <0.01，與老年野生型的差異。WT，野生型；KO，淘汰賽。
圖7.來(lái)自老年敲除Nrf2小鼠的全肌裂解物中的線粒體蛋白水平。 A）線粒體OXPHOS蛋白。 B）線粒體融合和裂變調(diào)節(jié)蛋白。 數(shù)據(jù)表示為平均值±每組SEM n = 5-7。 * P <0.05，與WTYOUNG有顯著差異。 ＃P <0.05，與老年的差異。 WT，野生型; KO，淘汰賽。
討論
盡管線粒體被認(rèn)為是肌肉減少癥的主要潛在介質(zhì)，但骨骼肌線粒體與肌肉減少癥之間關(guān)系的分子基礎(chǔ)仍不清楚。衰老對(duì)線粒體含量的影響的假設(shè)一直存在爭(zhēng)議；然而，大多數(shù)報(bào)告顯示隨著衰老而ROS產(chǎn)生增加（Carter等2015; Holloway等2018）。鑒于線粒體不僅是ROS的主要來(lái)源，而且也是氧化損傷的目標(biāo)，ROS可能會(huì)產(chǎn)生反饋環(huán)，從而加劇線粒體功能障礙。以前的研究調(diào)查了Nrf2與線粒體功能之間的關(guān)系（Holmstrom等，2013; Coleman等，2018）。 Nrf2的缺失導(dǎo)致小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（Holmstrom等2013）或UCP1轉(zhuǎn)基因小鼠的肌纖維中的線粒體呼吸受損（Coleman等，2018）；然而，據(jù)我們所知，尚未檢查來(lái)自老年敲除Nrf2 骨骼肌的分離的線粒體組分。在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)從老化敲除Nrf2的肌肉中分離的線粒體部分中的氧化應(yīng)激顯著增加。如早期研究中所觀察到的，Nrf2缺乏誘導(dǎo)其靶抗氧化基因表達(dá)的降低（Miller等，2012; Kitaoka等，2016）。重要的是，先前的研究證實(shí)了老年敲除Nrf2小鼠的整個(gè)肌肉勻漿中ROS和4-HNE水平的增加（Miller等，2012; Narasimhan等，2014）。目前使用分離的線粒體組分的研究表明氧化還原平衡被改變?yōu)檠趸瘧?yīng)激的積累，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是線粒體毒性的指標(biāo)。然而，盡管線粒體氧化應(yīng)激升高，但Nrf2缺乏對(duì)老年骨骼肌中線粒體呼吸和肌肉減少指數(shù)沒(méi)有影響。最后，我們?cè)u(píng)估了與線粒體融合和裂變相關(guān)的基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，這是維持功能性線粒體的重要過(guò)程（Yan等，2012）。形態(tài)學(xué)上，衰老誘導(dǎo)骨骼肌中的線粒體斷裂或異常增大（Iqbal等2013; Leduc-Gaudet等2015）。我們觀察到線粒體融合調(diào)節(jié)基因在老年Nrf2肌肉中適度下調(diào)，支持ROS誘導(dǎo)線粒體斷裂的概念（Fan等，2010; Iqbal和Hood，2014）。然而，在蛋白質(zhì)水平，Mfn2與Nrf2 KO的下降沒(méi)有達(dá)到顯著性。需要進(jìn)一步研究通過(guò)電子顯微鏡以檢查老年敲除Nrf2肌肉中的線粒體是否顯示異常超微結(jié)構(gòu)?？傊覀兊难芯拷Y(jié)果表明，氧化應(yīng)激不是肌肉萎縮的直接原因。我們的數(shù)據(jù)與先前使用敲除Nrf2小鼠在去神經(jīng)支配誘導(dǎo)的肌肉萎縮（Kitaoka等2016）和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病萎縮模型（Whitman等2013）中的觀察一致。
使用具有遺傳增強(qiáng)的線粒體抗氧化活性的小鼠（Umanskaya等，2014）或用線粒體保護(hù)性肽治療的小鼠（Siegel等，2013）的證據(jù)證明支持線粒體氧化損傷在年齡相關(guān)的肌肉功能障礙中的作用。此外，稱為Nrf2激活劑的蘿卜硫素的使用已經(jīng)顯示出在小鼠肌營(yíng)養(yǎng)不良模型中改善的肌肉功能（Sun等，2015）。這項(xiàng)研究的局限性在于我們沒(méi)有測(cè)量骨骼肌纖維的大小/數(shù)量和收縮功能。 Crilly等（2016）報(bào)道，與野生型動(dòng)物相比，敲除Nrf2小鼠在分離的肌肉中表現(xiàn)出更高的疲勞率。最近，Ahn等（2018）報(bào)道，與年齡匹配的野生型小鼠相比，在老年敲除Nrf2小鼠中，肌肉橫截面積歸一化的力產(chǎn)生減少。這些研究表明，由于缺乏Nrf2，高水平的ROS暴露可能改變肌肉收縮功能，不一定伴隨肌肉質(zhì)量的變化。
在這項(xiàng)研究中，我們?cè)噲D檢查Nrf2缺乏對(duì)老年骨骼肌線粒體的影響。我們證明Nrf2缺乏增強(qiáng)了老年骨骼肌中線粒體ROS的產(chǎn)生，并加劇了與年齡相關(guān)的氧化應(yīng)激，但對(duì)線粒體功能或肌肉質(zhì)量幾乎沒(méi)有影響。
利益沖突
沒(méi)有利益沖突。
參考文獻(xiàn)（略）
翻譯：
Nrf2缺乏對(duì)老年骨骼肌線粒體氧化應(yīng)激的影響
Yu Kitaoka 1 , Yuki Tamura 2 , Kenya Takahashi 3 , Kohei Takeda 4 , Tohru Takemasa 4 & Hideo Hatta3
1日本橫濱神奈川大學(xué)人文科學(xué)系Yu Kitaoka 1 , Yuki Tamura 2 , Kenya Takahashi 3 , Kohei Takeda 4 , Tohru Takemasa 4 & Hideo Hatta3
2日本東京日本體育科學(xué)大學(xué)運(yùn)動(dòng)生理學(xué)系
3日本東京大學(xué)體育科學(xué)系
4日本筑波大學(xué)綜合人類科學(xué)研究科
關(guān)鍵詞 衰老，線粒體，氧化應(yīng)激，骨骼肌肉
摘要 氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙與衰老過(guò)程有關(guān)。然而，核因子紅細(xì)胞系2相關(guān)因子2（Nrf2）在衰老過(guò)程中對(duì)骨骼肌的作用仍有待闡明。在目前的研究中，我們?cè)u(píng)估了缺乏Nrf2，它被稱為氧化還原穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子，是否會(huì)促進(jìn)骨骼肌中與年齡相關(guān)的線粒體功能障礙和肌肉萎縮。在這里，我們揭示了在老年Nrf2敲除的（KO）小鼠中，由于Nrf2-靶向抗氧化基因的表達(dá)降低，線粒體中氧化應(yīng)激的標(biāo)志物4-羥基壬烯醛和蛋白質(zhì)羰基強(qiáng)烈升高。線粒體呼吸隨著衰老而下降，然而，敲除Nrf2 和年齡匹配的野生型小鼠之間沒(méi)有差異。類似地，與年輕野生型小鼠相比，老年野生型和敲除Nrf2 小鼠中的細(xì)胞色素c氧化酶活性較低。老年敲除Nrf2 小鼠肌肉中Mfn1和Mfn2 mRNA的表達(dá)較低。在老化的敲除Nrf2小鼠中，每消耗氧氣的線粒體活性氧產(chǎn)生增加。敲除Nrf2 對(duì)體重歸一化的肌肉質(zhì)量沒(méi)有影響。這些結(jié)果表明，Nrf2缺乏會(huì)加劇與年齡相關(guān)的線粒體氧化應(yīng)激，但不會(huì)影響骨骼肌呼吸功能的下降。
引言
衰老的特征在于骨骼肌質(zhì)量和功能的喪失，這種現(xiàn)象稱為肌肉減少癥。這種肌肉功能的喪失導(dǎo)致身體虛弱和死亡的風(fēng)險(xiǎn)增加（Cruz-Jentoft等，2010）。因此，了解肌肉萎縮隨老化的機(jī)制對(duì)于識(shí)別治療目標(biāo)和促進(jìn)健康非常重要。衰老過(guò)程被認(rèn)為是由氧化應(yīng)激驅(qū)動(dòng)的，最初由Harman 于1956年提出作為自由基理論。鑒于線粒體電子傳遞鏈?zhǔn)腔钚匝酰≧OS）的主要來(lái)源，線粒體被認(rèn)為在肌肉減少癥中起著至關(guān)重要的作用。與該假設(shè)一致，許多研究表明老年骨骼肌中ROS產(chǎn)生增加，與線粒體功能障礙和線粒體細(xì)胞凋亡易感性增加相關(guān)（Chabi等2008; Dai等2014）。然而，升高的ROS產(chǎn)生是否與肌肉萎縮和衰老有因果關(guān)系仍待澄清。
Nrf2是一種轉(zhuǎn)錄因子，被認(rèn)為是抗氧化基因的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子（Motohashi和Yamamoto 2004）。響應(yīng)于氧化應(yīng)激，Nrf2易位到細(xì)胞核中并與其靶抗氧化基因的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合。我們以前曾報(bào)道Nrf2缺乏會(huì)加重年輕小鼠骨骼肌中去神經(jīng)支配誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，而對(duì)肌肉質(zhì)量的損失幾乎沒(méi)有影響（Kitaoka等，2016）。然而，據(jù)報(bào)道，Nrf2缺乏對(duì)抗氧化酶的影響在老年骨骼肌中比在幼小動(dòng)物肌肉中更大（Miller等，2012）。有趣的是，Nrf2的消融導(dǎo)致與年齡相關(guān)的氧化應(yīng)激狀態(tài)中的肌肉再生受損（Narasimhan等，2014）。為了探討Nrf2信號(hào)可能參與衰老過(guò)程，我們?cè)u(píng)估了Nrf2的缺乏是否促進(jìn)骨骼肌中與年齡相關(guān)的線粒體氧化應(yīng)激和肌肉萎縮。
方法
動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
敲除Nrf2小鼠獲自Jackson 實(shí)驗(yàn)室（Bar Harbor，ME）。如先前報(bào)道的那樣通過(guò)尾部DNA的PCR分析對(duì)小鼠進(jìn)行基因分型（Kitaoka等，2016）。將動(dòng)物分組飼養(yǎng)（每籠3-4只），在空調(diào)房間中，在12小時(shí)光照，12小時(shí)黑暗環(huán)境中循環(huán)，隨意給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和水。使用老年雄性（22個(gè)月大）Nrf2敲除小鼠和年輕（4個(gè)月大）和年齡匹配（22個(gè)月大）雄性野生型C57BL / 6J（WT）小鼠（每組n = 6-7）。通過(guò)頸脫位使動(dòng)物安樂(lè)死，迅速取出肌肉，快速冷凍，并在-80℃下儲(chǔ)存。所有實(shí)驗(yàn)均由東京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)。
RNA分離和實(shí)時(shí)定量PCR
在Trizol試劑（Life Technologies，Gaithersburg，MD）中將腓腸肌在冰上勻漿，然后用氯仿分離成有機(jī)相和水相。在用乙醇沉淀后，使用RNeasy Mini試劑盒（Qiagen）從水相中分離總RNA。在通過(guò)分光光度法（Nanodrop ND1000，Thermo Scientific，Waltham，MA）測(cè)量RNA濃度后，使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA）進(jìn)行第一鏈cDNA合成。Nrf2，Nqo1（NAD（P）H醌氧化還原酶1），Cat（過(guò)氧化氫酶），Gclc（谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基），Sod1（超氧化物歧化酶1），Sod2，F(xiàn)is1（裂變，線粒體1），Drp1的表達(dá)（啟動(dòng)相關(guān)蛋白1），Mfn1（mitofusin 1），Mfn2，Opa1（視神經(jīng)萎縮1）使用Thermal Cycler Dice Real-Time System和SYBR Premix Ex taq II（Takara Bio，Shiga，Japan）定量。所有樣品一式兩份進(jìn)行。Tbp（TATA盒結(jié)合蛋白）用作對(duì)照基因，其表達(dá)在各組之間沒(méi)有改變。上述基因的正向和反向引物如表1所示。
線粒體分離
如前所述使用差速離心分離線粒體級(jí)分（Tamura等，2015）。簡(jiǎn)言之，將股四頭肌肌肉在線粒體分離緩沖液（67mm蔗糖，50mm Tris，50mm KCl，10mm EDTA和0.2％（w / v）無(wú)脂肪酸的牛血清白蛋白，pH7.4）中輕度均質(zhì)化。將勻漿在4℃下以700g離心15分鐘，并將上清液在12,000g下離心20分鐘。洗滌沉淀，并重懸于線粒體分離緩沖液中。在分離程序后，使用二辛可寧酸（BCA）蛋白質(zhì)測(cè)定法（Pierce，Rockford，IL）定量樣品的總蛋白質(zhì)含量。線粒體樣品用于分析4-HNE，蛋白質(zhì)羰基，線粒體呼吸和ROS產(chǎn)生。我們通過(guò)蛋白質(zhì)印跡使用針對(duì)甘油醛-3-磷酸脫氫酶（細(xì)胞溶質(zhì)標(biāo)記物）和細(xì)胞色素c氧化酶（COX）亞基IV（線粒體標(biāo)記物;數(shù)據(jù)未顯示）的抗體證實(shí)了線粒體部分的純度。此外，通過(guò)在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中添加外源細(xì)胞色素來(lái)驗(yàn)證我們的線粒體分離方法的完整性。
整個(gè)肌肉裂解物
腓腸肌在放射免疫沉淀試驗(yàn)（RIPA）緩沖液（25 mmol / L Tris HCl，pH 7.6,150 mmol / L NaCl，1％NP-40，1％脫氧膽酸鈉和0.1％十二烷基硫酸鈉[SDS]）中均質(zhì)化，用蛋白酶抑制劑物（Complete Mini，ETDA-free，Roche Applied Science，Indianapolis，IN）和磷酸酶抑制劑（PhosSTOP，Roche Applied Science）混合。使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定法（Pierce）定量樣品的總蛋白質(zhì)含量。
蛋白質(zhì)印跡
將等量的蛋白質(zhì)加載到10％SDS-PAGE凝膠上并通過(guò)電泳分離。 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，蛋白質(zhì)印跡使用4-HNE（4-羥基壬烯醛; ab48506） ，Total OXPHOS Rodent WB Antibody Cocktail （ab110413），F(xiàn)is1（ab96764），Drp1（ab56788），Mfn2（ab 124773） 來(lái)自美國(guó)劍橋；Opa1（#612606）來(lái)自日本東京。胭脂紅染色用于驗(yàn)證一致負(fù)荷。使用C印跡掃描儀（LI-COR，Lincoln，NE）掃描并定量印跡。
蛋白質(zhì)羰基含量
用市售試劑盒（＃ROIK03; SHIMA 實(shí)驗(yàn)室，東京，日本）測(cè)量蛋白質(zhì)羰基含量。在如上所述將線粒體蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，使膜與二硝基苯肼（DNPH）反應(yīng)，然后進(jìn)行Western印跡。
酶活性
將脛骨前肌在100（v / w）的100mmol / L磷酸鉀緩沖液中勻漿。按照已建立的方案（Spinazzi等，2012），通過(guò)分光光度法測(cè)量檸檬酸合酶（CS）和COX的最大活性。如前所述（Hadwan，2018）使用分光光度法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活性。使用Superoxide Dismutase Assay Kit（706002，Cayman，Ann Arbor，MI）按照制造商的說(shuō)明測(cè)定總SOD（Mn-SOD和Cu / Zn-SOD）活性。
線粒體呼吸
將新鮮分離的線粒體（60μg）在反應(yīng)緩沖液（250mmol / L蔗糖，10mmol / L Tris，1mmol / L MgCl 2）中溫育。 使用具有MitoXpress Xtra熒光傳感器試劑（Agilent Technology，Santa Clara，CA）的Tecan Spark多模板讀數(shù)器測(cè)量線粒體氧消耗，以測(cè)量溶解氧水平（Ex：380nm / Em：670nm）。通過(guò)添加10mmol / L琥珀酸鹽和1mol / L魚藤酮和2.5mmol / L ADP來(lái)刺激復(fù)合物II驅(qū)動(dòng)的III期呼吸。使用操作軟件計(jì)算每分鐘的相對(duì)熒光變化。
線粒體活性氧生成
將新鮮分離的線粒體（20μg）在線粒體呼吸緩沖液和50μl/ L 2'7'-二氯熒光素（DCF）中孵育。通過(guò)添加10mmol / L琥珀酸鹽和11mol / L魚藤酮和2.5mmol / L ADP，在狀態(tài)III呼吸條件下測(cè)量ROS發(fā)射。使用Tecan多模板讀數(shù)器測(cè)量相對(duì)熒光變化（Ex：480nm / Em：520nm）。
統(tǒng)計(jì)分析
數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）。進(jìn)行單向方差分析（ANOVA），然后進(jìn)行Bonferroni多重比較試驗(yàn)（GraphPad Prism 6.0，La Jolla，CA）。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性定義為P <0.05。
結(jié)果
骨骼肌質(zhì)量和肌肉減少指數(shù)
動(dòng)物特征如圖1所示。老年敲除Nrf2小鼠體重比老年野生型小鼠輕（圖1A）。為了研究衰老和Nrf2缺乏對(duì)骨骼肌質(zhì)量的影響，我們測(cè)量了腓腸肌和脛骨前肌的絕對(duì)質(zhì)量，以及肌肉減少指數(shù)（肌肉質(zhì)量/體重）。與老年野生型小鼠相比，老年敲除Nrf2小鼠的絕對(duì)肌肉質(zhì)量較低（圖1B）。衰老降低肌肉減少指數(shù)，然而，Nrf2缺乏沒(méi)有影響（圖1C）。
圖1 老年敲除Nrf2小鼠的體重，骨骼肌質(zhì)量和肌肉減少指數(shù)。 （A）體重。（B）腓腸肌和脛骨前肌肉質(zhì)量。 （C）肌肉減少指數(shù)（每體重肌肉質(zhì)量）。 數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。每組n = 6-7。* P <0.05 ** P <0.01，與年輕野生型有顯著差異。＃P <0.05 ## P <0.01，與老年野生型相比有顯著差異。WT，野生型; KO，敲除。
圖2.老年敲除Nrf2小鼠中的Nrf2靶抗氧化基因。 數(shù)據(jù)表示為平均值±每組SEM n = 5-7。* P <0.05 ** P <0.01，與年輕野生型有顯著差異。＃P <0.05 ## P <0.01，與老年野生型的差異。 WT，野生型；KO，敲除。
抗氧化基因表達(dá)和氧化應(yīng)激
與野生型小鼠相比，通過(guò)不可檢測(cè)的mRNA表達(dá)證實(shí)Nrf2的敲除。衰老對(duì)Nrf2及其主要靶基因（Nqo1，Cat，Gclc，Sod1和Sod2）的mRNA表達(dá)沒(méi)有影響。Nrf2靶向抗氧化基因的表達(dá)在老年敲除Nrf2肌肉中減少，除Sod2，其他沒(méi)有改變（圖2）。為了檢測(cè)線粒體氧化損傷，我們測(cè)量了線粒體組分中4-HNE（脂質(zhì)過(guò)氧化標(biāo)記物）和蛋白質(zhì)羰基含量（蛋白質(zhì)氧化標(biāo)記物）的水平。敲除Nrf2小鼠顯示4-HNE（圖3A）和蛋白質(zhì)羰基含量顯著增加（圖3B）。與年輕野生型小鼠相比，敲除Nrf2小鼠的過(guò)氧化氫酶活性較低，而總SOD活性未改變（圖4）。
線粒體功能和動(dòng)力學(xué)
為了檢測(cè)線粒體含量，我們首先測(cè)量了CS和COX的最大活性，代表了TCA循環(huán)和電子傳遞鏈。老年野生型和敲除Nrf2小鼠的COX活性較低，而各組間CS活性無(wú)差異（圖4）。接下來(lái)，我們測(cè)量線粒體呼吸和ROS產(chǎn)生作為線粒體功能的指標(biāo)。隨著年齡的增長(zhǎng)，線粒體呼吸減少，而老年敲除Nrf2小鼠的ROS產(chǎn)生更高（圖5A和B）。為了進(jìn)一步評(píng)估線粒體質(zhì)量，我們?cè)u(píng)估了線粒體動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。老年肌肉中Drp1 mRNA較高，而老年敲除Nrf2小鼠中Mfn1和Mfn2 mRNA較低（圖6）。在蛋白質(zhì)水平，敲除Nrf2導(dǎo)致線粒體復(fù)合物I和II減少，而III，IV和V保持不變（圖7A）。雖然Mfn2蛋白含量的下降接近顯著性（P = 0.10），但Nrf2缺乏對(duì)線粒體融合和裂變蛋白沒(méi)有影響（圖7B）。
圖3.老年敲除Nrf2小鼠的線粒體氧化應(yīng)激。 A）線粒體4-HNE含量。 B）線粒體蛋白質(zhì)羰基。 數(shù)據(jù)表示為平均值±每組SEM n = 5-7。 * P <0.05 ** P <0.01，與年輕野生型有顯著差異。 ＃P <0.05，與老年野生型的差異。WT，野生型；KO，淘汰賽
圖4.老年敲除Nrf2小鼠中的酶活性。 數(shù)據(jù)表示為平均值±每組SEM n = 5-7。 * P <0.05 ** P <0.01，與年輕野生型有顯著差異。 WT，野生型; KO，淘汰賽。
圖5.老年敲除Nrf2小鼠的線粒體功能。 A）線粒體呼吸期間的耗氧率。 B）每消耗氧氣的線粒體ROS產(chǎn)生。 數(shù)據(jù)表示為平均值±每組SEM n = 5-7。 * P <0.05 ** P <0.01，與年輕野生型有顯著差異。 ＃P <0.05，與老年野生型的差異。 WT，野生型; KO，淘汰賽。
圖6.老年敲除Nrf2小鼠中的線粒體動(dòng)力學(xué)基因。 數(shù)據(jù)表示為平均值±每組SEM n = 5-7。 * P <0.05，與年輕野生型有顯著差異。 ## P <0.01，與老年野生型的差異。WT，野生型；KO，淘汰賽。
圖7.來(lái)自老年敲除Nrf2小鼠的全肌裂解物中的線粒體蛋白水平。 A）線粒體OXPHOS蛋白。 B）線粒體融合和裂變調(diào)節(jié)蛋白。 數(shù)據(jù)表示為平均值±每組SEM n = 5-7。 * P <0.05，與WTYOUNG有顯著差異。 ＃P <0.05，與老年的差異。 WT，野生型; KO，淘汰賽。
討論
盡管線粒體被認(rèn)為是肌肉減少癥的主要潛在介質(zhì)，但骨骼肌線粒體與肌肉減少癥之間關(guān)系的分子基礎(chǔ)仍不清楚。衰老對(duì)線粒體含量的影響的假設(shè)一直存在爭(zhēng)議；然而，大多數(shù)報(bào)告顯示隨著衰老而ROS產(chǎn)生增加（Carter等2015; Holloway等2018）。鑒于線粒體不僅是ROS的主要來(lái)源，而且也是氧化損傷的目標(biāo)，ROS可能會(huì)產(chǎn)生反饋環(huán)，從而加劇線粒體功能障礙。以前的研究調(diào)查了Nrf2與線粒體功能之間的關(guān)系（Holmstrom等，2013; Coleman等，2018）。 Nrf2的缺失導(dǎo)致小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（Holmstrom等2013）或UCP1轉(zhuǎn)基因小鼠的肌纖維中的線粒體呼吸受損（Coleman等，2018）；然而，據(jù)我們所知，尚未檢查來(lái)自老年敲除Nrf2 骨骼肌的分離的線粒體組分。在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)從老化敲除Nrf2的肌肉中分離的線粒體部分中的氧化應(yīng)激顯著增加。如早期研究中所觀察到的，Nrf2缺乏誘導(dǎo)其靶抗氧化基因表達(dá)的降低（Miller等，2012; Kitaoka等，2016）。重要的是，先前的研究證實(shí)了老年敲除Nrf2小鼠的整個(gè)肌肉勻漿中ROS和4-HNE水平的增加（Miller等，2012; Narasimhan等，2014）。目前使用分離的線粒體組分的研究表明氧化還原平衡被改變?yōu)檠趸瘧?yīng)激的積累，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是線粒體毒性的指標(biāo)。然而，盡管線粒體氧化應(yīng)激升高，但Nrf2缺乏對(duì)老年骨骼肌中線粒體呼吸和肌肉減少指數(shù)沒(méi)有影響。最后，我們?cè)u(píng)估了與線粒體融合和裂變相關(guān)的基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，這是維持功能性線粒體的重要過(guò)程（Yan等，2012）。形態(tài)學(xué)上，衰老誘導(dǎo)骨骼肌中的線粒體斷裂或異常增大（Iqbal等2013; Leduc-Gaudet等2015）。我們觀察到線粒體融合調(diào)節(jié)基因在老年Nrf2肌肉中適度下調(diào)，支持ROS誘導(dǎo)線粒體斷裂的概念（Fan等，2010; Iqbal和Hood，2014）。然而，在蛋白質(zhì)水平，Mfn2與Nrf2 KO的下降沒(méi)有達(dá)到顯著性。需要進(jìn)一步研究通過(guò)電子顯微鏡以檢查老年敲除Nrf2肌肉中的線粒體是否顯示異常超微結(jié)構(gòu)?？傊覀兊难芯拷Y(jié)果表明，氧化應(yīng)激不是肌肉萎縮的直接原因。我們的數(shù)據(jù)與先前使用敲除Nrf2小鼠在去神經(jīng)支配誘導(dǎo)的肌肉萎縮（Kitaoka等2016）和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病萎縮模型（Whitman等2013）中的觀察一致。
使用具有遺傳增強(qiáng)的線粒體抗氧化活性的小鼠（Umanskaya等，2014）或用線粒體保護(hù)性肽治療的小鼠（Siegel等，2013）的證據(jù)證明支持線粒體氧化損傷在年齡相關(guān)的肌肉功能障礙中的作用。此外，稱為Nrf2激活劑的蘿卜硫素的使用已經(jīng)顯示出在小鼠肌營(yíng)養(yǎng)不良模型中改善的肌肉功能（Sun等，2015）。這項(xiàng)研究的局限性在于我們沒(méi)有測(cè)量骨骼肌纖維的大小/數(shù)量和收縮功能。 Crilly等（2016）報(bào)道，與野生型動(dòng)物相比，敲除Nrf2小鼠在分離的肌肉中表現(xiàn)出更高的疲勞率。最近，Ahn等（2018）報(bào)道，與年齡匹配的野生型小鼠相比，在老年敲除Nrf2小鼠中，肌肉橫截面積歸一化的力產(chǎn)生減少。這些研究表明，由于缺乏Nrf2，高水平的ROS暴露可能改變肌肉收縮功能，不一定伴隨肌肉質(zhì)量的變化。
在這項(xiàng)研究中，我們?cè)噲D檢查Nrf2缺乏對(duì)老年骨骼肌線粒體的影響。我們證明Nrf2缺乏增強(qiáng)了老年骨骼肌中線粒體ROS的產(chǎn)生，并加劇了與年齡相關(guān)的氧化應(yīng)激，但對(duì)線粒體功能或肌肉質(zhì)量幾乎沒(méi)有影響。
利益沖突
沒(méi)有利益沖突。
參考文獻(xiàn)（略）
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