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核因子NF-E2相關(guān)因子（Nrf2）激活后通過(guò)調(diào)節(jié)骨骼肌氧化還原增加運(yùn)動(dòng)耐力
發(fā)表于：2021-05-13 作者：admin 來(lái)源：本站 點(diǎn)擊量：18918
原文：Oh S , Komine S , Warabi E , et al. Nuclear factor (erythroid derived 2)-like 2 activation increases exercise endurance capacity via redox modulation in skeletal muscles[J]. Rep, 2017, 7(1):12902.
翻譯：
蘿卜硫素(SFN)通過(guò)激活核因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf2)信號(hào)通路，在預(yù)防氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。SFN可通過(guò)對(duì)抗運(yùn)動(dòng)過(guò)程中氧化應(yīng)激引起的損傷提高運(yùn)動(dòng)耐力。我們通過(guò)力竭跑步測(cè)試（連續(xù)漸進(jìn)式力竭測(cè)試）評(píng)估跑步能力，并檢測(cè)氧化應(yīng)激和肌肉損傷標(biāo)志物的表達(dá)。在測(cè)試之前，給予12至13周齡雄性野生型（Nrf2 +/+）和Nrf2缺失（Nrf2 -/-）C57BL / 6J小鼠SFN腹膜注射或溶媒注射。注射SFN的Nrf2+/+小鼠奔跑距離明顯大于未注射SFN的小鼠。隨著Nrf2信號(hào)和下游基因的上調(diào)，運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)后，注射SFN的Nrf2+/+小鼠氧化應(yīng)激標(biāo)志物明顯低于未注射SFN的小鼠。在力竭運(yùn)動(dòng)條件下，SFN對(duì)Nrf2+/+小鼠肌肉損傷的保護(hù)作用強(qiáng)于Nrf2 -/-小鼠。SFN誘導(dǎo)的Nrf2上調(diào)及其抗氧化作用可能通過(guò)減少過(guò)度運(yùn)動(dòng)引起的氧化應(yīng)激在減輕肌肉疲勞方面發(fā)揮重要作用。這進(jìn)而提高了運(yùn)動(dòng)耐力。這些結(jié)果為SFN誘導(dǎo)的Nrf2上調(diào)及其在改善運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)中的作用提供了新的見(jiàn)解。
肌肉收縮過(guò)程中活性氧(ROS)的產(chǎn)生增加（1，2）。雖然生物系統(tǒng)能夠?qū)钚匝跫捌浞磻?yīng)中間體進(jìn)行解毒，但在肌肉重復(fù)或長(zhǎng)時(shí)間收縮期間，活性氧水平的持續(xù)升高可能會(huì)導(dǎo)致正常氧化還原狀態(tài)的失衡，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激（3）。力竭運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練尤其能促進(jìn)ROS的產(chǎn)生（4）。長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致骨骼肌結(jié)構(gòu)損傷和收縮功能障礙（3，5）。以這種方式，骨骼肌氧化還原紊亂導(dǎo)致進(jìn)行性肌肉無(wú)力和疲勞（即力量減小和收縮速度減慢）。這些現(xiàn)象表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)耐力下降（2，3，5-7）。
最近的研究強(qiáng)調(diào)了核因子NF-E2相關(guān)因子 (Nrf2)在抗氧化反應(yīng)元件(ARE)驅(qū)動(dòng)的內(nèi)源性抗氧化/外源性解毒酶表達(dá)中的作用，以及Nrf2在減輕氧化損傷中的作用。調(diào)節(jié)NRF2相關(guān)的抗氧化信號(hào)可以保護(hù)組織和器官的氧化還原和功能穩(wěn)態(tài)（9）。
蘿卜硫素(SFN)是十字花科植物產(chǎn)生的一種化學(xué)預(yù)防化合物，是Nrf2的有效激活劑（10）。許多研究表明，SFN誘導(dǎo)的Nrf2激活可能對(duì)氧化應(yīng)激損傷的各種器官發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用（11）。Malaguti等報(bào)道SFN通過(guò)Nrf2-ARE通路調(diào)節(jié)肌肉氧化還原環(huán)境，減輕骨骼肌損傷（12）。SFN的抗氧化活性可能通過(guò)減少運(yùn)動(dòng)引起的氧化應(yīng)激性肌肉疲勞，從而提高運(yùn)動(dòng)耐力（2，3，5-7）。
本研究利用SFN激活小鼠的Nrf2-ARE通路。我們?cè)u(píng)估了Nrf2激活對(duì)運(yùn)動(dòng)耐力的影響，方法是通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行力竭性(漸進(jìn)性-持續(xù)性)跑步試驗(yàn)來(lái)估計(jì)它們的跑步距離。然后檢測(cè)小鼠肌肉中氧化應(yīng)激和組織損傷標(biāo)志物的表達(dá)。
結(jié)果
基線評(píng)估。右下肢深部腓腸肌中央部分肌肉纖維的ATP酶染色橫截面分別來(lái)自SFN注射或溶媒注射的Nrf2 +/+和Nrf2 -/-小鼠（圖2A）。在Nrf2 +/+和Nrf2 -/- 小鼠中，I型和II型纖維的直徑?jīng)]有顯著差異。四次SFN注射后纖維直徑?jīng)]有變化（圖2B）。 Nrf2 +/+和Nrf2 -/-小鼠之間I型與II型肌肉比率的比值沒(méi)有顯著差異。在四次SFN注射后，這些比率沒(méi)有顯著改變（圖2C）。各組各暗、光周期的能量消耗(圖2D)和呼吸商（RQ）(圖2E)無(wú)顯著差異。各組ATP(圖2F)、糖原(圖2G)、cAMP(圖2H)平均水平無(wú)顯著差異。這些數(shù)據(jù)表明Nrf2基因型和SFN注射在基線時(shí)對(duì)肌肉纖維形態(tài)、生理或代謝無(wú)明顯影響。
線粒體生物發(fā)生。圖3顯示了基線時(shí)腓腸肌勻漿中線粒體生物發(fā)生生物標(biāo)志物。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，在四次SFN注射后，磷酸化AMPKα在Nrf2 +/+ [SFN]小鼠中顯著增加（圖3A）。然而，所有組中SirT1和PGC1α的蛋白質(zhì)表達(dá)沒(méi)有顯著差異。圖3B顯示線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物的mRNA表達(dá)，包括NRF-1、TFAM、p53R2、COX IV、SCO1和SCO2。在任何組中均未檢測(cè)到mRNA表達(dá)升高。相對(duì)于nDNA, mtDNA拷貝數(shù)升高。這被認(rèn)為是線粒體生物發(fā)生的良好標(biāo)志物（15）。在Nrf2+/+小鼠和Nrf2 -/-組第四次注射SFN后，mtDNA拷貝數(shù)無(wú)顯著差異(圖3C)。這些數(shù)據(jù)表明，激活線粒體生物發(fā)生信號(hào)與SFN注射之間的聯(lián)系很弱，而SFN注射僅進(jìn)行了四次。
發(fā)光活性。圖4A顯示在轉(zhuǎn)基因OKD48（Keap1依賴(lài)性氧化應(yīng)激檢測(cè)器，No-48-熒光素酶）小鼠中SFN注射期間Nrf2應(yīng)答的實(shí)時(shí)體內(nèi)成像。OKD48小鼠表達(dá)Nrf2-Luc融合蛋白N-末端一半，由基于Nrf2的3xAre啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)（13）。在Nrf2 +/+ [CON]和Nrf2 -/- [CON]小鼠中未檢測(cè)到Nrf2-Luc活化。在力竭平板試驗(yàn)前不久，在第四次SFN注射（75小時(shí)）后3小時(shí)，在Nrf2 +/+ [SFN]小鼠中觀察到顯著的Nrf2上調(diào)[圖4A（a）和（b）]。在SFN注射期間，在Nrf2 +/+ [SFN]小鼠中Nrf2-Luc活化在基線、24、48、72和75小時(shí)逐漸增加[圖S1（a），（b），（c），（d）和（e）]。Nrf2-Luc在Nrf2 +/+ [CON]和Nrf2 -/- [CON]組中未被激活。腓腸肌的熒光素酶活性如圖4B所示。Nrf2-Luc在75小時(shí)Nrf2 +/+ [SFN]小鼠的肌肉中上調(diào)。這一變化明顯高于其他組（P <0.01）。這些結(jié)果表明SFN預(yù)處理上調(diào)Nrf2。
Nrf2靶基因。圖4C，D顯示所選Nrf2靶基因的mRNA水平：血紅素加氧酶-1（HO-1）、NAD（P）H：醌氧化還原酶A（NQO1）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）和過(guò)氧化氫酶。在有和沒(méi)有SFN預(yù)處理的腓腸?。▓D4C）和比目魚(yú)?。▓D4D）組織勻漿中檢測(cè)這些基因mRNA水平。與Nrf2 -/- 組（Nrf2 -/- [SFN]和Nrf2 -/- [CON]）相比，Nrf2 +/+ [SFN]小鼠在腓腸肌和比目魚(yú)肌中所有靶基因的表達(dá)水平顯著增高。在兩個(gè)Nrf2 +/+組之間，腓腸肌過(guò)氧化氫酶沒(méi)有上調(diào)。與Nrf2+/+[CON]小鼠相比，Nrf2+/+[SFN]小鼠比目魚(yú)中HO-1沒(méi)有上調(diào)。然而，Nrf2 +/+ [SFN]小鼠組織中其他Nrf2靶基因的表達(dá)水平顯著高于Nrf2 +/+ [CON]：Nrf2 +/+[CON]小鼠腓腸肌和比目魚(yú)肌的NQO1和γ-GCS表達(dá)水平顯著高于Nrf2 -/-小鼠。
運(yùn)動(dòng)耐力和能量代謝參數(shù)。圖5A為跑步距離測(cè)試結(jié)果，該測(cè)試作為運(yùn)動(dòng)耐力的評(píng)價(jià)指標(biāo)。Nrf2+/+小鼠比Nrf2 -/-小鼠跑得更遠(yuǎn)。在Nrf2+/+組中，Nrf2 +/+[SFN]小鼠的跑步距離大于Nrf2 +/+[CON]小鼠。圖5B為每組跑步期間耗氧量(VO2)和RQ，以及記錄的跑步距離中值。圖5C和D顯示了在50分鐘的跑步機(jī)測(cè)試中，各組的平均VO2和RQ水平。運(yùn)動(dòng)40分鐘后各組VO2水平無(wú)顯著差異。在41 - 50min期間，Nrf2 -/-組VO2水平高于Nrf2 +/+組。但四組間的平均RQ在時(shí)間周期上無(wú)顯著差異。在基線和50min后，四組的血清葡萄糖和游離脂肪酸(FFAs)水平無(wú)顯著差異(圖5E和F)。
氧化應(yīng)激和肌肉損傷的生物標(biāo)志物。圖6A顯示在測(cè)試結(jié)束后50分鐘和18小時(shí)的徹底測(cè)試后，基線時(shí)腓腸肌勻漿中硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)（TBARS）的水平。在基線和50分鐘期間，所有組顯示出相當(dāng)?shù)腡BARS水平。然而，在試驗(yàn)后18小時(shí)，Nrf2 +/+小鼠的TBARS水平明顯低于Nrf2 -/-小鼠。SFN注射N(xiāo)rf2 +/+小鼠的TBARS水平低于未注射N(xiāo)rf2 +/+小鼠。對(duì)于基線的GSSG/GSH比值，所有組也顯示出可比性。然而，在試驗(yàn)結(jié)束后50分鐘，Nrf2 +/+小鼠注射SFN后，GSSG/GSH比值低于Nrf2 -/-組(圖6A)。圖6B顯示了在基線和跑步機(jī)測(cè)試50分鐘后各組肌肉損傷標(biāo)志物肌酸磷酸激酶(CPK)和乳酸脫氫酶(LDH)的血清水平。在基線時(shí)，Nrf2 +/+組的CPK水平明顯高于Nrf2 -/-組。在跑步機(jī)疲勞試驗(yàn)50分鐘時(shí)，Nrf2 +/+組的CPK水平低于Nrf2 -/-組。特別是Nrf2 +/+[SFN]小鼠的CPK水平明顯低于其他干預(yù)組。所有組在基線時(shí)的LDH水平相當(dāng)。然而，在50分鐘跑步機(jī)試驗(yàn)后，Nrf2 +/+組的LDH水平低于Nrf2 -/-組。在基線時(shí)，Nrf2 -/-組的血乳酸水平明顯低于Nrf2 +/+組。在注射SFN 50分鐘后，我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Nrf2+/+小鼠血乳酸水平顯著升高。然而，其他組有顯著的增加(圖6C)。
這些數(shù)據(jù)表明，在力竭運(yùn)動(dòng)條件下，Nrf2 +/+小鼠注射SFN對(duì)肌肉有保護(hù)作用。
討論
隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加，肌肉對(duì)氧的利用率提高，可能會(huì)促進(jìn)線粒體電子傳遞鏈中電子溢出反應(yīng)產(chǎn)生自由基和其他活性氧（5）。活躍肌肉中自由基形成的增強(qiáng)可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號(hào)通路，從而可能導(dǎo)致肌肉收縮受限（16）。這些過(guò)程可能是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能受損、肌膜功能紊亂、微血管調(diào)節(jié)、鈣調(diào)節(jié)、肌絲收縮受損和/或線粒體代謝改變引起的（17）。盡管存在爭(zhēng)議（18,19），越來(lái)越多的證據(jù)表明，通過(guò)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)分子來(lái)增強(qiáng)身體的抗氧化防御系統(tǒng)，并作為活性氧清除劑，可以預(yù)防運(yùn)動(dòng)引起的氧化應(yīng)激，減少肌肉損傷（20-22）?？紤]到對(duì)Nrf2的激活，SFN是一種非常有效的抗氧化劑（11）。
我們的研究表明，SFN預(yù)處理可以通過(guò)抑制骨骼肌中TBARS的產(chǎn)生、GSSG/GSH的比值 (圖6A)，以及抑制血液中CPK、LDH(圖6B)和乳酸(圖6C)的釋放，從而增加跑步機(jī)疲勞試驗(yàn)中的跑步距離(圖5A)。TBARS水平升高表明體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化作用增加。血清CPK和LDH水平常被用來(lái)測(cè)量肌肉細(xì)胞的結(jié)構(gòu)損傷。乳酸鹽的積累會(huì)導(dǎo)致肌肉疲勞。據(jù)我們所知，我們的研究提供了第一個(gè)直接證據(jù)，證明SFN對(duì)Nrf2信號(hào)通路的上調(diào)以及對(duì)下游II相和抗氧化基因（HO-1、NQO1、γ-GCS和過(guò)氧化氫酶）的調(diào)節(jié)，在抵抗力竭運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和骨骼肌組織損傷方面起著至關(guān)重要的作用。SFN誘導(dǎo)的骨骼肌Nrf2激活可能在提高運(yùn)動(dòng)耐力方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。
本研究的另一個(gè)主要目標(biāo)是通過(guò)Nrf2-熒光素全身成像和肌肉熒光素酶活性測(cè)定評(píng)估體內(nèi)Nrf2的激活。迄今為止，利用SDS-PAGE對(duì)肌肉Nrf2進(jìn)行檢測(cè)的嘗試已多次失敗。我們通過(guò)電刺激C2C12細(xì)胞鑒定了Nrf2的體外活性(95-110 kDa帶)（23），但對(duì)小鼠肌肉Nrf2活性的檢測(cè)是比較困難的。一些研究將55-65kDa區(qū)域的非特異性條帶定為Nrf2 （24,25）。2012年，我們首次開(kāi)發(fā)了轉(zhuǎn)基因小鼠(OKD48)，通過(guò)測(cè)量發(fā)光活性的成像技術(shù)研究Keap1-Nrf2通路（14）。為了提高對(duì)Nrf2信號(hào)的檢測(cè)，我們開(kāi)發(fā)了一種新的小鼠模型，將OKD48與Nrf2 +/+ (albino-BL/6)或Nrf2 -/- (albino-Nrf2 -/-)小鼠雜交。利用這個(gè)新模型，我們證明了SFN在全身(圖4A)和肌肉組織(圖4B)中激活Nrf2信號(hào)通路，并對(duì)氧化應(yīng)激具有很強(qiáng)的保護(hù)作用。
TBARS是公認(rèn)的氧化應(yīng)激生物學(xué)指標(biāo)（26）。脂質(zhì)過(guò)氧化程度反映了與氧化應(yīng)激相關(guān)的主要病理和毒理學(xué)狀態(tài)（27）。越來(lái)越多的證據(jù)表明，由于短時(shí)間的高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，血漿和組織中的TBARS濃度都有所增加（28 - 30）。谷胱甘肽是一種抗氧化劑，被用作氧化應(yīng)激的標(biāo)志。在氧化應(yīng)激條件下，GSH濃度較低，GSSG濃度較高，GSSG/GSH比值增加（31）。許多研究表明，GSSG/GSH比值隨運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的增加而增加，且與乳酸/丙酮酸比值高度相關(guān)（31,32）。高水平的氧化劑可導(dǎo)致收縮功能障礙、線粒體功能障礙和肌肉萎縮，所有這些都會(huì)導(dǎo)致肌肉無(wú)力和疲勞（3,16,33）。我們的數(shù)據(jù)表明，跑步機(jī)試驗(yàn)后TBARS和GSSG/GSH比值濃度的降低（12），通過(guò)SFN激活Nrf2上調(diào)下游的抗氧化劑和解毒基因，可以保護(hù)肌肉免受損傷。我們對(duì)SFN預(yù)處理與氧化劑抑制之間關(guān)系的觀察與最近的報(bào)道一致。Malaguti等人報(bào)道（12），在跑步機(jī)疲勞試驗(yàn)后，體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加，但SFN預(yù)處理后顯著降低。Angeloni等人證明SFN顯著增加體外抗氧化活性（34）。
Nrf2除了減輕氧化應(yīng)激外，還可能在脂質(zhì)和葡萄糖代謝中發(fā)揮重要作用（35 - 37）。張和同事們的研究表明，SFN增強(qiáng)Nrf2表達(dá)、激活肝臟激酶B1/AMPK途徑和下游基因，如過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1、磷酸化乙酰輔酶A羧化酶、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1（38）。已知AMPK在肌肉中受到調(diào)節(jié)，并且通過(guò)促進(jìn)脂肪酸攝取和氧化、葡萄糖攝取和線粒體生物發(fā)生起作用（39,40）。此外，Uruno等人證明Nrf2在最大增量跑步機(jī)方案的情況下調(diào)節(jié)骨骼肌糖原代謝，特別是糖原分支酶(GBE1)（41）。這可能是因?yàn)镾FN的增加促進(jìn)了能量代謝，并增加了小鼠的跑步距離。這是一個(gè)需要進(jìn)一步研究的重要課題，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)加深我們對(duì)SFN影響運(yùn)動(dòng)耐力機(jī)制的理解。在這項(xiàng)研究中，VO2和RQ數(shù)據(jù)是通過(guò)評(píng)估能量底物、碳水化合物和脂肪的利用獲得的。Nrf2 +/+組和Nrf2 -/-組VO2水平在41 - 50分鐘內(nèi)發(fā)生了顯著變化(圖5C)。同時(shí)Nrf2 -/-組的LDH和CPK水平升高(圖6B);然而，我們沒(méi)有檢測(cè)到碳水化合物和脂肪氧化以及RQ的顯著變化(圖5D)。我們檢測(cè)了血清中葡萄糖和FFAs的水平，這兩種物質(zhì)是骨骼肌的主要燃料來(lái)源，但我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)四組之間的差異。因此，Nrf2 -/-組觀察到的嚴(yán)重肌肉損傷可能是由于試驗(yàn)期間缺乏Nrf2表達(dá)，而不是由于缺乏能量補(bǔ)充。在Nrf2 +/+小鼠中，SFN介導(dǎo)的強(qiáng)誘導(dǎo)細(xì)胞和線粒體總抗氧化劑的產(chǎn)生，以及II相酶的產(chǎn)生，可能解釋運(yùn)動(dòng)耐力的增強(qiáng)。骨骼肌氧化應(yīng)激水平的變化可能是跑步距離增加的原因。
Sun等報(bào)道，SFN干預(yù)(2mg/kg) 8周，通過(guò)對(duì)肌營(yíng)養(yǎng)不良(mdx)小鼠的氧化應(yīng)激產(chǎn)生保護(hù)作用，改善了肌肉功能，減少了病理（43）。這些結(jié)果表明，注射SFN的Nrf2 +/+小鼠和Nrf2 -/-組中Nrf2的缺失可以影響肌肉成分，這反過(guò)來(lái)可能有助于觀察運(yùn)動(dòng)耐力能力的差異。然而，在我們的研究中，注射SFN超過(guò)4天并沒(méi)有改變肌肉纖維的類(lèi)型和大小(圖2A-C)。Nrf2基因的存在與否并不影響纖維的組成和形態(tài)。因此，我們認(rèn)為在目前的力竭測(cè)試中，SFN誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)能力提高并不受肌肉成分變化的調(diào)節(jié)。
我們展示了線粒體生物發(fā)生的標(biāo)記物(圖3)，以闡明運(yùn)動(dòng)能力增加的原因。我們發(fā)現(xiàn)四次SFN注射后顯著激活A(yù)MPKα (圖3)，與最近的研究一致（32）。然而，我們沒(méi)有檢測(cè)其他線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物的顯著差異，包括四組中mtDNA拷貝數(shù)(圖3A-C)。此外，我們?cè)u(píng)估了cAMP的變化(圖2H)，這被認(rèn)為是線粒體生物發(fā)生的效應(yīng)（44）。然而，我們沒(méi)有測(cè)量各組之間cAMP的顯著差異。Kitaoka等人證明Nrf2基因的存在并不影響線粒體形態(tài)的改變（45）。因此，我們假設(shè)激活線粒體生物發(fā)生信號(hào)與通過(guò)注射SFN提高運(yùn)動(dòng)耐力能力之間的聯(lián)系較弱，而SFN注射僅進(jìn)行了四次。
Nrf2 +/+和Nrf2 -/-小鼠的運(yùn)動(dòng)能力與一些研究報(bào)道的結(jié)果不一致（41,46）。我們認(rèn)識(shí)到這種不一致是由于不同的運(yùn)動(dòng)耐力測(cè)試方案造成的。由于本研究最重要的目的是建立Nrf2 +/+小鼠注射SFN時(shí)運(yùn)動(dòng)能力和Nrf2 -/-組Nrf2缺失的差異，因此我們更重視運(yùn)動(dòng)耐力測(cè)試方案。通過(guò)試驗(yàn)性實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)方案的運(yùn)動(dòng)耐力能力差異很大，其中我們選擇了最佳試驗(yàn)方案來(lái)證明我們的假設(shè)。前面提到的研究通過(guò)在跑步機(jī)上逐漸增加速度和/或傾斜至最大運(yùn)動(dòng)水平來(lái)測(cè)量運(yùn)動(dòng)能力。本研究有可能在運(yùn)動(dòng)耐力測(cè)試中使用厭氧動(dòng)力而非有氧動(dòng)力。若以厭氧動(dòng)力為基礎(chǔ)，則小鼠腿的動(dòng)力無(wú)法跟隨較高的速度負(fù)荷和坡度阻力。因此，遵循測(cè)試方案的研究之間結(jié)果的不一致是可以想象的。然而，我們認(rèn)識(shí)到保持28米/分鐘到力竭是非常適合評(píng)估運(yùn)動(dòng)耐力能力的。
最近，有關(guān)于ROS和肌肉運(yùn)動(dòng)適應(yīng)的重要報(bào)道（18,19）。也就是說(shuō)，抗氧化補(bǔ)充劑可能會(huì)妨礙運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練引起的骨骼肌適應(yīng)。因此，我們應(yīng)該謹(jǐn)慎地得出有關(guān)長(zhǎng)期SFN干預(yù)的結(jié)論。然而，即使抗氧化劑具有益處，但根據(jù)類(lèi)型、持續(xù)時(shí)間、頻率和劑量，它可能具有毒副作用。因此，我們認(rèn)為需要更多科學(xué)證據(jù)證明抗氧化功能。我們不認(rèn)為SFN僅僅是一種抗氧化劑。當(dāng)然，很明顯，通過(guò)SFN干預(yù)Nrf2活化的主要作用是間接表達(dá)具有抗氧化特性的各種轉(zhuǎn)錄因子。然而，難以說(shuō)明蘿卜硫素直接影響其他抗氧化劑以誘導(dǎo)肌肉適應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。因此，需要更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)回答這個(gè)問(wèn)題，以確定SFN的長(zhǎng)期負(fù)面影響。
我們的研究結(jié)果表明，SFN誘導(dǎo)的Nrf2上調(diào)和SFN介導(dǎo)的抗氧化作用可能通過(guò)減少力竭運(yùn)動(dòng)引起的氧化應(yīng)激來(lái)減輕肌肉疲勞。最終可能會(huì)提高運(yùn)動(dòng)耐力。 我們相信這項(xiàng)研究為Nrf2在改善運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)中的作用提供了新的見(jiàn)解。
圖1. 實(shí)驗(yàn)方案。連續(xù)3天，所有小鼠均以5-10米/分的速度低速進(jìn)行10分的適應(yīng)性訓(xùn)練。然后，所有小鼠在3天內(nèi) SFN或溶媒注射4次(72、48、24和3小時(shí)后再進(jìn)行跑步機(jī)測(cè)試)。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，所有小鼠均進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)方案。運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度逐漸增加，初始速度為5米/分，然后每3分鐘逐漸加速，至最大速度28米/分。保持最大速度，直到小鼠精疲力盡。紅色箭頭表示SFN或溶媒注射后體內(nèi)成像的時(shí)間進(jìn)程。結(jié)果如圖3A[(a)~(b)]所示。
圖2. SFN或溶媒注射后在pH 10.8下通過(guò)ATP酶染色獲得的腓腸肌纖維類(lèi)型（A）。用ATP酶染色測(cè)定腓腸肌中的纖維面積（B）和纖維類(lèi)型分布（C）。使用間接量熱計(jì)在每個(gè)黑暗和光照循環(huán)期間評(píng)估每日EE（D）和RQ（E）值。測(cè)量腓腸肌ATP（F）、糖原（G）和cAMP（H）水平。
圖3. SFN注射效果。SFN或溶媒注射4次，持續(xù)3天，并檢測(cè)小鼠腓腸肌線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物。（A）線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物的蛋白質(zhì)表達(dá)水平（蛋白質(zhì)印跡條帶）。 將一定量的磷酸化AMPKα標(biāo)準(zhǔn)化為AMPKα蛋白的量。還檢測(cè)量了線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物SirT1和PGC1α的蛋白質(zhì)含量。載荷體積分別通過(guò)肌動(dòng)蛋白和核纖層蛋白A / C的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化。（B）AA線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物的mRNA表達(dá)。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR測(cè)定NRF1、TFAM、p53R2、COX IV、SCO1和SCO2的mRNA水平。將值標(biāo)準(zhǔn)化為管家基因GAPDH的水平。（C）腓腸肌mtDNA拷貝數(shù)。這個(gè)數(shù)字影響細(xì)胞核和mtDNA比值（mtDNA / nDNA）; 括號(hào)** P <0.01。
圖4. 采用體內(nèi)成像系統(tǒng)檢測(cè)SFN誘導(dǎo)的Nrf2- luc活性，并對(duì)處于俯臥位的Nrf2和OKD48轉(zhuǎn)基因小鼠(A)進(jìn)行基因分型。熒光素酶測(cè)定的時(shí)間過(guò)程[（a：基線）?（b：SFN注射后）]如圖1所示。使用分光計(jì)（B）測(cè)量第四次SFN注射后腓腸肌Nrf2-Luc活性。四次SFN注射或溶媒注射后，腓腸?。–）和比目魚(yú)肌（D）Nrf2靶基因的mRNA水平。括號(hào)* P <0.01。
圖5. 在力竭跑步試驗(yàn)(A)中，各組小鼠每次跑步的距離以及每次跑步期間的VO2(圓圈)和RQ(三角形)記錄了跑步距離中值(B)。各組平均能量底物水平:VO2 (C)、RQ (D)、葡萄糖(E)、FFA (F) ，經(jīng)過(guò)50分鐘的跑步機(jī)疲勞試驗(yàn)后，各組在同一時(shí)間進(jìn)行比較。括號(hào)* P < 0.01。
圖6. 腓腸肌氧化、TBARS和GSSG/GSH (A)標(biāo)記物，以及肌肉損傷、CPK和LDH (B)標(biāo)記物、肌肉疲勞、血液乳酸(C)標(biāo)記物。
翻譯：
核因子NF-E2相關(guān)因子（Nrf2）激活后通過(guò)調(diào)節(jié)骨骼肌氧化還原增加運(yùn)動(dòng)耐力
摘要：蘿卜硫素(SFN)通過(guò)激活核因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf2)信號(hào)通路，在預(yù)防氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。SFN可通過(guò)對(duì)抗運(yùn)動(dòng)過(guò)程中氧化應(yīng)激引起的損傷提高運(yùn)動(dòng)耐力。我們通過(guò)力竭跑步測(cè)試（連續(xù)漸進(jìn)式力竭測(cè)試）評(píng)估跑步能力，并檢測(cè)氧化應(yīng)激和肌肉損傷標(biāo)志物的表達(dá)。在測(cè)試之前，給予12至13周齡雄性野生型（Nrf2 +/+）和Nrf2缺失（Nrf2 -/-）C57BL / 6J小鼠SFN腹膜注射或溶媒注射。注射SFN的Nrf2+/+小鼠奔跑距離明顯大于未注射SFN的小鼠。隨著Nrf2信號(hào)和下游基因的上調(diào)，運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)后，注射SFN的Nrf2+/+小鼠氧化應(yīng)激標(biāo)志物明顯低于未注射SFN的小鼠。在力竭運(yùn)動(dòng)條件下，SFN對(duì)Nrf2+/+小鼠肌肉損傷的保護(hù)作用強(qiáng)于Nrf2 -/-小鼠。SFN誘導(dǎo)的Nrf2上調(diào)及其抗氧化作用可能通過(guò)減少過(guò)度運(yùn)動(dòng)引起的氧化應(yīng)激在減輕肌肉疲勞方面發(fā)揮重要作用。這進(jìn)而提高了運(yùn)動(dòng)耐力。這些結(jié)果為SFN誘導(dǎo)的Nrf2上調(diào)及其在改善運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)中的作用提供了新的見(jiàn)解。
肌肉收縮過(guò)程中活性氧(ROS)的產(chǎn)生增加（1，2）。雖然生物系統(tǒng)能夠?qū)钚匝跫捌浞磻?yīng)中間體進(jìn)行解毒，但在肌肉重復(fù)或長(zhǎng)時(shí)間收縮期間，活性氧水平的持續(xù)升高可能會(huì)導(dǎo)致正常氧化還原狀態(tài)的失衡，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激（3）。力竭運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練尤其能促進(jìn)ROS的產(chǎn)生（4）。長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致骨骼肌結(jié)構(gòu)損傷和收縮功能障礙（3，5）。以這種方式，骨骼肌氧化還原紊亂導(dǎo)致進(jìn)行性肌肉無(wú)力和疲勞（即力量減小和收縮速度減慢）。這些現(xiàn)象表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)耐力下降（2，3，5-7）。
最近的研究強(qiáng)調(diào)了核因子NF-E2相關(guān)因子 (Nrf2)在抗氧化反應(yīng)元件(ARE)驅(qū)動(dòng)的內(nèi)源性抗氧化/外源性解毒酶表達(dá)中的作用，以及Nrf2在減輕氧化損傷中的作用。調(diào)節(jié)NRF2相關(guān)的抗氧化信號(hào)可以保護(hù)組織和器官的氧化還原和功能穩(wěn)態(tài)（9）。
蘿卜硫素(SFN)是十字花科植物產(chǎn)生的一種化學(xué)預(yù)防化合物，是Nrf2的有效激活劑（10）。許多研究表明，SFN誘導(dǎo)的Nrf2激活可能對(duì)氧化應(yīng)激損傷的各種器官發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用（11）。Malaguti等報(bào)道SFN通過(guò)Nrf2-ARE通路調(diào)節(jié)肌肉氧化還原環(huán)境，減輕骨骼肌損傷（12）。SFN的抗氧化活性可能通過(guò)減少運(yùn)動(dòng)引起的氧化應(yīng)激性肌肉疲勞，從而提高運(yùn)動(dòng)耐力（2，3，5-7）。
本研究利用SFN激活小鼠的Nrf2-ARE通路。我們?cè)u(píng)估了Nrf2激活對(duì)運(yùn)動(dòng)耐力的影響，方法是通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行力竭性(漸進(jìn)性-持續(xù)性)跑步試驗(yàn)來(lái)估計(jì)它們的跑步距離。然后檢測(cè)小鼠肌肉中氧化應(yīng)激和組織損傷標(biāo)志物的表達(dá)。
結(jié)果
基線評(píng)估。右下肢深部腓腸肌中央部分肌肉纖維的ATP酶染色橫截面分別來(lái)自SFN注射或溶媒注射的Nrf2 +/+和Nrf2 -/-小鼠（圖2A）。在Nrf2 +/+和Nrf2 -/- 小鼠中，I型和II型纖維的直徑?jīng)]有顯著差異。四次SFN注射后纖維直徑?jīng)]有變化（圖2B）。 Nrf2 +/+和Nrf2 -/-小鼠之間I型與II型肌肉比率的比值沒(méi)有顯著差異。在四次SFN注射后，這些比率沒(méi)有顯著改變（圖2C）。各組各暗、光周期的能量消耗(圖2D)和呼吸商（RQ）(圖2E)無(wú)顯著差異。各組ATP(圖2F)、糖原(圖2G)、cAMP(圖2H)平均水平無(wú)顯著差異。這些數(shù)據(jù)表明Nrf2基因型和SFN注射在基線時(shí)對(duì)肌肉纖維形態(tài)、生理或代謝無(wú)明顯影響。
線粒體生物發(fā)生。圖3顯示了基線時(shí)腓腸肌勻漿中線粒體生物發(fā)生生物標(biāo)志物。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，在四次SFN注射后，磷酸化AMPKα在Nrf2 +/+ [SFN]小鼠中顯著增加（圖3A）。然而，所有組中SirT1和PGC1α的蛋白質(zhì)表達(dá)沒(méi)有顯著差異。圖3B顯示線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物的mRNA表達(dá)，包括NRF-1、TFAM、p53R2、COX IV、SCO1和SCO2。在任何組中均未檢測(cè)到mRNA表達(dá)升高。相對(duì)于nDNA, mtDNA拷貝數(shù)升高。這被認(rèn)為是線粒體生物發(fā)生的良好標(biāo)志物（15）。在Nrf2+/+小鼠和Nrf2 -/-組第四次注射SFN后，mtDNA拷貝數(shù)無(wú)顯著差異(圖3C)。這些數(shù)據(jù)表明，激活線粒體生物發(fā)生信號(hào)與SFN注射之間的聯(lián)系很弱，而SFN注射僅進(jìn)行了四次。
發(fā)光活性。圖4A顯示在轉(zhuǎn)基因OKD48（Keap1依賴(lài)性氧化應(yīng)激檢測(cè)器，No-48-熒光素酶）小鼠中SFN注射期間Nrf2應(yīng)答的實(shí)時(shí)體內(nèi)成像。OKD48小鼠表達(dá)Nrf2-Luc融合蛋白N-末端一半，由基于Nrf2的3xAre啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)（13）。在Nrf2 +/+ [CON]和Nrf2 -/- [CON]小鼠中未檢測(cè)到Nrf2-Luc活化。在力竭平板試驗(yàn)前不久，在第四次SFN注射（75小時(shí)）后3小時(shí)，在Nrf2 +/+ [SFN]小鼠中觀察到顯著的Nrf2上調(diào)[圖4A（a）和（b）]。在SFN注射期間，在Nrf2 +/+ [SFN]小鼠中Nrf2-Luc活化在基線、24、48、72和75小時(shí)逐漸增加[圖S1（a），（b），（c），（d）和（e）]。Nrf2-Luc在Nrf2 +/+ [CON]和Nrf2 -/- [CON]組中未被激活。腓腸肌的熒光素酶活性如圖4B所示。Nrf2-Luc在75小時(shí)Nrf2 +/+ [SFN]小鼠的肌肉中上調(diào)。這一變化明顯高于其他組（P <0.01）。這些結(jié)果表明SFN預(yù)處理上調(diào)Nrf2。
Nrf2靶基因。圖4C，D顯示所選Nrf2靶基因的mRNA水平：血紅素加氧酶-1（HO-1）、NAD（P）H：醌氧化還原酶A（NQO1）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）和過(guò)氧化氫酶。在有和沒(méi)有SFN預(yù)處理的腓腸?。▓D4C）和比目魚(yú)?。▓D4D）組織勻漿中檢測(cè)這些基因mRNA水平。與Nrf2 -/- 組（Nrf2 -/- [SFN]和Nrf2 -/- [CON]）相比，Nrf2 +/+ [SFN]小鼠在腓腸肌和比目魚(yú)肌中所有靶基因的表達(dá)水平顯著增高。在兩個(gè)Nrf2 +/+組之間，腓腸肌過(guò)氧化氫酶沒(méi)有上調(diào)。與Nrf2+/+[CON]小鼠相比，Nrf2+/+[SFN]小鼠比目魚(yú)中HO-1沒(méi)有上調(diào)。然而，Nrf2 +/+ [SFN]小鼠組織中其他Nrf2靶基因的表達(dá)水平顯著高于Nrf2 +/+ [CON]：Nrf2 +/+[CON]小鼠腓腸肌和比目魚(yú)肌的NQO1和γ-GCS表達(dá)水平顯著高于Nrf2 -/-小鼠。
運(yùn)動(dòng)耐力和能量代謝參數(shù)。圖5A為跑步距離測(cè)試結(jié)果，該測(cè)試作為運(yùn)動(dòng)耐力的評(píng)價(jià)指標(biāo)。Nrf2+/+小鼠比Nrf2 -/-小鼠跑得更遠(yuǎn)。在Nrf2+/+組中，Nrf2 +/+[SFN]小鼠的跑步距離大于Nrf2 +/+[CON]小鼠。圖5B為每組跑步期間耗氧量(VO2)和RQ，以及記錄的跑步距離中值。圖5C和D顯示了在50分鐘的跑步機(jī)測(cè)試中，各組的平均VO2和RQ水平。運(yùn)動(dòng)40分鐘后各組VO2水平無(wú)顯著差異。在41 - 50min期間，Nrf2 -/-組VO2水平高于Nrf2 +/+組。但四組間的平均RQ在時(shí)間周期上無(wú)顯著差異。在基線和50min后，四組的血清葡萄糖和游離脂肪酸(FFAs)水平無(wú)顯著差異(圖5E和F)。
氧化應(yīng)激和肌肉損傷的生物標(biāo)志物。圖6A顯示在測(cè)試結(jié)束后50分鐘和18小時(shí)的徹底測(cè)試后，基線時(shí)腓腸肌勻漿中硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)（TBARS）的水平。在基線和50分鐘期間，所有組顯示出相當(dāng)?shù)腡BARS水平。然而，在試驗(yàn)后18小時(shí)，Nrf2 +/+小鼠的TBARS水平明顯低于Nrf2 -/-小鼠。SFN注射N(xiāo)rf2 +/+小鼠的TBARS水平低于未注射N(xiāo)rf2 +/+小鼠。對(duì)于基線的GSSG/GSH比值，所有組也顯示出可比性。然而，在試驗(yàn)結(jié)束后50分鐘，Nrf2 +/+小鼠注射SFN后，GSSG/GSH比值低于Nrf2 -/-組(圖6A)。圖6B顯示了在基線和跑步機(jī)測(cè)試50分鐘后各組肌肉損傷標(biāo)志物肌酸磷酸激酶(CPK)和乳酸脫氫酶(LDH)的血清水平。在基線時(shí)，Nrf2 +/+組的CPK水平明顯高于Nrf2 -/-組。在跑步機(jī)疲勞試驗(yàn)50分鐘時(shí)，Nrf2 +/+組的CPK水平低于Nrf2 -/-組。特別是Nrf2 +/+[SFN]小鼠的CPK水平明顯低于其他干預(yù)組。所有組在基線時(shí)的LDH水平相當(dāng)。然而，在50分鐘跑步機(jī)試驗(yàn)后，Nrf2 +/+組的LDH水平低于Nrf2 -/-組。在基線時(shí)，Nrf2 -/-組的血乳酸水平明顯低于Nrf2 +/+組。在注射SFN 50分鐘后，我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Nrf2+/+小鼠血乳酸水平顯著升高。然而，其他組有顯著的增加(圖6C)。
這些數(shù)據(jù)表明，在力竭運(yùn)動(dòng)條件下，Nrf2 +/+小鼠注射SFN對(duì)肌肉有保護(hù)作用。
討論
隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加，肌肉對(duì)氧的利用率提高，可能會(huì)促進(jìn)線粒體電子傳遞鏈中電子溢出反應(yīng)產(chǎn)生自由基和其他活性氧（5）。活躍肌肉中自由基形成的增強(qiáng)可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號(hào)通路，從而可能導(dǎo)致肌肉收縮受限（16）。這些過(guò)程可能是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能受損、肌膜功能紊亂、微血管調(diào)節(jié)、鈣調(diào)節(jié)、肌絲收縮受損和/或線粒體代謝改變引起的（17）。盡管存在爭(zhēng)議（18,19），越來(lái)越多的證據(jù)表明，通過(guò)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)分子來(lái)增強(qiáng)身體的抗氧化防御系統(tǒng)，并作為活性氧清除劑，可以預(yù)防運(yùn)動(dòng)引起的氧化應(yīng)激，減少肌肉損傷（20-22）?？紤]到對(duì)Nrf2的激活，SFN是一種非常有效的抗氧化劑（11）。
我們的研究表明，SFN預(yù)處理可以通過(guò)抑制骨骼肌中TBARS的產(chǎn)生、GSSG/GSH的比值 (圖6A)，以及抑制血液中CPK、LDH(圖6B)和乳酸(圖6C)的釋放，從而增加跑步機(jī)疲勞試驗(yàn)中的跑步距離(圖5A)。TBARS水平升高表明體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化作用增加。血清CPK和LDH水平常被用來(lái)測(cè)量肌肉細(xì)胞的結(jié)構(gòu)損傷。乳酸鹽的積累會(huì)導(dǎo)致肌肉疲勞。據(jù)我們所知，我們的研究提供了第一個(gè)直接證據(jù)，證明SFN對(duì)Nrf2信號(hào)通路的上調(diào)以及對(duì)下游II相和抗氧化基因（HO-1、NQO1、γ-GCS和過(guò)氧化氫酶）的調(diào)節(jié)，在抵抗力竭運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和骨骼肌組織損傷方面起著至關(guān)重要的作用。SFN誘導(dǎo)的骨骼肌Nrf2激活可能在提高運(yùn)動(dòng)耐力方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。
本研究的另一個(gè)主要目標(biāo)是通過(guò)Nrf2-熒光素全身成像和肌肉熒光素酶活性測(cè)定評(píng)估體內(nèi)Nrf2的激活。迄今為止，利用SDS-PAGE對(duì)肌肉Nrf2進(jìn)行檢測(cè)的嘗試已多次失敗。我們通過(guò)電刺激C2C12細(xì)胞鑒定了Nrf2的體外活性(95-110 kDa帶)（23），但對(duì)小鼠肌肉Nrf2活性的檢測(cè)是比較困難的。一些研究將55-65kDa區(qū)域的非特異性條帶定為Nrf2 （24,25）。2012年，我們首次開(kāi)發(fā)了轉(zhuǎn)基因小鼠(OKD48)，通過(guò)測(cè)量發(fā)光活性的成像技術(shù)研究Keap1-Nrf2通路（14）。為了提高對(duì)Nrf2信號(hào)的檢測(cè)，我們開(kāi)發(fā)了一種新的小鼠模型，將OKD48與Nrf2 +/+ (albino-BL/6)或Nrf2 -/- (albino-Nrf2 -/-)小鼠雜交。利用這個(gè)新模型，我們證明了SFN在全身(圖4A)和肌肉組織(圖4B)中激活Nrf2信號(hào)通路，并對(duì)氧化應(yīng)激具有很強(qiáng)的保護(hù)作用。
TBARS是公認(rèn)的氧化應(yīng)激生物學(xué)指標(biāo)（26）。脂質(zhì)過(guò)氧化程度反映了與氧化應(yīng)激相關(guān)的主要病理和毒理學(xué)狀態(tài)（27）。越來(lái)越多的證據(jù)表明，由于短時(shí)間的高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，血漿和組織中的TBARS濃度都有所增加（28 - 30）。谷胱甘肽是一種抗氧化劑，被用作氧化應(yīng)激的標(biāo)志。在氧化應(yīng)激條件下，GSH濃度較低，GSSG濃度較高，GSSG/GSH比值增加（31）。許多研究表明，GSSG/GSH比值隨運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的增加而增加，且與乳酸/丙酮酸比值高度相關(guān)（31,32）。高水平的氧化劑可導(dǎo)致收縮功能障礙、線粒體功能障礙和肌肉萎縮，所有這些都會(huì)導(dǎo)致肌肉無(wú)力和疲勞（3,16,33）。我們的數(shù)據(jù)表明，跑步機(jī)試驗(yàn)后TBARS和GSSG/GSH比值濃度的降低（12），通過(guò)SFN激活Nrf2上調(diào)下游的抗氧化劑和解毒基因，可以保護(hù)肌肉免受損傷。我們對(duì)SFN預(yù)處理與氧化劑抑制之間關(guān)系的觀察與最近的報(bào)道一致。Malaguti等人報(bào)道（12），在跑步機(jī)疲勞試驗(yàn)后，體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加，但SFN預(yù)處理后顯著降低。Angeloni等人證明SFN顯著增加體外抗氧化活性（34）。
Nrf2除了減輕氧化應(yīng)激外，還可能在脂質(zhì)和葡萄糖代謝中發(fā)揮重要作用（35 - 37）。張和同事們的研究表明，SFN增強(qiáng)Nrf2表達(dá)、激活肝臟激酶B1/AMPK途徑和下游基因，如過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1、磷酸化乙酰輔酶A羧化酶、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1（38）。已知AMPK在肌肉中受到調(diào)節(jié)，并且通過(guò)促進(jìn)脂肪酸攝取和氧化、葡萄糖攝取和線粒體生物發(fā)生起作用（39,40）。此外，Uruno等人證明Nrf2在最大增量跑步機(jī)方案的情況下調(diào)節(jié)骨骼肌糖原代謝，特別是糖原分支酶(GBE1)（41）。這可能是因?yàn)镾FN的增加促進(jìn)了能量代謝，并增加了小鼠的跑步距離。這是一個(gè)需要進(jìn)一步研究的重要課題，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)加深我們對(duì)SFN影響運(yùn)動(dòng)耐力機(jī)制的理解。在這項(xiàng)研究中，VO2和RQ數(shù)據(jù)是通過(guò)評(píng)估能量底物、碳水化合物和脂肪的利用獲得的。Nrf2 +/+組和Nrf2 -/-組VO2水平在41 - 50分鐘內(nèi)發(fā)生了顯著變化(圖5C)。同時(shí)Nrf2 -/-組的LDH和CPK水平升高(圖6B);然而，我們沒(méi)有檢測(cè)到碳水化合物和脂肪氧化以及RQ的顯著變化(圖5D)。我們檢測(cè)了血清中葡萄糖和FFAs的水平，這兩種物質(zhì)是骨骼肌的主要燃料來(lái)源，但我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)四組之間的差異。因此，Nrf2 -/-組觀察到的嚴(yán)重肌肉損傷可能是由于試驗(yàn)期間缺乏Nrf2表達(dá)，而不是由于缺乏能量補(bǔ)充。在Nrf2 +/+小鼠中，SFN介導(dǎo)的強(qiáng)誘導(dǎo)細(xì)胞和線粒體總抗氧化劑的產(chǎn)生，以及II相酶的產(chǎn)生，可能解釋運(yùn)動(dòng)耐力的增強(qiáng)。骨骼肌氧化應(yīng)激水平的變化可能是跑步距離增加的原因。
Sun等報(bào)道，SFN干預(yù)(2mg/kg) 8周，通過(guò)對(duì)肌營(yíng)養(yǎng)不良(mdx)小鼠的氧化應(yīng)激產(chǎn)生保護(hù)作用，改善了肌肉功能，減少了病理（43）。這些結(jié)果表明，注射SFN的Nrf2 +/+小鼠和Nrf2 -/-組中Nrf2的缺失可以影響肌肉成分，這反過(guò)來(lái)可能有助于觀察運(yùn)動(dòng)耐力能力的差異。然而，在我們的研究中，注射SFN超過(guò)4天并沒(méi)有改變肌肉纖維的類(lèi)型和大小(圖2A-C)。Nrf2基因的存在與否并不影響纖維的組成和形態(tài)。因此，我們認(rèn)為在目前的力竭測(cè)試中，SFN誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)能力提高并不受肌肉成分變化的調(diào)節(jié)。
我們展示了線粒體生物發(fā)生的標(biāo)記物(圖3)，以闡明運(yùn)動(dòng)能力增加的原因。我們發(fā)現(xiàn)四次SFN注射后顯著激活A(yù)MPKα (圖3)，與最近的研究一致（32）。然而，我們沒(méi)有檢測(cè)其他線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物的顯著差異，包括四組中mtDNA拷貝數(shù)(圖3A-C)。此外，我們?cè)u(píng)估了cAMP的變化(圖2H)，這被認(rèn)為是線粒體生物發(fā)生的效應(yīng)（44）。然而，我們沒(méi)有測(cè)量各組之間cAMP的顯著差異。Kitaoka等人證明Nrf2基因的存在并不影響線粒體形態(tài)的改變（45）。因此，我們假設(shè)激活線粒體生物發(fā)生信號(hào)與通過(guò)注射SFN提高運(yùn)動(dòng)耐力能力之間的聯(lián)系較弱，而SFN注射僅進(jìn)行了四次。
Nrf2 +/+和Nrf2 -/-小鼠的運(yùn)動(dòng)能力與一些研究報(bào)道的結(jié)果不一致（41,46）。我們認(rèn)識(shí)到這種不一致是由于不同的運(yùn)動(dòng)耐力測(cè)試方案造成的。由于本研究最重要的目的是建立Nrf2 +/+小鼠注射SFN時(shí)運(yùn)動(dòng)能力和Nrf2 -/-組Nrf2缺失的差異，因此我們更重視運(yùn)動(dòng)耐力測(cè)試方案。通過(guò)試驗(yàn)性實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)方案的運(yùn)動(dòng)耐力能力差異很大，其中我們選擇了最佳試驗(yàn)方案來(lái)證明我們的假設(shè)。前面提到的研究通過(guò)在跑步機(jī)上逐漸增加速度和/或傾斜至最大運(yùn)動(dòng)水平來(lái)測(cè)量運(yùn)動(dòng)能力。本研究有可能在運(yùn)動(dòng)耐力測(cè)試中使用厭氧動(dòng)力而非有氧動(dòng)力。若以厭氧動(dòng)力為基礎(chǔ)，則小鼠腿的動(dòng)力無(wú)法跟隨較高的速度負(fù)荷和坡度阻力。因此，遵循測(cè)試方案的研究之間結(jié)果的不一致是可以想象的。然而，我們認(rèn)識(shí)到保持28米/分鐘到力竭是非常適合評(píng)估運(yùn)動(dòng)耐力能力的。
最近，有關(guān)于ROS和肌肉運(yùn)動(dòng)適應(yīng)的重要報(bào)道（18,19）。也就是說(shuō)，抗氧化補(bǔ)充劑可能會(huì)妨礙運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練引起的骨骼肌適應(yīng)。因此，我們應(yīng)該謹(jǐn)慎地得出有關(guān)長(zhǎng)期SFN干預(yù)的結(jié)論。然而，即使抗氧化劑具有益處，但根據(jù)類(lèi)型、持續(xù)時(shí)間、頻率和劑量，它可能具有毒副作用。因此，我們認(rèn)為需要更多科學(xué)證據(jù)證明抗氧化功能。我們不認(rèn)為SFN僅僅是一種抗氧化劑。當(dāng)然，很明顯，通過(guò)SFN干預(yù)Nrf2活化的主要作用是間接表達(dá)具有抗氧化特性的各種轉(zhuǎn)錄因子。然而，難以說(shuō)明蘿卜硫素直接影響其他抗氧化劑以誘導(dǎo)肌肉適應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。因此，需要更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)回答這個(gè)問(wèn)題，以確定SFN的長(zhǎng)期負(fù)面影響。
我們的研究結(jié)果表明，SFN誘導(dǎo)的Nrf2上調(diào)和SFN介導(dǎo)的抗氧化作用可能通過(guò)減少力竭運(yùn)動(dòng)引起的氧化應(yīng)激來(lái)減輕肌肉疲勞。最終可能會(huì)提高運(yùn)動(dòng)耐力。 我們相信這項(xiàng)研究為Nrf2在改善運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)中的作用提供了新的見(jiàn)解。
圖1. 實(shí)驗(yàn)方案。連續(xù)3天，所有小鼠均以5-10米/分的速度低速進(jìn)行10分的適應(yīng)性訓(xùn)練。然后，所有小鼠在3天內(nèi) SFN或溶媒注射4次(72、48、24和3小時(shí)后再進(jìn)行跑步機(jī)測(cè)試)。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，所有小鼠均進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)方案。運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度逐漸增加，初始速度為5米/分，然后每3分鐘逐漸加速，至最大速度28米/分。保持最大速度，直到小鼠精疲力盡。紅色箭頭表示SFN或溶媒注射后體內(nèi)成像的時(shí)間進(jìn)程。結(jié)果如圖3A[(a)~(b)]所示。
圖2. SFN或溶媒注射后在pH 10.8下通過(guò)ATP酶染色獲得的腓腸肌纖維類(lèi)型（A）。用ATP酶染色測(cè)定腓腸肌中的纖維面積（B）和纖維類(lèi)型分布（C）。使用間接量熱計(jì)在每個(gè)黑暗和光照循環(huán)期間評(píng)估每日EE（D）和RQ（E）值。測(cè)量腓腸肌ATP（F）、糖原（G）和cAMP（H）水平。
圖3. SFN注射效果。SFN或溶媒注射4次，持續(xù)3天，并檢測(cè)小鼠腓腸肌線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物。（A）線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物的蛋白質(zhì)表達(dá)水平（蛋白質(zhì)印跡條帶）。 將一定量的磷酸化AMPKα標(biāo)準(zhǔn)化為AMPKα蛋白的量。還檢測(cè)量了線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物SirT1和PGC1α的蛋白質(zhì)含量。載荷體積分別通過(guò)肌動(dòng)蛋白和核纖層蛋白A / C的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化。（B）AA線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物的mRNA表達(dá)。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR測(cè)定NRF1、TFAM、p53R2、COX IV、SCO1和SCO2的mRNA水平。將值標(biāo)準(zhǔn)化為管家基因GAPDH的水平。（C）腓腸肌mtDNA拷貝數(shù)。這個(gè)數(shù)字影響細(xì)胞核和mtDNA比值（mtDNA / nDNA）; 括號(hào)** P <0.01。
圖4. 采用體內(nèi)成像系統(tǒng)檢測(cè)SFN誘導(dǎo)的Nrf2- luc活性，并對(duì)處于俯臥位的Nrf2和OKD48轉(zhuǎn)基因小鼠(A)進(jìn)行基因分型。熒光素酶測(cè)定的時(shí)間過(guò)程[（a：基線）?（b：SFN注射后）]如圖1所示。使用分光計(jì)（B）測(cè)量第四次SFN注射后腓腸肌Nrf2-Luc活性。四次SFN注射或溶媒注射后，腓腸?。–）和比目魚(yú)肌（D）Nrf2靶基因的mRNA水平。括號(hào)* P <0.01。
圖5. 在力竭跑步試驗(yàn)(A)中，各組小鼠每次跑步的距離以及每次跑步期間的VO2(圓圈)和RQ(三角形)記錄了跑步距離中值(B)。各組平均能量底物水平:VO2 (C)、RQ (D)、葡萄糖(E)、FFA (F) ，經(jīng)過(guò)50分鐘的跑步機(jī)疲勞試驗(yàn)后，各組在同一時(shí)間進(jìn)行比較。括號(hào)* P < 0.01。
圖6. 腓腸肌氧化、TBARS和GSSG/GSH (A)標(biāo)記物，以及肌肉損傷、CPK和LDH (B)標(biāo)記物、肌肉疲勞、血液乳酸(C)標(biāo)記物。
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