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Nrf2介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的小鼠中線粒體生物發(fā)生和抗氧化反應(yīng)
發(fā)表于：2020-06-01 作者：admin 來源：本站 點(diǎn)擊量：12432
Nuclear factor erythroid-derived 2-like 2 (NFE2L2, Nrf2) mediates exercise-induced mitochondrial biogenesis and the anti-oxidant response in mice
Nrf2介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的小鼠中線粒體生物發(fā)生和抗氧化反應(yīng)
Merry T L , Ristow M . Journal of Physiology, 2016, 594(18):5195.
Nrf2介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的小鼠中線粒體生物發(fā)生和抗氧化反應(yīng)
Merry T L , Ristow M . Journal of Physiology, 2016, 594(18):5195.
關(guān)鍵點(diǎn)
·活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（NFE2L2，Nrf2）在骨骼肌中的表達(dá)。
·NFE2L2（Nrf2）是急性運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌線粒體生物發(fā)生基因增加所必需的，這些基因有：如核呼吸因子1（NRF-1）和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A，以及抗氧化基因，如超氧化物歧化酶（SOD）1，SOD2和過氧化氫酶。
·NFE2L2(Nrf2)表達(dá)受損的小鼠運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)、能量消耗、線粒體體積和抗氧化活性都會(huì)降低。
·在肌肉細(xì)胞中，ROS和NO可通過NFE2L2(Nrf2) / NRF-1依賴性途徑調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生。
摘要
有規(guī)律的運(yùn)動(dòng)可以誘導(dǎo)骨骼肌的適應(yīng)性，包括線粒體的生物發(fā)生和增強(qiáng)抗氧化儲(chǔ)備。這些適應(yīng)和其他因素至少在一定程度上是身體活動(dòng)個(gè)體健康狀況改善的原因?；顒?dòng)期間產(chǎn)生活性氧（ROS）和一氧化氮（NO），可能介導(dǎo)對(duì)骨骼肌運(yùn)動(dòng)的適應(yīng)性反應(yīng)。然而，它們的作用機(jī)制尚不清楚。在本研究中，我們旨在確定氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子核因子紅細(xì)胞衍生2樣2（NFE2L2/ Nrf2）在急性運(yùn)動(dòng)和訓(xùn)練誘導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生和抗氧化反應(yīng)中的作用。我們報(bào)道ROS和NO調(diào)節(jié)小鼠骨骼肌和肌肉細(xì)胞中急性運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的NFE2L2(Nrf2)表達(dá)，并且NFE2L2的缺乏阻止了正常急性跑步機(jī)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物mRNA的增加，如核呼吸因子1（NRF-1）和小鼠腓腸肌中的線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mtTFA）和抗氧化劑超氧化物歧化酶（SOD）1和2，以及過氧化氫酶。此外，經(jīng)過5周的跑步機(jī)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，與野生型同窩仔相比，缺乏NFE2L2的小鼠運(yùn)動(dòng)能力和全身能量消耗以及骨骼肌線粒體質(zhì)量和SOD活性均降低。在C2C12成肌細(xì)胞中，外源性H2O2（ROS）和二乙烯三胺/ NO加合物（NO供體）的急性處理誘導(dǎo)了mtTFA的增加，這通過小干擾RNA和NFE2L2或NRF-1的短發(fā)夾RNA敲低來阻止。我們的研究結(jié)果表明，在運(yùn)動(dòng)過程中，ROS和NO可通過NFE2L2發(fā)揮作用，在功能上調(diào)節(jié)骨骼肌線粒體生物合成和抗氧化防御基因的表達(dá)。
縮寫： AICAR，5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸; AMPK，5腺苷單磷酸激活的蛋白激酶; COX4，細(xì)胞色素c氧化酶亞基4; Deta / NO，二亞乙基三胺/一氧化氮加合物; GSH，還原型谷胱甘肽; GSR，谷胱甘肽還原酶; GSSG，氧化型谷胱甘肽; GST，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶; H2O2，過氧化氫; KO，敲除; L-NAME，NG-硝基-L-精氨酸; MAPK，絲裂原活化蛋白激酶; mtTFA，線粒體轉(zhuǎn)錄因子A; NAC，N-乙酰半胱氨酸; NFE2L2/Nrf2，核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2; NF-κB，活化B細(xì)胞核因子κ-輕鏈增強(qiáng)子; NO，一氧化氮; NRF，核呼吸因子; PGC1α，過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α; ROS，活性氧; shRNA，短發(fā)夾RNA; siRNA，小干擾RNA; SOD，超氧化物歧化酶; WT，野生型。
1. 引言
有規(guī)律的定期運(yùn)動(dòng)可以降低疾病發(fā)生率并延長(zhǎng)預(yù)期壽命（Warburton等，2006）。骨骼肌對(duì)急性運(yùn)動(dòng)應(yīng)激特別敏感，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練引起適應(yīng)性變化，如抗氧化能力、線粒體體積和胰島素信號(hào)中間體的增加，這改善肌肉功能，防止發(fā)育代謝紊亂（Egan＆Zierath，2013）。運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)骨骼肌適應(yīng)性變化的機(jī)制之一是通過急劇升高氧化應(yīng)激和亞硝化應(yīng)激來實(shí)現(xiàn)（Gomez-Cabrera等，2015）。
在運(yùn)動(dòng)或收縮過程中，骨骼肌產(chǎn)生活性氧(ROS)和一氧化氮(NO) (Powers & Jackson, 2008)。NO和ROS均可促進(jìn)線粒體生物合成（Suzuki等，1998; Nisoli等，2003; Piantadosi＆Suliman，2006）。在一些研究中，已經(jīng)顯示通過補(bǔ)充抗氧化劑來預(yù)防運(yùn)動(dòng)期間ROS的增加來減弱急性運(yùn)動(dòng)和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物和抗氧化劑反應(yīng)的增加（Gomez-Cabrera等人2005; Gomez-Cabrera等人2008; Ristow等人2009; Strobel等人2011; Wadley等人2013; Paulsen等人，2014a），但在其他研究中沒有這樣的發(fā)現(xiàn)（Yfanti等人2010; Higashida等人2011; Wadley等人2013）。然而，ROS和NO協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激適應(yīng)性反應(yīng)的機(jī)制尚不清楚。
轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子1α（PGC1α）被視為運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生和抗氧化反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子（Lin等人，2005）。PGC1α在運(yùn)動(dòng)后增加，并共激活核呼吸因子NRF-1和NRF-2，其激活線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mtTFA）以促進(jìn)線粒體復(fù)制（Bassel-Duby＆Olson，2006）。實(shí)際上，NO和ROS可以增加骨骼肌中PGC1α，NRF1和mtTFA的表達(dá)，并且抗氧化劑補(bǔ)充可以減少運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的PGC1α水平的增加（Nisoli等人2003; Gomez-Cabrera等人2005; Ristow等人，2009）。這些觀察結(jié)果表明ROS通過PGC1α起作用以調(diào)節(jié)骨骼肌中運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)。然而，PGC1α不是正常運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生和抗氧化劑表達(dá)標(biāo)志物增加所必需的（Leick等人，2008），表明替代機(jī)制也參與調(diào)節(jié)骨骼肌適應(yīng)運(yùn)動(dòng)。
核因子紅細(xì)胞衍生2樣2（NFE2L2;也經(jīng)常稱為Nrf2）是ROS和NO敏感的轉(zhuǎn)錄因子（Kensler等人，2007）。細(xì)胞暴露于氧化應(yīng)激或亞硝化應(yīng)激導(dǎo)致NFE2L2從細(xì)胞質(zhì)（在細(xì)胞質(zhì)中NFE2L2被Keap1錨定來降解）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，在細(xì)胞核中它與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合以啟動(dòng)保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞毒性和氧化損傷的防御（Kensler等，2007）。NFE2L2的主要功能是協(xié)調(diào)抗氧化劑對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)，因此，NFE2L2切除可以防止在最后一次非常激烈的短期跑步訓(xùn)練（2周）后，老年（> 23個(gè)月）小鼠骨骼肌抗氧化基因mRNA水平的立即增加 （Narasimhan等，2014）。此外，NFE2L2是心肌中一氧化碳應(yīng)激（Piantadosi等人，2008）和肝臟炎癥（Piantadosi等人，2011）誘導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生所必需的。
因?yàn)镹FE2L2可以調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生和對(duì)急性氧化和亞硝化應(yīng)激的抗氧化反應(yīng)，我們確定骨骼肌NFE2L2是否被急性運(yùn)動(dòng)激活以及NFE2L2是否調(diào)節(jié)急性和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生和抗氧化劑響應(yīng)的增加。我們報(bào)道NO和ROS均有助于在急性運(yùn)動(dòng)后增加骨骼肌NFE2L2的mRNA，并且NFE2L2表達(dá)是線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物正常增加和急性運(yùn)動(dòng)以及運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后骨骼肌抗氧化反應(yīng)所必需的。此外，我們的數(shù)據(jù)表明，ROS（H2O2）和NO誘導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生標(biāo)記物（mRNA）的增加依賴于NFE2L2和NRF1，而只有NO介導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生基因表達(dá)需要PGC1α。
2. 方法
2.1 動(dòng)物倫理
本研究中描述的所有程序均經(jīng)瑞士蘇黎世獸醫(yī)辦公室（許可證號(hào)ZH245 / 14）批準(zhǔn)，并按照蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院和瑞士國家動(dòng)物福利指南進(jìn)行。研究人員了解生理學(xué)期刊運(yùn)作的倫理原則，這項(xiàng)工作符合動(dòng)物倫理檢查表。
2.2 小鼠繁殖和住房條件
小鼠被養(yǎng)在一個(gè)溫度控制的設(shè)施中，保持12:12小時(shí)的光/暗循環(huán)，并且可以隨意食用不含維生素E、C（S8022-S005；SSNIFF Spezialdiaten GmbH，Soest，Germany）和水的飲食。先前已經(jīng)描述了NFE2L2-/-（也稱為Nrf2-/-）小鼠（Chan等人，1994），是購于Jackson 實(shí)驗(yàn)室（Bar Harbor，ME，USA）并在C57Bl / 6背景下內(nèi)部繁殖。雄性（約25-30g，15-30周齡）NFE2L2-/-小鼠和NEF2L2 + / +同窩小鼠，分別稱為NFE2L2敲除（KO）和野生型（WT），并且C57Bl / 6小鼠應(yīng)用于所有的實(shí)驗(yàn)。所有小鼠均經(jīng)頸椎脫位人工處死。
2.3 運(yùn)動(dòng)協(xié)議和代謝籠
所有運(yùn)動(dòng)小鼠在初始運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)前5天以上分別接受至少兩次跑步機(jī)（Panlab/Harvard Instrument，Holliston，MA，USA）熟悉訓(xùn)練。熟悉訓(xùn)練包括以0-9 米/ 粉種的速度于跑步機(jī)跑步5分鐘，傾斜角度為0°。通過位于跑步機(jī)帶末端的沖擊網(wǎng)格提供溫和的電刺激作為動(dòng)力。有氧能力是通過增量跑步機(jī)測(cè)試至力竭來測(cè)定的。將跑步機(jī)設(shè)定為10°傾斜，并且每2分鐘將速度增加2米/分鐘，直到小鼠在不嘗試?yán)^續(xù)跑步的情況下在沖擊網(wǎng)格上度過>5秒。為了測(cè)試耐力能力，將跑步機(jī)設(shè)定為傾斜15°，并且起始速度為5米/分鐘，其以0.17米/分鐘的速率連續(xù)增加（傾斜），直到小鼠在不嘗試?yán)^續(xù)跑步的情況下在沖擊網(wǎng)格上度過>5秒。
運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練包括30-60分鐘的跑步機(jī)運(yùn)動(dòng)，以10-15米/分鐘的速度運(yùn)行，10°傾斜，4-5天/周，持續(xù)4-6周。急性運(yùn)動(dòng)方案包括1小時(shí)的跑步機(jī)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，以12米/分鐘的速度運(yùn)行，傾斜10°。在指定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行急性運(yùn)動(dòng)后，以及在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練小鼠的最后一次運(yùn)動(dòng)至少36小時(shí)后，收集組織并在液氮中快速冷凍。
在24-48小時(shí)的適應(yīng)期后，使用PhenoMaster（TSE 系統(tǒng)，Bad Homburg，Germany）開路量熱系統(tǒng)測(cè)量超過48小時(shí)（兩個(gè)光/暗循環(huán)）的耗氧量和動(dòng)態(tài)活動(dòng)。
2.4 抗體和試劑
兔NFE2L2抗體購自Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, 美國)， NRF-1購自Cell Signaling Technology (Beverly, MA, 美國)。5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸（AICAR）購自Adipogen AG（Liestal，瑞士）。除非另有說明，否則所有其他試劑均購自Sigma-Aldrich Chemicals（St Louis，MO，美國）。
2.5 N -乙酰半胱氨酸(NAC)和L-NG-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)處理小鼠
對(duì)于涉及抑制NO合酶和清除ROS小鼠的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前3天在小鼠飲用水中分別加入L-NAME（1 g/l）（Wadley＆McConell，2007）或NAC（10 g/l）（Chen等人，2010）（Cobley等,2015）。
2.6 實(shí)時(shí)PCR
使用Trizol試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，美國）從細(xì)胞或冷凍肌肉樣品中提取RNA，并使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，美國）逆轉(zhuǎn)錄mRNA。為了定量mtDNA，通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶K和苯酚 - 氯仿提取分離總DNA。使用SYBR green select master mix試劑盒（Applied Biosystems）在ViiATM 7實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems）上進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR。反應(yīng)一式三份進(jìn)行，并使用ΔΔCt方法以18S核糖體RNA作為內(nèi)部對(duì)照實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量。使用的引物序列列于表1中。
表1. 小鼠定量PCR引物序列
2.7 細(xì)胞培養(yǎng)
C2C12成肌細(xì)胞在含有5.5mM D-葡萄糖和20％胎牛血清的DME培養(yǎng)基中于37℃在5％CO2比21％O2中生長(zhǎng)。通過在抗生素選擇（10天，1μg/ ml 嘌呤霉素）之前使用脂質(zhì)體(Lipofectamine)2000（Invitrogen）轉(zhuǎn)染合并的shRNA克?。═RCN0000012128，TRCN0000012129，TRCN00000121; Broad Institute RNAi consortium，Cambridge，MA，美國）來實(shí)現(xiàn)NFE2L2的短發(fā)夾RNA（shRNA）敲低。通過使用Lipofectamine 2000用指定濃度的相應(yīng)特異性小干擾RNA（siRNA）（Santa Cruz Biotechnology）轉(zhuǎn)染來實(shí)現(xiàn)NRF-1和PGC1α基因表達(dá)的瞬時(shí)敲低，并在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)收集細(xì)胞。用AICAR（1mM），二亞乙基三胺/一氧化氮加合物（Deta / NO）（100μM）或H2O2（5μM）對(duì)C2C12細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的間歇處理，包括將化合物施加5小時(shí)/天，持續(xù)5天。劑量和治療時(shí)間基于先前研究中研究永生化肌肉細(xì)胞中線粒體生物發(fā)生的濃度（McConnell等人2010年；Lira等人2010a），以及初步研究，這些研究獲得了在不導(dǎo)致任何細(xì)胞死亡的情況下提高NFE2l2表達(dá)所需的最佳劑量（數(shù)據(jù)未顯示）。
2.8 免疫印跡
基本上如先前所述（Merry等人，2014）進(jìn)行免疫印跡操作。簡(jiǎn)而言之，將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中分離出來，或者用電動(dòng)手持勻漿機(jī)將冰凍的小鼠組織樣本勻漿到10-20體積的RIPA冰裂解緩沖液中（50mM Hepes，pH 7.4,1％，v / v Triton X-100，1％v / v脫氧膽酸鈉，0.1％v / v SDS，150mM NaCl，10％v / v甘油，1.5mM MgCl2, 1mM EGTA，50mM氟化鈉，蛋白質(zhì)抑制劑混合物（羅氏，巴塞爾，瑞士），1mM苯基甲基磺酰氟，1mM釩酸鈉），在冰上孵育20分鐘，并在4℃下以20,000g離心60分鐘。通過SDS-PAGE分離上清液，并通過標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行免疫印跡處理。
2.9 SOD和檸檬酸合酶活性測(cè)定
將冷凍肌肉與50mm磷酸鹽緩沖液+1mMEDTA一起置于氮?dú)饫鋬錾皾{中研磨，并進(jìn)行超聲處理。裂解液在12,000 g和4℃下離心15分鐘。如上所述，將上清液用于隨后的超氧化物歧化酶測(cè)量（Weimeret al.2014）。通過檢測(cè)在412nm波長(zhǎng)下5,5-二硫代雙-2-硝基苯甲酸酯的增加，在上清液中測(cè)量檸檬酸合酶活性（Srere，1969）。
2.10 谷胱甘肽和蛋白質(zhì)羰基化
使用BIOXYTECH GSH / GSSG-412測(cè)定試劑盒（Oxis International，Inc.，Tampa，F(xiàn)L，USA）測(cè)量全血中總的谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽水平，并根據(jù)制造商的說明書測(cè)定GSH：GSSG比率。根據(jù)制造商的說明書使用OxyBlot蛋白質(zhì)氧化檢測(cè)試劑盒（Merck Millipore，Billerica，MA，USA）監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)羰基化。
2.11 統(tǒng)計(jì)分析
所有數(shù)據(jù)均以平均值±SEM表示。使用非配對(duì)雙尾Student’s t 檢驗(yàn)和單向、雙向ANOVA來確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，所述ANOVA具有所示的Fisher最不顯著差異事后歸因分析。P <0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3. 結(jié)果
3.1 通過運(yùn)動(dòng)增加骨骼肌NFE2L2的表達(dá)
運(yùn)動(dòng)增加骨骼肌產(chǎn)生ROS和NO (Powers & Jackson, 2008)，轉(zhuǎn)錄因子NFE2L2對(duì)細(xì)胞ROS和NO水平的變化敏感(Kensler等，2007)。因此，我們首先確定運(yùn)動(dòng)是否調(diào)節(jié)NFE2L2在小鼠骨骼肌中的表達(dá)。急性跑步機(jī)運(yùn)動(dòng)30分鐘后，骨骼肌NFE2l2及其一些已知下游靶點(diǎn)（谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）和谷胱甘肽還原酶（GSR））的mRNA增加了3倍以上（圖1a）。這種增加是短暫的，并且在運(yùn)動(dòng)后2或16小時(shí)與休息的肌肉沒有差別（圖1B）。此外，NFE2L2，GST和GSR 的mRNA在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的小鼠的骨骼肌中升高（圖1C）。盡管測(cè)試了幾種市售抗體，但我們無法鑒定出在組織樣品中特異性檢測(cè)到NFE2L2的抗體（圖1D）; 然而，我們通過測(cè)定骨骼肌、肝臟和心臟中的NFE2L2 mRNA水平，證實(shí)NFE2L2 KO小鼠不表達(dá)NEF2L2（圖1E）。圖1D中顯示的印跡是使用NFE2L2抗體＃12721（Cell Signaling Technologies）獲得的，但是代表在小鼠肌肉，心臟和肝臟樣本中測(cè)試的抗體＃8882（Cell Signaling Technologies）和H300和C20（Santa Cruz Biotechnology）。重要的是要承認(rèn)，盡管NFE2L2具有65-70kDa的預(yù)測(cè)分子量，但認(rèn)為其在95-110kDa處被檢測(cè)到（Lau等人，2013）。因此，我們無法確認(rèn)NFE2L2 mRNA表達(dá)導(dǎo)致組織樣品中蛋白質(zhì)水平增加。然而，由于NFE2L2主要作為轉(zhuǎn)錄因子，因此其自身和其他靶標(biāo)（GST和GSR）的mRNA增加證實(shí)它受運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)。
在確定急性運(yùn)動(dòng)和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練增加骨骼肌NFE2L2 mRNA后，我們接下來研究了可能在運(yùn)動(dòng)過程中誘導(dǎo)NFE2L2表達(dá)的刺激因素。使用模擬運(yùn)動(dòng)的化合物處理C2C12成肌細(xì)胞，包括5 '腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)激活劑(AICAR)、過氧化氫(H2O2)和NO供體Deta/NO增加NFE2L2蛋白表達(dá)(圖1F)。為了確定ROS和NO是否在體內(nèi)調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的NFE2L2 mRNA的增加，在急性運(yùn)動(dòng)之前，我們用抗氧化劑NAC或NO合酶抑制劑L-NAME來處理小鼠。NAC將血液還原型谷胱甘肽（GSH）增加至氧化型谷胱甘肽（GSSG）的比率，表明抗氧化作用和全身氧化應(yīng)激減少（圖1I）。運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌NFE2L2 mRNA的增加被L-NAME和NAC減弱，NAC也減弱了運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的NFE2L2靶GST和GSR mRNA的增加（圖1G和H）。
圖1. 運(yùn)動(dòng)后骨骼肌中NFE2L2的表達(dá)
小鼠骨骼肌(腓腸肌)NFE2L2和NFE2L2靶基因(GST和GSR) mRNA在急性(1小時(shí))一輪跑步機(jī)運(yùn)動(dòng)(A和B)和6周跑步機(jī)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練(C)30分鐘后升高。代表性印跡顯示測(cè)試的NFE2L2抗體細(xì)胞在裂解物中檢測(cè)到報(bào)道的NFE2L2大?。?5-110kDa）的條帶，而在NFE2L2 shRNA處理的細(xì)胞沒有發(fā)現(xiàn)；然而，這些抗體無法在組織裂解液中檢測(cè)到正確分子量的條帶，而NFE2L2 KO小鼠的裂解液中則沒有這種條帶(D)。NFE2L2 KO小鼠在骨骼肌，肝臟或心臟中不表達(dá)NFE2L2 mRNA（E）。用AICAR（1mM）和H2O2（50μM）或Deta / NO（100μM）急性（5小時(shí)）處理C2C12成肌細(xì)胞增加NFE2L2蛋白表達(dá)（F）。用NO合成酶抑制劑（G）或抗氧化劑（NAC）（H）治療小鼠三天減弱了急性（1小時(shí)）運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌（腓腸?。㎞FE2L2、GST和GSR mRNA表達(dá)的增加和（I）增加血液GSH：GSSG比率。結(jié)果顯示為平均值±SE（細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的每組n = 5-7;小鼠實(shí)驗(yàn)的n分別顯示）。 使用雙尾Student’s t檢驗(yàn)或具有Fisher最不顯著差異事后歸因分析的單向ANOVA確定顯著性。與休息/對(duì)照相比，分別*P<0.05和***P<0.001。與相同條件下未處理組相比，＃P<0.05。 [彩圖在wileyonlinelibrary.com上查看]
3.2 NEF2L2是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物所必需的
ROS和NO參與調(diào)控運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生(GomezCabrera et al. 2005;Gomez-Cabrera等，2008);而NFE2L2是心肌和肝臟應(yīng)激刺激線粒體生物發(fā)生所必需的(Piantadosi et al. 2008;Piantadosi等人，2011)。因此，我們研究了NFE2L2是否是運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌線粒體生物發(fā)生所必需的。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練增加了WT但不是NFE2L2 KO小鼠的骨骼肌中的mtDNA(線粒體DNA)和檸檬酸合酶活性（線粒體體積標(biāo)記物）（圖2A和B）。與此相一致，與相同基因型的未訓(xùn)練小鼠相比，經(jīng)訓(xùn)練的WT而不是未訓(xùn)練的NFE2L2 KO小鼠的骨骼肌中的線粒體生物發(fā)生相關(guān)基因mRNA增加（圖2C）。然而，由于個(gè)體差異很大，我們無法檢測(cè)到PGC1α，mtTFA或細(xì)胞色素c氧化酶亞基4（COX4）的骨骼肌蛋白水平在訓(xùn)練或基因型上有差異（數(shù)據(jù)未顯示）。
與線粒體生物發(fā)生數(shù)據(jù)一致，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練提高了WT小鼠的有氧和耐力，但沒有提高NFE2L2 KO小鼠的有氧和耐力(圖2D和E)。盡管對(duì)WT或NFE2L2 KO小鼠體重沒有訓(xùn)練效果（圖2F），訓(xùn)練的WT小鼠的全身能量消耗大于訓(xùn)練的NFE2L2小鼠的全身能量消耗（圖2G），在未訓(xùn)練的小鼠中并沒發(fā)現(xiàn)這樣的效果并且不是活動(dòng)水平差異的結(jié)果（數(shù)據(jù)未顯示）（圖2H）。
圖2. NFE2L2是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生所必需的
在跑步機(jī)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練（訓(xùn)練）或正常久坐行為（未經(jīng)訓(xùn)練）6周后，在WT和NFE2L2 KO小鼠的骨骼肌（腓腸?。┲袦y(cè)量mtDNA（A），檸檬酸合酶活性（B）和線粒體生物發(fā)生相關(guān)基因mRNA（C）。經(jīng)過四周跑步訓(xùn)練的NRFE2L2 KO小鼠的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)(D和E)和能量消耗(G)均低于經(jīng)過訓(xùn)練的WT小鼠。WT和NFE2L2 KO小鼠具有相似的體重和活動(dòng)水平（F和H）。結(jié)果顯示為平均值±SE（n分別顯示）。使用具有Fisher最不顯著差異事后歸因分析的單向ANOVA確定顯著性。與相同基因型的未訓(xùn)練或預(yù)訓(xùn)練小鼠相比，* P <0.05 ** P <0.001。與同條件下的WT相比，＃P <0.05。 EE，能源消耗。 [彩圖可在wileyonlinelibrary.com上查看]
3.3 ROS和NO通過NFE2L2和NRF-1起作用以誘導(dǎo)線粒體生物發(fā)生
為了進(jìn)一步研究NFE2L2在運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生中的作用，我們?cè)u(píng)估了急性運(yùn)動(dòng)對(duì)WT和NFE2L2 KO小鼠中線粒體生物發(fā)生相關(guān)基因mRNA的影響（圖3A）。在急性運(yùn)動(dòng)后，WT和NFE2L2 KO小鼠的骨骼肌中PGC1α和COX4 mRNA相似地增加，而NRF-1和mtTFA mRNA僅在WT小鼠的骨骼肌中增加（圖3A）。
然后，我們利用C2C12成肌細(xì)胞模型來研究NFE2L2可能通過何種途徑促進(jìn)骨骼肌線粒體生物發(fā)生。用AMPK激活劑(AICAR)對(duì)對(duì)照組和NFE2L2蛋白(NFE2L2 shRNA)缺乏的細(xì)胞進(jìn)行急性處理(圖1D)。盡管AICAR處理增加了對(duì)照和NFE2L2缺陷細(xì)胞中PGC1α和mtTFA mRNA水平，但NFE2L2 shRNA阻止了AICAR誘導(dǎo)的NRF-1和COX4 mRNA水平的增加（圖3B）。同樣，NFE2L2 shRNA也減弱了AICAR誘導(dǎo)的mtDNA長(zhǎng)時(shí)間間歇性增加(圖3C)。為了確定NFE2L2在NO或ROS介導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生中的作用，對(duì)照組和NFE2L2 shRNA細(xì)胞分別暴露于NO供體Deta/NO或H2O2的急性處理(圖3D和E)或長(zhǎng)時(shí)間間歇處理中(圖3F)。在對(duì)照組中，急性Deta/NO或H2O2處理增加線粒體生物發(fā)生基因mRNA，而NFE2L2 shRNA細(xì)胞則沒有。同樣地，使用DeTa/NO或H2O2長(zhǎng)時(shí)間間歇處理增加了對(duì)照組的mtDNA，但沒有增加NFE2L2 shRNA細(xì)胞的mtDNA（圖3F）。
因?yàn)镹RF-1的啟動(dòng)子區(qū)域含有NFE2L2結(jié)合位點(diǎn)（Piantadosi＆Suliman，2006），并且NFE2L2缺乏不影響急性運(yùn)動(dòng)或AICAR誘導(dǎo)的PGC1α表達(dá)（圖3A和B），我們使用siRNA來確定是否NRF-1和PGC1α是NO和ROS介導(dǎo)的下游線粒體生物發(fā)生介質(zhì)mtTFA mRNA的增加所必需的。通過NRF-1的siRNA敲低阻止了Deta / NO和H2O2誘導(dǎo)的mtTFA mRNA增加（圖3G），并且PGC1α siRNA敲低阻止了Deta / NO誘導(dǎo)的但不抑制H2O2誘導(dǎo)的mtTFA增加（圖3H）。
圖3. NFE2L2是急性運(yùn)動(dòng)、NO和H2O2誘導(dǎo)線粒體生物合成相關(guān)基因mRNA增加所必需的
急性運(yùn)動(dòng)后4小時(shí)WT和NFE2L2 KO小鼠的骨骼?。枘c肌）中線粒體生物發(fā)生相關(guān)基因mRNA水平（A）。在用AICAR（1mM）（B），Deta / NO（100μM）（D）或H2O2（50μM）（E）處理5小時(shí)后，對(duì)照shRNA或NFE2L2shRNA C2C12成肌細(xì)胞中的線粒體生物發(fā)生相關(guān)基因mRNA表達(dá)。在用AICAR（1mM）（C），Deta / NO（100μM）或H 2 O 2（5μM）（F）處理5天（5小時(shí)/天）后，在對(duì)照shRNA或NFE2L2 shRNA C2C12成肌細(xì)胞中測(cè)定mtDNA。在對(duì)照組、NRF-1（100nM）（G）或PGC1α（10nM）（H） siRNA轉(zhuǎn)染后24小時(shí)用Deta / NO（100μM）或H2O2（50μM）刺激C2C12成肌細(xì)胞持續(xù)5小時(shí)來評(píng)估m(xù)tTFA mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示為平均值±SE（對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，每組n = 6-8;對(duì)于小鼠實(shí)驗(yàn)，n分別顯示）。使用單因素方差分析和Fisher最不顯著差異事后歸因分析確定顯著性。與相同基因型的休息或未處理小鼠或si/shRNA小鼠相比，* P <0.05，** P <0.01 *** P <0.001。與相同條件下的對(duì)照組si / shRNA小鼠相比，＃P <0.05。 [彩圖可在wileyonlinelibrary.com上查看]
3.4 ROS，NO和NFE2L2調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)
NO合成抑制劑L-NAME和抗氧化劑NAC阻止急性運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌抗氧化基因超氧化物歧化酶（SOD）1，SOD2，過氧化氫酶，Prx1和Trx1 mRNA的增加（圖4A和B）。雖然SOD1 mRNA水平升高，并且SOD2在未鍛煉的NFE2L2骨骼肌中趨于升高，但急性運(yùn)動(dòng)并未進(jìn)一步增加其水平，也沒有增加過氧化氫酶mRNA（圖4C）。相反，急性運(yùn)動(dòng)增加了WT小鼠骨骼肌中SOD1，SOD2和過氧化氫酶的mRNA水平（圖4C）。在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練之后，SOD1，SOD2和過氧化氫酶mRNA在WT的骨骼肌中增加而在NFE2L2KO小鼠中沒有增加（圖4D），而Prx1的mRNA僅通過在NFE2L2KO小鼠的骨骼肌中的訓(xùn)練而增加。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練增加WT但不是NFE2L2 KO小鼠的骨骼肌SOD活性（圖4E）。盡管具有較低的抗氧化水平，但NFE2L2 KO小鼠骨骼肌中的蛋白氧化(通過氧印跡蛋白羰基化實(shí)驗(yàn)評(píng)估)并沒有升高，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練也沒有改變蛋白氧化水平(圖4F)。
圖4. NFE2L2，ROS和NO調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)
采用NO合酶抑制劑(L-NAME) (A)或抗氧化劑(NAC) (B)處理小鼠3天，在急性(1小時(shí))平板運(yùn)動(dòng)后30分鐘檢測(cè)骨骼肌(腓腸肌)抗氧化劑基因mRNA的表達(dá)。急性平板運(yùn)動(dòng)(C)或6周平板運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練(訓(xùn)練)或正常久坐行為(未經(jīng)訓(xùn)練)后4 h, WT和NFE2L2 KO小鼠骨骼肌(腓腸肌)中抗氧化基因mRNA或SOD活性測(cè)定(D和E)。WT和NFE2L2 KO腓腸肌蛋白羰基化水平相似，且不受運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的影響(F)。結(jié)果顯示為平均值±SE（n分別顯示）。使用具有Fisher最不顯著差異事后歸因分析的單向ANOVA確定顯著性。與休息或未經(jīng)訓(xùn)練的相比，* P <0.05和*** P <0.001。 與未處理的或相同條件下的WT相比，＃P <0.05。CAT，過氧化氫酶; Prx，過氧化物還原酶; Trx，氧碘氧還蛋白。 [彩圖可在wileyonlinelibrary.com上查看]
4. 討論
在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)NO和ROS在急性運(yùn)動(dòng)應(yīng)激后調(diào)節(jié)NFE2L2 mRNA水平，NFE2L2表達(dá)的中斷損害了急性運(yùn)動(dòng)和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)的骨骼肌線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物的增加和抗氧化反應(yīng)。與這些發(fā)現(xiàn)一致，缺乏NFE2L2的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練小鼠降低了全身能量消耗和運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)。本研究首次提供了運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)NO和ROS增加可能促進(jìn)對(duì)運(yùn)動(dòng)壓力適應(yīng)機(jī)制的因果證據(jù)。
人類抗氧化劑補(bǔ)充(Gomez-Cabrera等，2008;Ristow等，2009;Paulsen等(2014a)和嚙齒類動(dòng)物模型(Gomez-Cabrera等，2005;Strobel等人，2011)已被證明能夠減弱運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物的增加。本研究通過提供證據(jù)進(jìn)一步證明，運(yùn)動(dòng)期間補(bǔ)充抗氧化劑會(huì)減弱NFE2L2的正常激活，并且NFE2L2是線粒體生物反應(yīng)對(duì)運(yùn)動(dòng)的氧化還原敏感性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。運(yùn)動(dòng)激活骨骼肌中的AMPK和p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），這些蛋白激酶被認(rèn)為通過PGC1α起作用，觸發(fā)轉(zhuǎn)錄因子NRF-1，NRF-2和mtTFA的反應(yīng)從而誘導(dǎo)線粒體生物合成（Bassel-Duby＆Olson，2006）。盡管抗氧化劑補(bǔ)充劑可以減輕急性運(yùn)動(dòng)引起的AMPK和p38 MAPK磷酸化和PGC1α表達(dá)的增加（Gomez-Cabrera等人，2005），這并不總是阻止運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練導(dǎo)致線粒體生物發(fā)生的增加（Wadley等人2013）。此外，缺乏AMPKα2或PGC1α的小鼠對(duì)運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)出正常的線粒體生物生成反應(yīng)（Jorgensen等人2007年；Leick等人2008）。這表明其他氧化還原敏感途徑可能參與調(diào)節(jié)響應(yīng)運(yùn)動(dòng)的線粒體生物合成。
我們的研究發(fā)現(xiàn)，NFE2L2表達(dá)的中斷會(huì)損害運(yùn)動(dòng)，NO和H2O2誘導(dǎo)的線粒體質(zhì)量標(biāo)記物(檸檬酸合酶和mtDNA)的增加得到了先前研究的支持，這些研究表明NFE2L2調(diào)節(jié)白藜蘆醇、敗血癥和一氧化碳誘導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生(Piantadosi et al. 2008;Piantadosiet。2011;Kim等，2014)。機(jī)制上，NRF-1啟動(dòng)子區(qū)含有NFE2L2結(jié)合位點(diǎn)(Piantadosiet al. 2011)，表明NFE2L2激活可誘導(dǎo)NRF-1轉(zhuǎn)錄，隨后NRF-1可與mtTFA相互作用，驅(qū)動(dòng)線粒體生物發(fā)生。急性運(yùn)動(dòng)，NO和H2O2誘導(dǎo)的NRF-1和mtTFA的增加依賴于NFE2L2，并且在肌肉細(xì)胞中，通過破壞NRF-1來阻止NO和H2O2誘導(dǎo)的mtTFA增加。與我們的肌肉細(xì)胞數(shù)據(jù)一致，嚙齒動(dòng)物中的NO合酶抑制劑和抗氧化劑補(bǔ)充減少了急性運(yùn)動(dòng)后的mtTFA表達(dá)（Wadley＆McConell，2007; Wadley等人，2013），并且在大鼠肝細(xì)胞瘤中，氧化應(yīng)激增加了NRF -1與mtTFA的結(jié)合（Piantadosi＆Suliman，2006）。這表明ROS和NO可以通過NFE2L2和NRF-1起作用以促進(jìn)由mtTFA調(diào)節(jié)的線粒體生物發(fā)生。
為了支持這個(gè)概念：NFE2L2是線粒體生物發(fā)生信號(hào)級(jí)聯(lián)中PGC1α下游途徑的一部分，在缺乏NFE2L2的情況下，AICAR和急性運(yùn)動(dòng)均刺激PGC1αmRNA的正常增加。然而，有趣的是，PGC1α的siRNA敲低抑制了了NO但不抑制H2O2介導(dǎo)的mtTFA mRNA的增加。考慮到AICAR刺激NFE2L2表達(dá)和AICAR誘導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生部分地被NFE2L2 shRNA敲低而抑制，我們推測(cè)在涉及PGC1α和NFE2L2促進(jìn)線粒體生物發(fā)生的途徑之間可能存在一定程度的合作。以前的研究表明NO通過涉及cGMP形成和PGC1α誘導(dǎo)的途徑促進(jìn)線粒體生物發(fā)生（Nisoli等，2003; Lira等，2010b）。雖然NO與Keap1半胱氨酸151相互作用以抑制NFE2L2的降解（McMahon等人，2010），從而促進(jìn)NFE2L2表達(dá)，但尚不清楚這是否是運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的NO促進(jìn)NFE2L2與NRF-1相互作用的機(jī)制或是否涉及中間步驟，例如cGMP的形成。無論如何，由于H2O2似乎獨(dú)立于PGC1α起作用，PGC1α和NFE2L2可以協(xié)同作用和/或是相互獨(dú)立的觀點(diǎn)需要進(jìn)一步關(guān)注。
然而，有幾個(gè)研究小組報(bào)告說，抗氧化劑補(bǔ)充劑不會(huì)影響正常的骨骼肌運(yùn)動(dòng)反應(yīng)（Yfanti等人2010; Higashida等人2011; Wadley等人2013）。盡管可變的抗氧化劑補(bǔ)充劑（類型，持續(xù)時(shí)間和劑量）和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練（模式，持續(xù)時(shí)間，強(qiáng)度）可能是重要的促成因素（Merry＆Ristow，2015），但這些支持運(yùn)動(dòng)線粒體生物發(fā)生途徑的發(fā)現(xiàn)可能是多余的。實(shí)際上，我們表明ROS和NO都有助于急性運(yùn)動(dòng)后NFE2L2的激活，這可能表明，盡管清除一個(gè)可能有效地減少線粒體對(duì)運(yùn)動(dòng)信號(hào)的生物生成反應(yīng)，但這種抑制作用已被克服，和/或替代途徑正在上調(diào)，伴隨著隨后的發(fā)作導(dǎo)致正常的訓(xùn)練反應(yīng)。此外，必須承認(rèn)，在本研究中，我們使用了全身NFE2L2缺陷小鼠，盡管進(jìn)一步的體內(nèi)研究應(yīng)該考慮這些小鼠的鈍性運(yùn)動(dòng)反應(yīng)是肌肉特異性作用的結(jié)果還是全身調(diào)節(jié)的結(jié)果。
NFE2L2調(diào)控從酵母、秀麗隱球菌到哺乳動(dòng)物等生物體的基礎(chǔ)抗氧化表達(dá)和對(duì)應(yīng)激的抗氧化反應(yīng)(Kensler et al. 2007;Nguyen等，2009)。最近，已顯示NFE2L2在老年小鼠的骨骼?。∟arasimhan等人，2014）和年輕小鼠的心?。∕uthusamy等人，2012）中進(jìn)行徹底運(yùn)動(dòng)后立即增加抗氧化劑mRNA表達(dá)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，ROS和NO都參與了NFE2L2在運(yùn)動(dòng)過程中的激活，且NFE2L2不僅是急性運(yùn)動(dòng)后抗氧化劑表達(dá)和抗氧化活性正常增加的原因，而且也是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的結(jié)果。我們還報(bào)道SOD1和2的表達(dá)在基礎(chǔ)（休息）狀態(tài)下上調(diào)，并且與WT小鼠不同，在NFE2L2KO小鼠中通過運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練增加過氧化物酶1的表達(dá)。我們還報(bào)道了在基礎(chǔ)(休息)狀態(tài)下SOD1和2的表達(dá)上調(diào)，與WT小鼠不同，在NFE2L2 KO小鼠中，過氧合蛋白1的表達(dá)隨著運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的增加而增加。雖然這并沒有轉(zhuǎn)化為NFE2L2 KO小鼠基礎(chǔ)SOD活性的增加，但這可能是過氧化氫酶和谷胱甘肽代謝相關(guān)基因表達(dá)減少的代償性反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示;Narasimhan etal . 2014)，表明其他機(jī)制也調(diào)控骨骼肌抗氧化表達(dá)。一個(gè)可能的候選者是核因子κ-輕鏈增強(qiáng)子激活的B細(xì)胞（NF-κB），已知其參與抗氧化劑表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，并且維生素C和別嘌呤醇補(bǔ)充抑制運(yùn)動(dòng)引起NF-κB表達(dá)的增加（Gomez-Cabrera等人2005; Gomez-Cabrera等人2008; Ji，2008）。
在一種被稱為毒物興奮效應(yīng)(Southam & Ehrlich, 1943)的反應(yīng)中，ROS和NO應(yīng)激的急劇增加促進(jìn)了適應(yīng)性，保護(hù)細(xì)胞免受隨后應(yīng)激的潛在有害影響，并延長(zhǎng)了秀麗線蟲和黑腹果蠅的壽命(Ristow & Zarse, 2010)。切除線蟲NFE2L2同源物(skin-1)，消除了干預(yù)措施對(duì)壽命延長(zhǎng)的作用，例如胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子-1信號(hào)傳導(dǎo)的損傷（Zarse等人，2012）、葡萄糖胺補(bǔ)充劑（Weimer等人， 2014）和糖酵解抑制（Schulz等人，2007）。重要的是，這些干預(yù)措施需要增加ROS來誘導(dǎo)適應(yīng)性，包括增加線粒體呼吸和抗氧化表達(dá)，以延長(zhǎng)壽命。因?yàn)槎ㄆ诘捏w育鍛煉也會(huì)增加預(yù)期壽命（Warburton等人，2006），并且增強(qiáng)的線粒體呼吸和增加的內(nèi)源性抗氧化劑表達(dá)可以預(yù)防代謝疾?。↘oves等人，2008; Anderson等人，2009），因此很容易推測(cè) NFE2L2可能參與運(yùn)動(dòng)的整個(gè)生物體健康促進(jìn)作用。事實(shí)上，NFE2L2激活劑已被證明可以延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲和黑腹果蠅的壽命（Suckow＆Suckow，2006; Lee等人，2010），并預(yù)防小鼠的代謝疾?。╕u 等，2011; He 等，2012）。然而，令人驚訝的是，NFE2L2的脂肪特異性和全身缺失也減少了遺傳和飲食誘導(dǎo)的肥胖（Chartoumpekis等人2011; Xue等人2013）。這可能表明NFE2L2在調(diào)節(jié)代謝反應(yīng)中的組織特異性作用，并表明與慢性缺失與急性激活相關(guān)的差異效應(yīng)。無論如何，這些數(shù)據(jù)和以前發(fā)表的人類研究數(shù)據(jù)（Gomez-Cabrera等人2008; Ristow等人2009; Paulsen等人2014a; Paulsen等人2014b; Cobley等人2015）表明在正常生理?xiàng)l件下，特別是在運(yùn)動(dòng)過程中產(chǎn)生的ROS，是最佳適應(yīng)和對(duì)未來細(xì)胞應(yīng)激源的保護(hù)所必需的。這建議不要在人體中不必要地使用抗氧化劑。雖然只是推測(cè)，但我們的數(shù)據(jù)也可能表明，攝入激活NFE2L2的營養(yǎng)素可能對(duì)細(xì)胞功能有保護(hù)作用，類似于運(yùn)動(dòng);然而，這還有待證實(shí)。這些結(jié)果與興奮理論一致，其中ROS / NO應(yīng)激的急劇增加啟動(dòng)細(xì)胞和可能的系統(tǒng)范圍的適應(yīng)性反應(yīng)，其改善對(duì)預(yù)期應(yīng)激的耐受性。
總之，我們的數(shù)據(jù)表明運(yùn)動(dòng)過程中產(chǎn)生的NO和ROS激活骨骼肌NFE2L2。此外，NFE2L2的表達(dá)是正常線粒體生物發(fā)生和對(duì)急性運(yùn)動(dòng)&運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的抗氧化轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所必需的。這些結(jié)果與毒物興奮效應(yīng)相一致，ROS/NO壓力的急劇增加啟動(dòng)了細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)，可能還啟動(dòng)了整個(gè)系統(tǒng)的適應(yīng)性反應(yīng)，從而提高了對(duì)預(yù)期應(yīng)激的耐受性。
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