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NRF2和KEAP1在慢性疾病中的治療靶向性
發(fā)表于：2019-04-02 作者：admin 來(lái)源：本站 點(diǎn)擊量：13970
Therapeutic targeting of the NRF2 and KEAP1 partnership in chronic diseases. Nat Rev Drug Discov. 2019 Jan 4. doi: 10.1038/s41573-018-0008-x. [Epub ahead of print] Review. PubMed PMID: 30610225.
摘要：轉(zhuǎn)錄因子NF-E2 p45相關(guān)因子2（NRF2;由NFE2L2編碼）及其主要負(fù)調(diào)節(jié)因子，E3連接酶受體Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（KEAP1）是維持氧化還原、代謝和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)以及炎癥調(diào)節(jié)的關(guān)鍵。因此，激活NRF2可對(duì)多種疾病起到細(xì)胞保護(hù)作用，包括肺和肝的慢性疾病、自身免疫病、神經(jīng)退行性疾病和代謝性疾病以及癌癥啟動(dòng)。一種NRF2激活劑已獲得臨床批準(zhǔn)，并且基于半胱氨酸傳感器KEAP1的幾種親電修飾劑及其與NRF2相互作用的抑制劑目前正在臨床開發(fā)中。然而，在靶向特異性、藥效學(xué)特性、療效和安全性方面仍存在挑戰(zhàn)。
前言
轉(zhuǎn)錄因子NF-E2 p45相關(guān)因子2（NRF2;由NFE2L2編碼）于1994年作為人類cap 'n' collar（CNC）堿性區(qū)域亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族成員被發(fā)現(xiàn)（1）。隨后的研究，包括NRF2敲除小鼠的產(chǎn)生，確定NRF2調(diào)控約250個(gè)基因的表達(dá)，調(diào)控的基因在其啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)中含有增強(qiáng)子序列，稱為抗氧化應(yīng)答元件（ARE）（2, 3）。這些基因編碼一個(gè)合作酶網(wǎng)絡(luò)，參與內(nèi)生和外生生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)、抗氧化代謝、碳水化合物和脂類的中間代謝、鐵的分解代謝、蛋白質(zhì)降解和炎癥調(diào)節(jié)（4）。通過這個(gè)轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，NRF2能夠協(xié)調(diào)多方面應(yīng)對(duì)各種形式的應(yīng)激，維持穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境。
1999年，Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（KEAP1）被鑒定為NRF2的抑制因子（5），又過了5年才被報(bào)道為E3泛素連接酶底物適配器，靶向NRF2進(jìn)行蛋白酶體的快速降解（6-8）。因此，KEAP1確保在無(wú)應(yīng)激條件下，NRF2是低豐度的蛋白質(zhì)，具有僅約15-40分鐘的有限半衰期，這取決于細(xì)胞類型。然而，重要的是，KEAP1含有幾個(gè)高活性的半胱氨酸，經(jīng)親電子分子修飾后，可防止其靶向NRF2進(jìn)行蛋白酶體降解，從而導(dǎo)致NRF2蛋白在氧化還原應(yīng)激下快速核聚集，并在與小肌肉筋膜纖維肉瘤癌基因同源蛋白（sMAF）二聚化后，通過NRF2-sMAF誘導(dǎo)含有ARE的基因（9,10）。
現(xiàn)在人們普遍認(rèn)識(shí)到，由于NRF2-靶基因編碼的蛋白質(zhì)的多功能和全面的細(xì)胞保護(hù)作用（包括抗氧化、解毒和抗炎），因此，NRF2-KEAP1信號(hào)通路對(duì)于預(yù)防以氧化應(yīng)激和炎癥為基礎(chǔ)病理特征的多種疾病至關(guān)重要。這些疾病包括代謝、炎癥和自身免疫性疾病，肺、肝、腎、胃腸道和心血管系統(tǒng)疾病以及神經(jīng)疾?。?, 11）。NRF2在這些非腫瘤性疾病中的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)證據(jù)將在本綜述的后面討論。我們還討論了NRF2在癌癥中的作用，這是一個(gè)需要深入研究的問題（12）。
通過單粒子電子顯微鏡獲得的KEAP1二聚體3D重建顯示，該蛋白具有叉狀莖結(jié)構(gòu)，包括兩個(gè)大球體，它們包圍了中間區(qū)域（IVR）、Kelch和羧基末端結(jié)構(gòu)域，而二聚化由BTB域介導(dǎo)（圖1a）（13）?？紤]到KEAP1包含許多不同且自主運(yùn)作的半胱氨酸傳感器（C151、C226、C273、C288和C613）（14-16），現(xiàn)有證據(jù)表明，NRF2和KEAP1整合了一氧化氮、Zn2+、烯醛信號(hào)傳導(dǎo)與氧化還原信號(hào)傳導(dǎo)一起提供了一種可能至少部分進(jìn)化的機(jī)制，以允許快速適應(yīng)飲食中遇到的植物化學(xué)物質(zhì)。許多植物來(lái)源的親電異種生物激活NRF2-KEAP1信號(hào)通路以引發(fā)細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)，KEAP1中的高活性半胱氨酸起直接傳感器的作用（17-19）。這些傳感器與親電子試劑的高反應(yīng)性使得KEAP1在沒有非特異性硫醇修飾的情況下進(jìn)行靶向治療成為可能（圖1b）。因此，已經(jīng)描述了許多天然存在的NRF2靶基因誘導(dǎo)劑（20），并且新的誘導(dǎo)劑在不斷被發(fā)現(xiàn)。
盡管大量學(xué)術(shù)實(shí)驗(yàn)室參與了NRF2激活劑的鑒定，但從歷史上看，制藥公司在這個(gè)令人興奮和充滿希望領(lǐng)域的參與度卻相當(dāng)?shù)?。業(yè)界之所以不愿將NRF2-keap1信號(hào)通路視為有價(jià)值的藥物靶點(diǎn)，部分原因可能是其廣泛的生物化學(xué)活性，而不僅僅是控制由NRF2直接或間接調(diào)控的抗氧化系統(tǒng)。NRF2激活劑的各種直接和間接效應(yīng)有時(shí)被解釋為非特異性效應(yīng)的證據(jù)。然而，KEAP1中幾種不同的基于硫醇的氧化還原開關(guān)的進(jìn)化允許哺乳動(dòng)物適應(yīng)廣泛的植物化學(xué)物質(zhì)，這為改變NRF2的激活引起某些“脫靶”效應(yīng)并采用更廣泛視野的觀念提供了理論基礎(chǔ)。NRF2的激活產(chǎn)生有益的“多靶點(diǎn)”細(xì)胞保護(hù)作用（11）。尤其是NRF2激活的多靶點(diǎn)效應(yīng)包括維持氧化還原信號(hào)、增強(qiáng)異種生物轉(zhuǎn)化、控制和解決炎癥、抑制糖異生和肝脂肪生成、支持蛋白穩(wěn)定和抑制纖維化（9）。在這方面，值得注意的是，大多數(shù)慢性疾病，特別是老年人的慢性病，沒有獨(dú)特的病因?qū)W，也沒有單一的病理表型，因此，它們可能通過激活NRF2的藥物得到最有效的治療。事實(shí)上，與更有針對(duì)性的治療干預(yù)相比，NRF2激活后廣泛的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制的刺激不太可能被致病過程有效地淹沒或規(guī)避。
這種對(duì)NRF2作為潛在藥物靶標(biāo)的廣泛認(rèn)可引起了制藥業(yè)的興趣，并導(dǎo)致對(duì)NRF2調(diào)節(jié)劑臨床開發(fā)的大量投資（21）。NRF2激活劑富馬酸二甲酯(DMF;目前，商標(biāo)名如Fumaderm或Tecfidera)已被臨床用于治療銀屑病和復(fù)發(fā)性多發(fā)性硬化癥(MS)(表1)，其目前的分布情況仍是其他制藥公司希望達(dá)到的目標(biāo)。目前，多種不同化學(xué)類型的NRF2激活劑處于臨床開發(fā)的不同階段，如靶向KEAP1半胱氨酸的富馬酸衍生物、異硫氰酸硫蘿卜硫素(SFN;4‐異硫氰酸甲酰丁酯)、氰烯酮三萜、硝基脂肪酸和羥胺。其他候選藥物包括破壞NRF2-KEAP1蛋白-蛋白相互作用(PPIs)的非親電化合物，以及具有keap1獨(dú)立作用模式的分子。NRF2的抑制劑也在研究中，但尚未進(jìn)行臨床試驗(yàn)。本綜述概述了這些候選藥物，并強(qiáng)調(diào)了針對(duì)NRF2-KEAP1信號(hào)通路不尋常的性質(zhì)和至關(guān)重要的意義。本文描述了NRF2在細(xì)胞氧化還原、代謝和蛋白穩(wěn)態(tài)以及炎癥調(diào)控中的生理作用，并為NRF2在非腫瘤性疾病中的保護(hù)作用提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。評(píng)價(jià)了目前臨床開發(fā)的各種小分子NRF2活性藥理調(diào)節(jié)劑的優(yōu)缺點(diǎn)。最后，強(qiáng)調(diào)了與NRF2調(diào)節(jié)劑開發(fā)相關(guān)的持續(xù)挑戰(zhàn)，包括靶點(diǎn)特異性、藥效學(xué)評(píng)估、生物利用度、有效性和安全性。
NRF2-KEAP1信號(hào)通路的生理作用
氧化還原、代謝和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)
自從其最初被發(fā)現(xiàn)參與生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，調(diào)節(jié)某些細(xì)胞色素P450氧化還原酶、結(jié)合酶和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)（表2），NRF2參與控制細(xì)胞內(nèi)氧化還原環(huán)境的作用變得越來(lái)越明顯，最終將NRF2-KEAP1信號(hào)通路識(shí)別為“硫醇驅(qū)動(dòng)的總開關(guān)”用于“整個(gè)系統(tǒng)范圍的氧化應(yīng)激反應(yīng)”（22）。NRF2調(diào)控參與NADPH生成的4個(gè)基因(葡萄糖6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、蘋果酸酶1和異檸檬酸脫氫酶1)的表達(dá)（23–26）。這種還原當(dāng)量的供應(yīng)進(jìn)一步被大量氧化還原反應(yīng)所利用，其中許多氧化還原反應(yīng)也受到NRF2的調(diào)節(jié)。因此，NRF2調(diào)控氧化還原緩沖物還原型谷胱甘肽(GSH;其氧化形式為GSSG)，如谷氨酸半胱氨酸連接酶、谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶和數(shù)個(gè)谷胱甘肽s -轉(zhuǎn)移酶的催化和調(diào)節(jié)亞基（4）。此外，氧化還原蛋白家族中的許多輔助蛋白，如硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶、過氧化物還蛋白和硫還蛋白，都受到NRF2的調(diào)控，提供區(qū)域活性氧生成的區(qū)域化傳感和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（ROS;即過氧化氫（H2O2）羥基和超氧自由基 ）（27-29）。除了這些對(duì)氧化還原狀態(tài)的直接影響外，NRF2還調(diào)節(jié)編碼酶的基因，這些酶可阻止醌參與氧化還原循環(huán)反應(yīng)和谷胱甘肽耗竭（通過NAD(P)H:醌氧化還原酶1（NQO1））或參與間接生產(chǎn)膽紅素（血紅素加氧酶1（HMOX1）和膽綠素還原酶（BVR）），是最有效的非極性生理抗氧化劑（30）。最后，NRF2通過與戊糖磷酸途徑和糖酵解的相互作用，影響中間代謝，增加底物的可用性，減少線粒體呼吸鏈的等效物（31），并維持線粒體DNA （mtDNA）的完整性（32）。
NRF2在氧化還原改變或營(yíng)養(yǎng)缺乏期間參與清除氧化或其他損傷的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器。因此，自噬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白泛素結(jié)合蛋白p62(由SQSTM1編碼)是NRF2的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，它通過其泛素關(guān)聯(lián)域(UBA)與泛素化產(chǎn)物相互作用，并通過其LC3相互作用的基序?qū)⑵湔心嫉阶允审w中（33, 34）。此外，KEAP1與p62結(jié)合（33, 35），最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)KEAP1-CULLIN 3（CUL3）在其UBA結(jié)構(gòu)域中的K420位點(diǎn)泛素化p62，從而促進(jìn)p62的螯合活性（36）。在其一級(jí)結(jié)構(gòu)中，p62含有ETGE樣基序STGE，在被mTORC1磷酸化后產(chǎn)生識(shí)別位點(diǎn)與KEAP1對(duì)接（37）。然后，KEAP1被轉(zhuǎn)運(yùn)到自噬體降解，從而使NRF2積累（38）。此外，一些自噬基因似乎在其啟動(dòng)子區(qū)域含有序列，有報(bào)道稱NRF2同時(shí)激活伴侶介導(dǎo)的自噬（39）和巨自噬（40，41）。NRF2在氧化條件下在蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)中的其他作用通過未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)的激活（42,43）及其調(diào)節(jié)蛋白酶體亞基表達(dá)的能力來(lái)證明（44,45）。
至少在腦和血液中，編碼NRF2的mRNA豐度高于KEAP1的mRNA（圖2）；相反，KEAP1蛋白的半衰期比NRF2的半衰期長(zhǎng)（表2）。這些觀察結(jié)果強(qiáng)調(diào)了兩種蛋白質(zhì)的不同轉(zhuǎn)換率——KEAP1緩慢，NRF2快。此外，盡管NRF2和KEAP1普遍表達(dá)，但特定細(xì)胞類型主要負(fù)責(zé)穩(wěn)態(tài)適應(yīng)并呈現(xiàn)不同的表達(dá)水平（圖2）。因此，單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞在血細(xì)胞中表現(xiàn)出最高水平的NRF2，表明先天免疫系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)作用（見下文）。在大腦中，星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間的相互作用將中間代謝與氧化還原穩(wěn)態(tài)結(jié)合起來(lái)，至少部分通過NRF2實(shí)現(xiàn)（46）。此外，神經(jīng)元中的谷氨酸能神經(jīng)傳遞導(dǎo)致產(chǎn)生由神經(jīng)元GSH池控制的ROS。當(dāng)該池濃度較低時(shí)，鄰近的星形膠質(zhì)細(xì)胞通過向神經(jīng)元提供GSH前體甘氨酸、谷氨酸/谷氨酰胺和半胱氨酸來(lái)促進(jìn)其恢復(fù)（47）。毫不奇怪，星形膠質(zhì)細(xì)胞中NRF2水平很高（圖2）。此外，與神經(jīng)元相比，小膠質(zhì)細(xì)胞作為單核細(xì)胞譜系的一部分表達(dá)高水平的NRF2。
控制炎癥
NRF2在單核細(xì)胞和粒細(xì)胞中含量豐富(圖2)，提示NRF2參與了這些細(xì)胞類型驅(qū)動(dòng)的免疫應(yīng)答。敲除NRF2的小鼠對(duì)敗血癥休克高度敏感（48），并且在創(chuàng)傷愈合過程中表現(xiàn)為持續(xù)性炎癥（49, 50）。而NRF2的基因或藥理激活抑制了促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生（51 - 56）。在人類細(xì)胞中，KEAP1的破壞通過減弱髓系白細(xì)胞（57）和巨噬細(xì)胞（58）的炎癥反應(yīng)來(lái)預(yù)防敗血癥。特別有趣的是，NFE2L2中的一個(gè)多態(tài)性與轉(zhuǎn)錄活性降低相關(guān)，與炎癥性腸病(IBD)（59）和慢性胃炎（60）風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。如下所示，NRF2的強(qiáng)抗炎活性至少可歸因于三個(gè)獨(dú)立的機(jī)制：氧化還原代謝的調(diào)節(jié)；與核因子-κB(NF-κB)的相互作用；對(duì)促炎基因的直接調(diào)控。
炎癥與局部和全身病理水平的ROS積累增加有關(guān)，這可能損害氧化還原信號(hào)（61）。線粒體功能障礙和NADPH氧化酶不受控制的激活是炎癥細(xì)胞中ROS生成升高的主要因素，線粒體ROS引起mtDNA損傷和釋放，從而形成惡性循環(huán)，進(jìn)一步ROS的產(chǎn)生和炎性小體的激活，最終導(dǎo)致器官功能衰竭（62）。NRF2的氧化還原調(diào)節(jié)活性是阻止炎癥惡化和隨后組織損傷的惡性循環(huán)中的重要突破（63）。
NF-κB和NRF2相互作用。幾個(gè)NF-κB功能結(jié)合位點(diǎn)已確定在NFE2L2基因啟動(dòng)子區(qū)（64）。另一方面，NRF2抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。用脂多糖（LPS）或TNF處理NRF2缺陷小鼠增加了NF-κB轉(zhuǎn)錄的表達(dá)，表明NRF2對(duì)NF-κB的抑制作用（48）。該發(fā)現(xiàn)的可能解釋是NF-κB抑制劑（IκB）在NRF2缺陷細(xì)胞中高度磷酸化并且經(jīng)歷快速蛋白酶體降解，從而減少對(duì)NF-κB的抑制（48）。此外，LPS顯示同時(shí)激活NF-κB介導(dǎo)的快速反應(yīng)和NRF2介導(dǎo)的緩慢反應(yīng)，最初的促炎反應(yīng)由NF-κB驅(qū)動(dòng)，然后當(dāng)NRF2活性最大時(shí)隨后被抑制（65）。NRF2-KEAP1信號(hào)通路抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的其他機(jī)制包括NRF2和p65之間與p300競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合（66）和KEAP1對(duì)IκB激酶-β（IKKβ）的降解（67, 68）。
幾種巨噬細(xì)胞特異性基因含有ARE序列，因此受NRF2調(diào)節(jié)。這些包括MARCO（細(xì)菌吞噬作用所需的受體）和CD36（氧化低密度脂蛋白的清道夫受體）（69, 70）。 另一方面，NRF2以不依賴ARE的方式結(jié)合編碼IL-6和IL-1β促炎基因調(diào)節(jié)區(qū)，并阻止RNA聚合酶II開始轉(zhuǎn)錄募集（52）。
最近的研究表明巨噬細(xì)胞代謝與NRF2引起的抗炎反應(yīng)有關(guān)。線粒體代謝物亞甲基丁二酸是由三羧酸循環(huán)在促炎刺激下產(chǎn)生的，在巨噬細(xì)胞活化過程中會(huì)顯著增加（71, 72）。反過來(lái)，亞甲基丁二酸烷基化幾個(gè)KEAP1半胱氨酸傳感器，包括關(guān)鍵C151、C273和C288殘基，從而激活NRF2并抑制促炎細(xì)胞因子如IL-6和IL-1β的轉(zhuǎn)錄（71）。因此，亞甲基丁二酸是KEAP1的內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑，在炎癥的控制過程中起到“關(guān)閉開關(guān)”的作用。此外，通過細(xì)胞可滲透的亞甲基丁二酸衍生物4-octylitaconate或SFN激活NRF2，通過降低mRNA穩(wěn)定性來(lái)抑制干擾素基因(STING)的銜接子分子刺激物的表達(dá)，從而抑制I型干擾素(IFN)的產(chǎn)生（73，74）。
NRF2-KEAP1信號(hào)通路和非腫瘤性疾病
在細(xì)胞和動(dòng)物模型中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量關(guān)于NRF2對(duì)多種慢性疾病保護(hù)作用的信息，許多研究使用了NRF2敲除小鼠（75）。關(guān)于人類，最近的一項(xiàng)研究為使用系統(tǒng)醫(yī)學(xué)方法分析NRF2對(duì)抗慢性病奠定了基礎(chǔ)，并且基于NRF2與其他分子（NRF2相互作用組）的連通性以及經(jīng)驗(yàn)證據(jù)，建立了第一個(gè)NRF2相關(guān)疾病（NRF2病變）的圖譜（9）。NFE2L2的功能性遺傳變異與疾病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)研究不斷提供有關(guān)NRF2在確定人類對(duì)慢性病易感性中作用的令人信服的證據(jù)。此外，這些遺傳學(xué)研究支持這樣一種假設(shè)，即對(duì)于NFE2L2的某些功能變化，模仿NRF2表達(dá)的微小變化的藥物可能具有治療價(jià)值。下面，我們將簡(jiǎn)要描述NRF2參與人類慢性疾病的一些里程碑性的成果，并重點(diǎn)介紹現(xiàn)有的遺傳學(xué)證據(jù)。
自身免疫性疾病
氧化組織損傷和細(xì)胞凋亡導(dǎo)致半抗原或受損大分子的形成，增加了自身免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。由于NRF2調(diào)節(jié)的酶在許多化學(xué)物質(zhì)的解毒中起著關(guān)鍵作用，因此它提供了一種保護(hù)機(jī)制，防止對(duì)自身免疫發(fā)病機(jī)制的環(huán)境易感性（79）。此外，NRF2抑制促炎T輔助細(xì)胞1（TH1）和TH17細(xì)胞反應(yīng)并激活免疫抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和TH2細(xì)胞（80）。NRF2在自身免疫中的相關(guān)性已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）中進(jìn)行了廣泛研究，其是MS的小鼠模型，MS是一種慢性炎性疾病，其特征在于自身反應(yīng)性免疫細(xì)胞浸潤(rùn)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。在EAE小鼠模型中，NRF2的缺乏加劇了疾?。?1），而KEAP1的敲低（52）或用一系列NRF2激活劑（包括氰基三萜類化合物和SFN）（82,83）治療減弱了其嚴(yán)重性。在人類中，通過IFNβ治療患者基因表達(dá)譜確定NRF2是長(zhǎng)期抗氧化反應(yīng)和神經(jīng)元保護(hù)的潛在介質(zhì)（84）。如下所述，一些生物制藥公司正在利用強(qiáng)有力的證據(jù)表明NRF2的活化在MS中具有治療價(jià)值。事實(shí)上，迄今為止唯一獲得美國(guó)食品藥品管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）DMF批準(zhǔn)的NRF2激活劑正在由Biogen銷售，用于治療緩解復(fù)發(fā)型MS和銀屑?。?5）。NRF2的保護(hù)作用已被建議用于其他自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（86, 87）、干燥綜合征（86）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（88, 89）、白癜風(fēng)（90-92）和STING依賴性干擾素?。?4）。
呼吸系統(tǒng)疾病
肺通過釋放促炎細(xì)胞因子和趨化因子對(duì)包括煙霧在內(nèi)的各種環(huán)境毒物作出反應(yīng)。這一主要效應(yīng)通過循環(huán)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞的募集產(chǎn)生漸進(jìn)的低度炎癥反應(yīng)，這些細(xì)胞釋放額外的炎癥介質(zhì)、ROS和金屬蛋白酶。最終結(jié)果是肺實(shí)質(zhì)受損的惡性循環(huán)，導(dǎo)致慢性阻塞性肺?。–OPD）或肺氣腫（93）。NRF2減輕由ROS和炎癥引起的肺實(shí)質(zhì)負(fù)擔(dān)。香煙煙霧是COPD和肺氣腫發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素。
NFE2L2-/-小鼠對(duì)香煙煙霧引起的肺氣腫的發(fā)展比野生型更敏感（94）。此外，長(zhǎng)期暴露于香煙煙霧后肺氣腫的發(fā)展與細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)下降有關(guān)（95），而五環(huán)氰基酮CDDO-咪唑啉保護(hù)NFE2L2+/+小鼠對(duì)抗香煙煙霧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、肺泡細(xì)胞凋亡、肺泡破壞和肺動(dòng)脈高壓，而不是NFE2L2-/-小鼠（96）。NRF2的遺傳上調(diào)（通過Clara細(xì)胞中的Keap1缺失，其在鼠上呼吸道中是豐富的）具有類似的保護(hù)作用（97）。
在人類中，與沒有肺氣腫的患者相比，吸煙相關(guān)肺氣腫患者的肺泡巨噬細(xì)胞中NRF2轉(zhuǎn)錄信號(hào)降低（98）。人類NFE2L2基因啟動(dòng)子包含一個(gè)含有三個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)序列的單倍型和一個(gè)調(diào)控NRF2表達(dá)的三重重復(fù)多態(tài)性。具有低至中等啟動(dòng)子活性的COPD患者更容易發(fā)生呼吸衰竭（99）。SFN對(duì)NRF2的藥理學(xué)激活，或一種干擾KEAP1與NRF2相互作用的化合物，逆轉(zhuǎn)培養(yǎng)肺泡巨噬細(xì)胞和從COPD患者中分離的單核細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞受損的細(xì)菌吞噬作用（70,100）。然而，每日口服一定劑量SFN(西蘭花芽苗提取物)的慢性阻塞性肺病患者并沒有導(dǎo)致NRF2依賴性基因表達(dá)或肺泡巨噬細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞炎癥標(biāo)志物的一致性變化（101），說明將細(xì)胞培養(yǎng)研究結(jié)果轉(zhuǎn)化為人類結(jié)果的一些挑戰(zhàn)。其他慢性肺病，如特發(fā)性肺纖維化、慢性結(jié)節(jié)病和過敏性肺炎，被發(fā)現(xiàn)在支氣管肺泡灌洗液中表現(xiàn)出NRF2表達(dá)增加和內(nèi)源性抗氧化劑水平增加，表明對(duì)病理性ROS水平的適應(yīng)性反應(yīng)不成功（102）。
胃腸疾病
胃腸道經(jīng)常受到外來(lái)生物的挑戰(zhàn)，這可能導(dǎo)致形成病理水平的ROS，并可能引發(fā)IBD（103）。胃腸道也是膳食及其合成類似物在藥理學(xué)上激活NRF2的重要部位之一（23, 104-106）。在小鼠中，右旋糖酐硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎在NRF2缺陷小鼠中引起的IBD要比野生型小鼠嚴(yán)重（107）。在人類中，NRF2在腸細(xì)胞對(duì)炎癥應(yīng)激適應(yīng)的相關(guān)性在IBD患者的一項(xiàng)全面轉(zhuǎn)錄組研究中得到證實(shí)，證明了NRF2在減弱腸道巨噬細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中的作用（108）。重要的是，在一組日本患者中發(fā)現(xiàn)了NFE2L2基因中特定SNP與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的遺傳關(guān)聯(lián)（109）。NFE2L2啟動(dòng)子中3個(gè)SNP功能單倍體NRF2表達(dá)略有降低，與胃黏膜炎癥和幽門螺桿菌感染相關(guān)消化性潰瘍的發(fā)生發(fā)展有關(guān)（60）。
肝臟是抵御食物、外來(lái)生物制劑和口服活性藥物的第一道防線，因?yàn)閺南懒鞒龅拇蟛糠盅和ㄟ^肝門靜脈直接流到肝臟。早期使用NFE2L2-/-小鼠證實(shí)了NRF2對(duì)對(duì)乙酰氨基酚的保肝作用（110），NRF2的遺傳活化也是如此（111）。正如可能預(yù)期的那樣，喂食酒精（4-7天）的NFE2L2-/-小鼠比同樣喂養(yǎng)的野生型小鼠明顯更容易脂肪肝加重、肝臟炎癥反應(yīng)和肝功能衰竭，這在一定程度上可能是SREBP脂源性轉(zhuǎn)錄因子的激活和對(duì)乙醛解毒的相對(duì)無(wú)能（112）。通過觀察NRF2在小鼠肝部分切除后對(duì)肝臟再生的阻礙，發(fā)現(xiàn)NRF2調(diào)控NOTCH1基因表達(dá)（113），這一機(jī)制也參與了NRF2介導(dǎo)的造血干細(xì)胞祖細(xì)胞功能改善和電離輻射后骨髓抑制（114）。在遺傳性血色素沉著癥伴鐵超載的小鼠模型中(由于穩(wěn)態(tài)鐵調(diào)節(jié)基因突變)，敲除NRF2增加了小鼠肝臟內(nèi)導(dǎo)致肝纖維化的壞死炎癥病變（115）。與這些觀察結(jié)果一致，原發(fā)性膽管炎和肝硬化患者NRF2表達(dá)減少（116。）
代謝性疾病
代謝性疾病又稱代謝綜合征，以腹部肥胖、高血壓、高甘油三酯血癥、低水平高密度脂蛋白和空腹高血糖為特征。它與2型糖尿?。═2DM）和相關(guān)的合并癥如血管功能障礙、心血管疾病、腎小球腎炎、非酒精性脂肪性肝炎（NASH;見下文）和認(rèn)知障礙密切相關(guān)。盡管T2DM及其合并癥的特征在于線粒體產(chǎn)生過量超氧化物（117），但NRF2缺失小鼠不會(huì)自發(fā)地發(fā)展成糖尿病。實(shí)際上，敲除小鼠表現(xiàn)出增加的胰島素敏感性，這歸因于ROS介導(dǎo)的蛋白酪氨酸激酶磷酸酶1B的抑制，該蛋白拮抗胰島素信號(hào)（118）。相比之下，db/db背景下小鼠中KEAP1敲除或敲低對(duì)NRF2的遺傳激活，或db/db小鼠中NRF2的藥理活化，抑制了T2DM的發(fā)生（119）。因此，似乎當(dāng)胰腺β細(xì)胞代謝挑戰(zhàn)合成胰島素以應(yīng)對(duì)高血糖時(shí)，所產(chǎn)生的ROS負(fù)擔(dān)可能會(huì)導(dǎo)致氧化損傷、損害反應(yīng)、導(dǎo)致T2DM（120,121）。如果這個(gè)結(jié)論是正確的，那么很可能在飲食誘導(dǎo)的T2DM小鼠中，TBE-31或SFN激活NRF2后，胰腺功能的改善對(duì)葡萄糖處理的改善有顯著的作用（122,123）以及富含SFN西蘭花芽提取物對(duì)T2DM失調(diào)肥胖患者空腹血糖和糖化血紅蛋白(HbA1c)的降低作用（123）。除了增加對(duì)胰腺β細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力之外，NRF2活化可通過增加糖原分支酶和磷酸化酶b激酶α的表達(dá)來(lái)抑制骨骼肌中的糖原分解，從而有助于改善全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)（119）。在糖尿病腎病小鼠模型中，SFN或肉桂醛對(duì)NRF2的藥理激活已被證明可抑制氧化應(yīng)激以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1信號(hào)傳導(dǎo)和纖維化（124）。
NRF2可能在胰島素抵抗中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因?yàn)樗谔悄虿』颊叩膯魏思?xì)胞中表達(dá)很低（125）。令人信服的證據(jù)來(lái)自遺傳關(guān)聯(lián)研究，表明導(dǎo)致低NRF2表達(dá)的一些NFE2L2多態(tài)性導(dǎo)致病理性ROS和T2DM的風(fēng)險(xiǎn)增加（126-128）。關(guān)于并發(fā)癥，由于KEAP1啟動(dòng)子中CpG島的去甲基化導(dǎo)致的抗氧化保護(hù)失效與糖尿病白內(nèi)障有關(guān)（129）。
NRF2也可能對(duì)NASH的發(fā)展具有保護(hù)作用。在使用缺乏蛋氨酸和膽堿飲食的NASH小鼠模型中，NRF2缺失小鼠比野生型小鼠死于該疾病的速度要快得多（130,131）。在更為生理的NASH模型中，喂食高脂肪飲食的NRF2缺失小鼠也會(huì)出現(xiàn)肝臟脂肪變性和炎癥惡化，這表明需要NRF2來(lái)抑制這些癥狀的發(fā)生（118, 132）。此外，野生型而非NRF2敲除小鼠，在長(zhǎng)期高脂肪、高果糖飲食使其變得肥胖和胰島素抵抗后，通過三環(huán)氰基酮TBE-31對(duì)NRF2藥理激活后，逆轉(zhuǎn)了胰島素抵抗，抑制肝臟脂肪變性，改善NASH和肝纖維化（122）。TBE-31對(duì)NRF2的藥理激活拮抗SREBP1c和ChREBP及其脂質(zhì)生物合成靶基因的表達(dá)，這可能涉及AMPK的激活（122, 133）。此外，在小鼠肝臟中，NRF2的基因激活可拮抗糖異生酶PEPCK和G6PC的表達(dá)，這可能也涉及AMPK（133）。在NASH患者的肝臟活檢標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)病理性ROS水平升高、NRF2基因表達(dá)增加，提示其試圖減輕氧化和炎癥（134）。
心血管疾病
ROS的產(chǎn)生和處理之間的不平衡導(dǎo)致破壞性氧化物質(zhì)的過度形成，已被認(rèn)為在許多心血管疾病中發(fā)揮作用，如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病血管疾病、心肌缺血再灌注損傷和心力衰竭（135）。此外，血管壁內(nèi)的低度持續(xù)性炎癥是動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的形成過程和發(fā)展特點(diǎn)，所以動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易破裂，進(jìn)而導(dǎo)致血栓形成和終末器官缺血。鑒于NRF2是抗氧化防御的關(guān)鍵調(diào)控因子，且具有直接的抗炎特性，因此可以合理地假設(shè)NRF2可以預(yù)防與ROS相關(guān)的心血管疾病。事實(shí)上，包括富馬酸鹽和硫化氫在內(nèi)的NRF2激活劑在許多心血管疾病動(dòng)物模型中顯示出了保護(hù)作用，如心臟缺血再灌注損傷（136, 137）和心力衰竭（138, 139）。NRF2在高膽固醇血癥小鼠模型動(dòng)脈粥樣硬化中的作用就不那么直接了：在骨髓來(lái)源細(xì)胞中NRF2的缺失加重了動(dòng)脈粥樣硬化（140, 141），而根據(jù)病變發(fā)展程度評(píng)估的NRF2全面缺失減輕了動(dòng)脈粥樣硬化（142-145），但增加了斑塊炎癥和易損性（145）。然而，一些NRF2激活劑已被證明在多種動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型中具有動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)作用（146-148）。由收縮性、細(xì)胞骨架蛋白和分子伴侶蛋白突變引起的心臟疾病約占遺傳性心肌疾病的30%（149）。在某些情況下，還原而不是氧化應(yīng)激，再加上蛋白質(zhì)聚集，與心肌病有關(guān)。血液透析患者全身炎癥和病理ROS的形成與NRF2的下調(diào)有關(guān)（150），位于NFE2L2啟動(dòng)子的多態(tài)性與這些患者死亡率的增加有關(guān)（151）。NRF2信號(hào)通路的破壞可防止還原性應(yīng)激并延緩過量表達(dá)心臟中CRYAB（α-結(jié)晶B鏈）小鼠蛋白質(zhì)性心臟?。?52）。因此，正如這篇綜述所強(qiáng)調(diào)的，針對(duì)NRF2的環(huán)境非常重要——越多不一定越好。
神經(jīng)退行性疾病
在各種形式的神經(jīng)退行性疾病中，NRF2和蛋白穩(wěn)定之間的聯(lián)系尤其密切，因?yàn)檫@些疾病的特點(diǎn)是蛋白異常聚集（43）。NRF2在蛋白質(zhì)病中具有保護(hù)作用的令人信服的證據(jù)已經(jīng)在阿爾茨海默病（AD）模型的淀粉樣病變（153,154）、tau病變（155）或兩者皆有（40, 156, 157）以及帕金森病（PD）模型的α-突觸核蛋白病變（158-160）中得到證實(shí)。在人類，APP受損和tau損傷神經(jīng)元NRF2及其靶蛋白p62 / SQSTM1表達(dá)增加（40,161）。這些發(fā)現(xiàn)與最近報(bào)道的NRF2上調(diào)巨自噬（40）和分子伴侶介導(dǎo)自噬（39）的基因表達(dá)作用是一致的，這是清除APP、tau和α-突觸核蛋白的兩種必要機(jī)制。NRF2上調(diào)保護(hù)神經(jīng)元免受突變型α-突觸核蛋白和leucinerich重復(fù)激酶2（LRRK2）的毒性（162），LRRK2也導(dǎo)致與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的神經(jīng)變性（163）。奇怪的是，盡管NRF2激活增加了α-突觸核蛋白的降解，但錯(cuò)誤折疊的彌漫性LRRK2被隔離到包涵體中。
NRF2在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中的作用尤其重要，因?yàn)樗鼈冊(cè)诖竽X中表達(dá)水平最高(圖2b)。通過使用帶有ARE驅(qū)動(dòng)的堿性磷酸酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，我們發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞在幾種神經(jīng)變性模型中對(duì)NRF2的激活反應(yīng)高度敏感（164），這表明NRF2通過對(duì)即將死亡的神經(jīng)元提供代謝和GSH前體而在星形膠質(zhì)細(xì)胞的培育作用中具有相關(guān)性（46, 165）。小膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦的免疫應(yīng)答細(xì)胞，在NRF2介導(dǎo)的應(yīng)答中也起著至關(guān)重要的作用（166, 167）。在帕金森毒素甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶致小鼠PD模型中，NRF2可調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)，從而降低COX2、NOS2、IL-6和TNF的生成，并增加多種抗炎標(biāo)志物的水平（55, 168）。tau損傷神經(jīng)元激活小膠質(zhì)細(xì)胞似乎至少部分地通過與分形趨化因子相互作用有關(guān)。在小鼠和人類，tau損傷神經(jīng)元釋放出分形趨化因子，抑制鄰近的小膠質(zhì)細(xì)胞中GSK3并導(dǎo)致NRF2蛋白的增加。反過來(lái)，NRF2減少TNF和IL-6的釋放，并參與小膠質(zhì)細(xì)胞的重編程，以達(dá)到愈合傷口（161）。
一些NRF2靶基因，包括HMOX1、NQO1、GCLM和SQSTM1，在AD和PD腦中上調(diào)（159,169-171）。通過對(duì)NFE2L2啟動(dòng)子中3個(gè)SNP的功能單倍型與疾病風(fēng)險(xiǎn)之間關(guān)系的遺傳分析，證明了這種上調(diào)的相關(guān)性。在肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)中，一種保護(hù)性的單倍體等位基因與疾病發(fā)作延遲4年有關(guān)（172），但另一項(xiàng)研究沒有發(fā)現(xiàn)明顯的關(guān)聯(lián)（173）。在AD中，另一個(gè)單倍型變異與早2年發(fā)病有關(guān)（76）。已經(jīng)報(bào)道了PD的更詳細(xì)證據(jù)。最初，保護(hù)性單倍型與瑞典隊(duì)列中疾病發(fā)作延遲相關(guān)，并且波蘭隊(duì)列PD患者的風(fēng)險(xiǎn)降低（77）。之后，這些研究結(jié)果在四個(gè)獨(dú)立的歐洲病例對(duì)照研究中得到了重復(fù)（174），但臺(tái)灣人口卻沒有（175），這表明存在種族和/或環(huán)境差異。NRF2的藥理激活也有望用于治療亨廷頓病(Huntington disease, HD)和弗里德雷希共濟(jì)失調(diào)(Friedreich ataxia, FRDA)，對(duì)于這兩種疾病來(lái)說，氧化應(yīng)激和炎癥是重要的病理驅(qū)動(dòng)因素。在小鼠、來(lái)自HD和FRDA患者的模型生物體和培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行的研究報(bào)告了NRF2信號(hào)通路受損（53,176 - 178）以及藥理學(xué)NRF2激活劑的有益作用。因此，三唑衍生物對(duì)NRF2的激活抑制了HD原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞以及來(lái)自HD患者的培養(yǎng)單核細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的釋放（53），并且在離體HD大鼠皮質(zhì)紋狀體腦切片和HD果蠅模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用（179）。在HD、DMF和三萜類化合物的小鼠模型中，CDDO-乙基酰胺和CDDO-三氟乙基酰胺改善了動(dòng)物的腦病理和行為（180,181）。用SFN和環(huán)狀氰基酮TBE-31或RTA-408處理改善了FRDA小鼠模型成纖維細(xì)胞、小腦顆粒神經(jīng)元以及FRDA患者成纖維細(xì)胞的線粒體功能和抗氧化能力（182,183）?？偠灾?，現(xiàn)有證據(jù)表明NRF2的適度激活對(duì)大腦具有神經(jīng)保護(hù)作用。
NRF2-KEAP1信號(hào)通路和癌癥
據(jù)報(bào)道，NRF2具有抗腫瘤和促腫瘤作用。在這里，我們簡(jiǎn)要總結(jié)了目前對(duì)NRF2在癌癥中作用的理解，并參考了最近在癌癥背景下討論NRF2的全面綜述（12）。
在非惡性細(xì)胞中，NRF2激活對(duì)氧化劑誘導(dǎo)的遺傳損傷以及化學(xué)和物理致癌物具有抵抗性，這是由于NRF2激活增強(qiáng)了機(jī)體的防御能力，包括抗氧化（184）、放射性保護(hù)（114）以及加速DNA損傷劑的生物轉(zhuǎn)化和清除（185）。此外，NRF2轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的激活似乎將ROS水平維持在低于對(duì)腫瘤發(fā)生關(guān)鍵蛋白質(zhì)發(fā)送信號(hào)所必需的水平，例如磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶（PI3K）、絲裂原活化激酶、缺氧誘導(dǎo)因子1和NF-κB（186）。
相反，在腫瘤發(fā)展的早期階段，選擇具有NRF2組成型激活的癌細(xì)胞作為能夠適應(yīng)惡劣微環(huán)境、化療、放療或高內(nèi)源ROS水平的方式。此外，在快速增殖的細(xì)胞中，NRF2通過增強(qiáng)核苷酸（26）和氨基酸（187）的生物合成來(lái)支持中間代謝，但也會(huì)產(chǎn)生代謝失衡和對(duì)谷氨酰胺酶的依賴，這可能用于治療（188,189）。
KEAP1的體細(xì)胞功能缺失突變或NFE2L2的功能獲得突變?cè)诜切〖?xì)胞肺癌和其他一些環(huán)境因素是重要病因的癌癥中很常見（190）。癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中的NRF2突變綜合目錄在10364例中識(shí)別出226個(gè)獨(dú)特的NRF2突變腫瘤，其中33種腫瘤類型中有21種發(fā)生了功能獲得性NRF2突變（191）。這種突變的頻繁發(fā)生表明NRF2抑制劑在癌癥治療中的潛在益處，從而引發(fā)對(duì)此類藥物的研究(Box 1)。這些NRF2抑制劑代表了藥理學(xué)的一個(gè)完全開放的領(lǐng)域，目前處于概念驗(yàn)證研究的水平。NRF2抑制的替代方法包括靶向依賴NRF2和/或在KEAP1突變癌細(xì)胞中選擇性表達(dá)的蛋白。例如谷氨酰胺酶（188, 189）和NR0B1的抑制劑，NR0B1是一種非典型的孤兒核受體，在多聚體蛋白復(fù)合物中調(diào)節(jié)KEAP1突變細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄（192）。然而，值得注意的是，目前尚無(wú)證據(jù)表明單單KEAP1或NFE2L2突變能夠引發(fā)惡性轉(zhuǎn)化，與致癌驅(qū)動(dòng)因子共發(fā)生似乎是必要的，PI3K通路改變與惡性轉(zhuǎn)化的相關(guān)性最強(qiáng)（193）。
最能說明問題的是，KEAP1亞等位基因敲低的NRF2全基因組上調(diào)小鼠不會(huì)自發(fā)形成腫瘤（194, 195），而小鼠肺中同時(shí)缺失Keap1和PTEN則會(huì)促進(jìn)腺癌的形成（195）。重要的是，由此產(chǎn)生的腫瘤具有免疫抑制微環(huán)境的特征，可通過免疫檢查點(diǎn)抑制劑進(jìn)行治療（195）。很明顯，NRF2基因激活是腫瘤發(fā)生的重要因素，因?yàn)榘┗?KRASG12D)激活嚙齒動(dòng)物NRF2信號(hào)可以增加腫瘤發(fā)展（196）,而KEAP1基因敲低(也導(dǎo)致NRF2信號(hào)激活)強(qiáng)烈阻礙NOTCH1驅(qū)動(dòng)的腫瘤發(fā)生（197）以及紫外線輻射介導(dǎo)的皮膚癌發(fā)生（51, 198）。值得注意的是，在后一種模型中，同時(shí)喪失NRF2可以消除KEAP1敲低對(duì)皮膚癌發(fā)生的保護(hù)作用（199）。 NRF2的這種兩面作用得到廣泛的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持，在這些實(shí)驗(yàn)證據(jù)中，NRF2的激活增強(qiáng)了抗腫瘤免疫，以防止肺癌的發(fā)生，但只有在腫瘤發(fā)生后才會(huì)加速惡性生長(zhǎng)（200）。此外，與野生型同窩小鼠相比，接受化學(xué)誘導(dǎo)致癌作用的NFE2L2敲除小鼠表現(xiàn)出腫瘤數(shù)量增加（啟動(dòng)增強(qiáng)）但體積小得多（進(jìn)展受損）（201）。因此，低NRF2活性促進(jìn)癌發(fā)生的起始，而持久的組成型高NRF2活性可以驅(qū)動(dòng)癌癥進(jìn)展和對(duì)治療的抗性（202）。
NRF2調(diào)節(jié)劑的臨床開發(fā)
富馬酸酯。富馬酸酯代表一組NRF2激活劑，工業(yè)上對(duì)此進(jìn)行了大量的研究。臨床最成功的例子是DMF（化合物1，圖3a），它于1994年被批準(zhǔn)用于治療銀屑病，并且基于其在MS的EAE小鼠模型中的功效（203），于2014年被Biogen（Tecfidera）重新用于治療復(fù)發(fā)-緩解型MS。在發(fā)現(xiàn)NRF2之前，對(duì)嚙齒動(dòng)物的早期研究報(bào)道DMF是NRF2轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)GST和NQO1的強(qiáng)效誘導(dǎo)劑（204），后來(lái)發(fā)現(xiàn)DMF代謝物富馬酸單甲酯(MMF;化合物2，圖3a)與KEAP1中的C151反應(yīng)，激活NRF2（203）。自從發(fā)現(xiàn)DMF的誘導(dǎo)劑活性以來(lái)，安全性一直是一個(gè)優(yōu)先考慮的問題，并注意到獲得顯著酶誘導(dǎo)劑所需DMF濃度對(duì)嚙齒動(dòng)物具有良好的耐受性（204）。DMF在兩個(gè)III期試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的安全性和耐受性（205, 206），自其商業(yè)化以來(lái)，它已成為近年來(lái)最成功的新藥之一。然而，Tecfidera的一個(gè)缺點(diǎn)是出現(xiàn)輕度至中度腹痛、潮紅、腹瀉和惡心。盡管可以控制這些不良反應(yīng)，但是更嚴(yán)重的癥狀是在治療開始時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)低的患者發(fā)生白細(xì)胞減少癥。事實(shí)上，用DMF治療的動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中粒細(xì)胞的水平遠(yuǎn)低于未接受該藥物治療的動(dòng)物（207）。該作用與NRF2無(wú)關(guān)，但很可能是由于羥基羧酸受體的活化，因?yàn)槿狈υ摰鞍踪|(zhì)的小鼠具有高水平的粒細(xì)胞，無(wú)論它們是否用DMF處理（207）。這些觀察結(jié)果強(qiáng)調(diào)了仔細(xì)選擇治療納入標(biāo)準(zhǔn)的重要性。
如上所述，DMF在體內(nèi)代謝為MMF，通過在C151處形成加合物使KEAP1失活（203）。由于這種代謝轉(zhuǎn)化，一些生物制藥公司正在開發(fā)具有緩慢和持續(xù)釋放MMF的化合物，與DMF相比，其顯示出改善的生物利用度和更少的副作用（表1）。Alkermes（被Biogen收購(gòu)）開發(fā)了富馬酸迪羅西酯（BIIB098，以前為ALK8700，化合物3;圖3a），一種具有降低GI副作用的MMF前藥，現(xiàn)在正在進(jìn)行MS的III期臨床試驗(yàn)（NCT03093324）。 XenoPort（由Arbor Pharmaceuticals收購(gòu)）開發(fā)了富馬酸富馬酰胺，一種MMF前藥（XP23829，化合物4，圖3a）。與DMF相比，XP23829在臨床前模型中具有更高的溶解度和滲透性，口服給藥后更大的吸收，改善功效和降低GI副作用，并且現(xiàn)在處于斑塊狀銀屑病的II期臨床試驗(yàn)中（NCT02173301）。Catabasis制藥公司正在開發(fā)另一種MMF和二十二碳六烯酸(CAT4001)的化學(xué)連接偶聯(lián)物，與單獨(dú)的生物活性分子相比，這種偶聯(lián)物具有增強(qiáng)細(xì)胞靶向性、有效性、安全性和耐受性的潛力。特定的酶釋放細(xì)胞內(nèi)的兩個(gè)組件，同時(shí)調(diào)整多個(gè)生物目標(biāo)，包括細(xì)胞和動(dòng)物模型中的NRF2和NF-κB, 并顯示出治療神經(jīng)退行性疾?。ㄈ鏔RDA和ALS）的前景。V ClinBio正在開發(fā)一種類似的技術(shù)，用于治療MS和銀屑病的MMF和二十碳五烯酸（VCB101，化合物5，圖3a和VCB102）的結(jié)合物（表1）。
蘿卜硫素（SFN）。SFN一種廣泛應(yīng)用的天然親電NRF2激活劑 (化合物6，圖3a)。該化合物最初由Paul Talalay和Yuesheng Zhang作為十字花科植物提取物NRF2靶酶NQO1的主要誘導(dǎo)物分離得到的（208），并與KEAP1的C151相互作用(14，209)。值得注意的是，SFN可通過血腦屏障（55），并在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床前模型中具有保護(hù)作用（210）。在一項(xiàng)針對(duì)患有自閉癥譜系障礙年輕男性的雙盲安慰劑對(duì)照臨床試驗(yàn)中，口服富含SFN的西蘭花芽提取物膠囊，通過異常行為檢查表和社會(huì)反應(yīng)量表評(píng)估，在行為方面改善顯著；這些量表上的總分?jǐn)?shù)在停止治療后逆轉(zhuǎn)至治療前水平（211）。三日齡的西蘭花芽富含葡萄糖苷，一種SFN前體分子，可被植物黑芥子酶水解，釋放出SFN和葡萄糖（212）。類似的β-硫葡糖苷酶存在于腸道微生物群中；因此，釋放的SFN實(shí)際水平高度依賴于飲食習(xí)慣和微生物組成，受抗生素治療的影響（213）并表現(xiàn)出晝夜節(jié)律（214）。并且，無(wú)論是芽苗提取物還是高度純化的SFN，已有超過500名受試者接受超過25,000劑量，證明了具有高度安全性。目前有超過20個(gè)正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)。
考慮到天然化合物知識(shí)產(chǎn)權(quán)的相關(guān)問題、SFN在室溫下不穩(wěn)定以及需要精確控制劑量，Evgen Pharma開發(fā)了SFN的藥物形式，SFX-01（化合物7，圖3a） 。 SFX-01是化學(xué)合成的SFN，包裹在環(huán)糊精中，形成穩(wěn)定的固體形式的丸劑或膠囊，具有良好的生物利用度。SFX-01目前正在用于蛛網(wǎng)膜下腔出血(NCT02614742)和轉(zhuǎn)移性乳腺癌(NCT02970682)臨床試驗(yàn)(表1)。Evgen還有一系列基于SFN的新型類似物，這些類似物正處于臨床前評(píng)估階段。此外，許多營(yíng)養(yǎng)保健品公司正在生產(chǎn)含有NRF2誘導(dǎo)劑的制劑，包括SFN，具有不同程度的標(biāo)準(zhǔn)化。其中一個(gè)例子是來(lái)自Nutrinov實(shí)驗(yàn)室的Prostaphane，它是一種穩(wěn)定的游離SFN，從花椰菜種子中提取，在前列腺癌的安慰劑對(duì)照臨床試驗(yàn)中顯示了在根治性前列腺切除術(shù)后控制生化復(fù)發(fā)的優(yōu)勢(shì)（215）。SFX-01和Prostaphane的生物利用度和效力等同于穩(wěn)定性較差的SFN（216）。另一個(gè)例子是膠囊膳食補(bǔ)充劑Avmacol（Nutramax Laboratories），含有來(lái)自精細(xì)研磨的花椰菜種子的蘿卜硫苷和冷凍干燥的西蘭花芽粉末以提供黑芥子酶。該補(bǔ)充劑目前正在臨床試驗(yàn)中用于調(diào)節(jié)與自閉癥譜系障礙、精神分裂癥和環(huán)境污染有關(guān)的疾病癥狀和/或生物標(biāo)志物（217）。
氰基酮三萜。越來(lái)越多的證據(jù)表明，富馬酸酯、SFN以及與KEAP1共價(jià)結(jié)合的其他小親電試劑可以從更大的支架結(jié)構(gòu)中受益，以賦予更好的選擇性（和可能的效力）和更可控的藥代動(dòng)力學(xué)和/或藥效學(xué)特性。含五環(huán)邁克爾受體的氰基酮三萜類化合物的開發(fā)可滿足這些要求。這些五環(huán)三萜類化合物最初由Michael Sporn、Gordon Gribble和Tadashi Honda開發(fā)，來(lái)自天然產(chǎn)物齊墩果酸（218, 219），這些五環(huán)三萜類化合物是迄今已知最有效的親電子NRF2激活劑（220），由KEAP1中的C151檢測(cè)，目前正在由Reata Pharmaceuticals和Kyowa Hakko Kirin進(jìn)行臨床開發(fā)。
兩種臨床上先進(jìn)的化合物，bardoxolone methyl（BARD;化合物8，圖3a）和omaveloxolone（化合物9），能使代謝正?；⒃黾泳€粒體能量產(chǎn)生、增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力和降低ROS水平（221）（表1）。在臨床前研究中，BARD或類似物已被證明可通過減少炎癥、纖維化和氧化應(yīng)激以及增加腎小球的過濾表面積來(lái)改善腎功能（222, 223）。通過修改選擇標(biāo)準(zhǔn)以排除有早期心力衰竭跡象的患者（B型利鈉肽升高），BARD目前正在臨床試驗(yàn)中測(cè)試幾種與慢性腎?。–KD）相關(guān)的罕見病癥，大多數(shù)沒有經(jīng)批準(zhǔn)的治療方法，包括Alport綜合征（NCT03019185）、常染色體顯性遺傳性多囊腎病、免疫球蛋白A（IgA）腎病、1型糖尿病和局灶性節(jié)段性腎小球硬化（NCT03366337），其中促炎和促纖維化過程造成腎小球硬化和腎功能受損（224）。BARD治療有可能延緩或預(yù)防腎小球?yàn)V過率下降，而腎小球?yàn)V過率下降會(huì)導(dǎo)致Alport綜合征和其他罕見形式CKD患者需要透析或移植。因此，在患有T2DM和CKD患者的II期臨床試驗(yàn)中（NCT02316821），BARD治療可使直接測(cè)量腎小球?yàn)V過率的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著增加，并且在排除具有液體潴留風(fēng)險(xiǎn)患者后，耐受性良好。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，Kyowa Hakko Kirin在患有G3期或G4期CKD的糖尿病患者中，在日本SAKIGAKE指定系統(tǒng)的支持下，開展了III期臨床試驗(yàn)（NCT03550443）。
此外，BARD正在用于研究肺動(dòng)脈高壓（PAH）（NCT03068130）和結(jié)締組織?。–TD-PAH）引起的PAH（NCT02657356），這是一種導(dǎo)致心力衰竭和死亡的嚴(yán)重和進(jìn)行性疾病。CTD-PAH與特發(fā)性病因之間的差異很大程度上歸因于炎癥、自身免疫和系統(tǒng)性血管病變之間復(fù)雜的相互作用，這些相互作用促成了結(jié)締組織疾病的發(fā)病機(jī)制。由于NF-κB的上調(diào)，CTD-PAH患者的炎癥加重（225），對(duì)現(xiàn)有血管擴(kuò)張劑治療的反應(yīng)性低于特發(fā)性PAH患者，預(yù)后較差（226）。在II期研究中，對(duì)CTD-PAH患者進(jìn)行了BARD測(cè)試，目前正在III期研究中進(jìn)行測(cè)試。Omaveloxolone目前正在FRDA患者（NCT02255435）的II期臨床試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試，這是一種遺傳性神經(jīng)肌肉疾病，其NRF2被下調(diào)（176-178）。值得注意的是，目前尚無(wú)批準(zhǔn)治療FRDA的療法（227）（表1）。
硝基脂肪酸。脂肪酸的硝化衍生物(NO2-FAs)是內(nèi)源性信號(hào)介質(zhì)，在代謝和炎癥疾病的臨床前動(dòng)物模型中具有抗炎和抗纖維化活性（228）。硝基烯烴基團(tuán)賦予其β-碳親電性，促進(jìn)與親核試劑如半胱氨酸的可逆NO2-FA邁克爾加合物的快速形成，這種改性稱為硝基烷基化（22, 230）。已經(jīng)表明，硝基油酸（NO2-OA; 9-硝基十八碳-9-烯酸）與KEAP1中的半胱氨酸反應(yīng)，包括C273和C288，從而激活NRF2（231,232）。該反應(yīng)的可逆性阻止了穩(wěn)定的NO2-FA硫醇加合物積累的可能性，這可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性（219,230,233）。實(shí)際上，I期安全性評(píng)估證明了先導(dǎo)化合物CXA10（10-NO2-OA; 10-硝基-十八碳-9-烯酸，NO2-OA的特異性區(qū)域異構(gòu)體）（化合物10，圖3a）在藥理活性劑量下對(duì)人體是安全的（234）。目前，Complexa正在開發(fā)CXA10作為局灶性節(jié)段性腎小球硬化和PAH的治療方法（234）（表1）。最近報(bào)道了來(lái)自α-生育酚的硝基烯烴合成和生物學(xué)評(píng)價(jià)（235）。
羥胺。一個(gè)特殊的挑戰(zhàn)是提供可以通過血腦屏障的NRF2激活劑。給藥途徑（注射、口服或局部）對(duì)特定疾病也至關(guān)重要。Othera Pharmaceuticals（現(xiàn)由Colby Pharmaceutical收購(gòu)）正在開發(fā)一種具有抗氧化特性的二取代羥胺（OT551），局部應(yīng)用，通過靶向KEAP1抑制氧化應(yīng)激和疾病相關(guān)炎癥（化合物11，圖3a）。在臨床前研究中，該化合物的眼用溶液保護(hù)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和光感受器免受氧化損傷和炎癥反應(yīng)，并且一項(xiàng)關(guān)于年齡相關(guān)性黃斑變性的II期試驗(yàn)已證明可有效預(yù)防視力喪失的進(jìn)展（NCT00485394）（表1）。
TFM735。一種高通量篩選報(bào)告子策略評(píng)估了包含融合到LacZ (NRF2d-LacZ)236的NRF2氨基末端區(qū)域嵌合蛋白的穩(wěn)定性，該策略確定TFM735為先導(dǎo)化合物（化合物12，圖3a）。TFM735以C151依賴性方式激活NRF2，并抑制受刺激的人外周血單核細(xì)胞中IL-6和IL-17合成以及小鼠EAE進(jìn)展（237）。該化合物目前由Mochida Pharmaceuticals進(jìn)行治療MS的臨床前開發(fā)（表1）。
NRF2-KEAP1蛋白-蛋白相互作用抑制劑。近年來(lái)，非親電性非共價(jià)化合物的發(fā)展受到關(guān)注，這些化合物可以直接干擾KEAP1和NRF2之間的PPI(238)，或者干擾KEAP1和CUL3之間的PPI(239)。通過直接干擾KEAP1和NRF2或CUL3之間的相互作用，化合物的作用方式不需要共價(jià)結(jié)合組分。該方法具有潛在的優(yōu)點(diǎn)，包括探索NRF2誘導(dǎo)物的新化學(xué)型的范圍，由于與KEAP1的不同相互作用模式導(dǎo)致的不同藥效學(xué)以及由于半胱氨酸非依賴性結(jié)合機(jī)制導(dǎo)致的不同脫靶效應(yīng)譜。有證據(jù)表明，親電子和非親電子（PPI）KEAP1抑制劑的生物學(xué)效應(yīng)譜不同，一個(gè)例子是非親電試劑誘導(dǎo)線粒體自噬的能力，與SFN和DMF等親電試劑相比；這表明兩種化合物類別之間藥理活性和治療效用的潛在差異。
PPI抑制劑的設(shè)計(jì)是以KEAP1的Kelch結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)可用性為指導(dǎo)的(241-243)(圖3b)。已經(jīng)報(bào)道了幾種類型的PPI抑制劑；根據(jù)制藥行業(yè)投入開發(fā)的主要化學(xué)類別如圖3b所示。萘雙磺酰胺化合物起源于Biogen的高通量篩選（244），隨后由中國(guó)藥科大學(xué)Jiang等人提供化合物13（CPUY192018）和類似物（245）。該雙羧酸化合物是KEAP1的高親和力配體，在低微摩爾濃度下誘導(dǎo)ARE依賴性基因的表達(dá)。Astex和葛蘭素史克還從基于X射線晶體學(xué)碎片的篩選程序中鑒定了含磺酰胺的鉛化合物。在這種情況下先導(dǎo)化合物的例子是化合物14，KEAP1-NRF2 PPI低納摩爾抑制劑，它能增加COPD患者上皮細(xì)胞中NRF2靶基因NQO1的表達(dá)。該化合物能夠在靜脈內(nèi)給藥后減輕大鼠的肺部炎癥，并有效抑制臭氧誘導(dǎo)的支氣管肺泡液中白細(xì)胞的積累并恢復(fù)GSH濃度（246）。來(lái)自該系列的化合物已經(jīng)在幾種模擬肺病特征的氧化應(yīng)激動(dòng)物模型中顯示出功效，并且目前正在開發(fā)用于臨床評(píng)估。已經(jīng)開發(fā)了另外兩類不是磺酰胺的單酸性PPI抑制劑。第一類是由胡等人在Rutgers開發(fā)（247），由Evotec和UCB Pharma詳細(xì)描述（248），包括四氫異喹啉(例如化合物15)，它們是KEAP1-NRF2 PPI的低微摩爾抑制劑。第二類是由Toray Industries和RIKEN開發(fā)的，并加入了惡二唑基序；化合物16是PPI抑制劑，具有微摩爾范圍內(nèi)的結(jié)合活性（249）。突出顯示的化合物或其類似物已與KEAP1 Kelch域共結(jié)晶；圖3b顯示了化合物13-16所獲得的結(jié)合位點(diǎn)亞袋的占用情況，并為這些配體未來(lái)的精煉提供了思路。
C4X Discovery利用計(jì)算化學(xué)、配體核磁共振光譜和蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)方法以及Keapstone利用基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)方法聯(lián)合開發(fā)了新的PPI抑制劑。學(xué)術(shù)團(tuán)體也在為非親電NRF2誘導(dǎo)物研究做出貢獻(xiàn)（250,251）。
如何使PPI抑制劑具有適當(dāng)?shù)乃幬锎x和藥代動(dòng)力學(xué)特性，用于外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)，后者是一個(gè)需要具有強(qiáng)安全性NRF2激活劑用于長(zhǎng)期給藥等條件的領(lǐng)域，如AD和PD。此時(shí)，非親電性PPI抑制劑改善靶向選擇性的潛在優(yōu)勢(shì)被當(dāng)前化合物相對(duì)較高的分子質(zhì)量、阻斷較大KEAP1-NRF2界面的要求以及極性官能團(tuán)賦予KEAP1緊密結(jié)合親和力的需要所抵消。因此，目前通過體外研究鑒定的許多原型化合物表現(xiàn)出較差的吸收、分布、代謝和排泄性質(zhì)。例如，萘雙磺酰胺（化合物13）對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎具有保護(hù)作用，在低微摩爾范圍內(nèi)激活NCM460培養(yǎng)細(xì)胞中NQO1表達(dá)，并在體外與納米級(jí)Kd結(jié)合，說明蛋白質(zhì)結(jié)合與生物活性之間的相互抵消（252）。
大多數(shù)PPI抑制劑的體內(nèi)評(píng)價(jià)都集中在外周炎癥。例如，化合物NK-252（化合物16的類似物）被Toray Industries鑒定為相當(dāng)弱的KEAP1抑制劑，但對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用并且降低了膽堿缺乏的l-氨基甲酸鹽飲食大鼠（NASH模型系統(tǒng)）的纖維化評(píng)分（253）。
用KEAP1非依賴性藥物靶向NRF2。越來(lái)越多的證據(jù)表明，NRF2除了KEAP1所發(fā)揮的作用外還表現(xiàn)出多層調(diào)節(jié)，如轉(zhuǎn)錄（196）、表觀遺傳（254,255）、共價(jià)蛋白修飾（258,257），以KEAP1非依賴性方式進(jìn)行蛋白酶體降解（258-261）以及NRF2二聚體伴侶的靶向結(jié)合ARE序列的調(diào)節(jié)（262,263）。在藥理學(xué)發(fā)展水平上，ARE介導(dǎo)的基因調(diào)控的KEAP1非依賴性機(jī)制涉及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄抑制因子BACH1（廣泛復(fù)合物，tramtrack、bricàbrac和cap'n'collar同源體1），該機(jī)制抑制NRF2調(diào)控基因亞基的失活，尤其是HMOX1（28）。vTv 療法現(xiàn)在正在分析該亞基是否足以引起治療用處。他們開發(fā)了一類新的非親電子小分子，可以獨(dú)立于KEAP1抑制BACH1與某些ARE驅(qū)動(dòng)基因的結(jié)合（264）。
挑戰(zhàn)與思考
藥效學(xué)評(píng)價(jià)。考慮到NRF2的半衰期很短，即使在藥物誘導(dǎo)穩(wěn)定后，也需要通過間接指標(biāo)來(lái)推斷其在病變器官中的激活情況，從而確定最合適的治療方案。一種可能性是分析可接觸的細(xì)胞或組織（如外周血單核細(xì)胞、鼻腔灌洗液細(xì)胞、脫落的膀胱細(xì)胞、頰細(xì)胞和皮膚）中的藥物分布和NRF2基因表達(dá)特征，希望NRF2的轉(zhuǎn)錄組特征反映了其他組織（如肺，肝和腦）的局部參與（265-267）。群體不可避免地暴露于有害環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的情況下，尿液中相應(yīng)代謝物的水平已被用作NRF2介導(dǎo)的藥效學(xué)作用生物標(biāo)志物（268,269）。
NRF2通路的激活表現(xiàn)為依賴于時(shí)間、組織、劑量、發(fā)病時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的差異基因表達(dá)。表2顯示了NRF2調(diào)控基因產(chǎn)物代表性亞群的半衰期。由于其中許多蛋白質(zhì)的半衰期相當(dāng)長(zhǎng)，其生物化學(xué)活性的持續(xù)時(shí)間預(yù)計(jì)將遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于NRF2穩(wěn)定的時(shí)間間隔或其藥理激活劑的存在，后者通常在數(shù)小時(shí)內(nèi)被清除。因此，NRF2活化分子的藥效學(xué)觀察時(shí)間比NRF2水平要長(zhǎng)得多，且與血漿藥物濃度不一致。因此，NRF2激活劑TBE-31（一種與上述三萜類化合物密切相關(guān)的三環(huán)氰基酮）在小鼠皮膚和血漿中的半衰期為10小時(shí)（51,270），而NRF2依賴的NQO 1誘導(dǎo)蛋白在最后一劑局部應(yīng)用藥物3天后仍可在皮膚中檢測(cè)到（51）。因?yàn)镹RF2激活劑導(dǎo)致“刺激產(chǎn)生或抑制控制測(cè)量效果的因素”，所以“間接藥效學(xué)反應(yīng)”模型可能是用于測(cè)試NRF2激活劑藥效學(xué)走向臨床應(yīng)用的更合理方法（272,272）。
NRF2活化藥物在相關(guān)組織中的濃度和分布，以及它們的溶解度、細(xì)胞通透性、代謝穩(wěn)定性和蛋白結(jié)合，也將在NRF2活化程度中發(fā)揮重要作用，最終達(dá)到預(yù)期的長(zhǎng)效藥效學(xué)效果。因此，優(yōu)化臨床有意義的藥物暴露需要通過一個(gè)假定的NRF2激活劑分析劑量依賴性基因調(diào)控。此外，NRF2靶向參與研究必須考慮患者的年齡和表現(xiàn)狀態(tài)，因?yàn)樵谀挲g較大和健康狀況較差的受試者中，藥物激活NRF2或促進(jìn)“適應(yīng)性反應(yīng)”的能力似乎有所下降。最近在DMF復(fù)發(fā)緩解型和多發(fā)性硬化癥患者的臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，NRF2轉(zhuǎn)錄靶NQO1的誘導(dǎo)程度與患者年齡呈負(fù)相關(guān), 在4 - 6周高NQO1蛋白含量的患者在開始治療后的第二年更有可能沒有疾病活動(dòng)的證據(jù)（267）。
藥物選擇性。KEAP1中高活性半胱氨酸的鑒定對(duì)于理解親電化合物與泛素連接酶底物適配器共價(jià)作用的機(jī)制至關(guān)重要。結(jié)構(gòu)信息表明，某些作用于C151的藥物可能會(huì)干擾與CUL3-RBX1的相互作用(273, 274)，從而使KEAP1庫(kù)被結(jié)合的NRF2飽和，并允許新合成的NRF2逃避降解: 這是用親電試劑n -碘乙酰- n -生物素己二胺模型證明的（275）。其他化合物可能會(huì)修飾KEAP1，使其不再能夠在轉(zhuǎn)錄因子內(nèi)的高親和力和低親和力位點(diǎn)與NRF2相互作用。值得注意的是，一些親電的NRF2激活劑，如環(huán)氰烯酮，以共價(jià)形式與硫醇結(jié)合，但不形成不可逆的加合物（276,277）。因此，它們結(jié)合了不可逆共價(jià)藥物(即高效力和持續(xù)的靶點(diǎn)參與)和可逆非共價(jià)藥物(即缺乏永久性修飾，因此可能破壞或免疫原性其蛋白靶點(diǎn))的理想特性（278）。這類分子的一個(gè)潛在缺點(diǎn)是，它們可能與KEAP1以外的蛋白質(zhì)中對(duì)氧化還原敏感的半胱氨酸發(fā)生反應(yīng)，從而影響其功能。巰基反應(yīng)性分子的特異性問題表明，對(duì)于每種化合物，需要確定在其他蛋白質(zhì)中不存在硫醇修飾的情況下允許治療相關(guān)KEAP1修飾的窗口（圖1b）。KEAP1內(nèi)的靶半胱氨酸以及其他含巰基的非靶蛋白的這種分層呈現(xiàn)被稱為“半胱氨酸代碼”（279），并且受誘導(dǎo)劑的化學(xué)和劑量影響（280）。
KEAP1-NRF2 PPI抑制劑的一個(gè)重要潛在優(yōu)勢(shì)是提高了靶點(diǎn)的選擇性。然而，對(duì)于任何小分子，不能完全排除脫靶效應(yīng)。此外，KEAP1靶向NRF2以外的蛋白進(jìn)行泛素化，這些蛋白也可能受到影響（281）。PPI抑制劑的脫靶選擇性已被評(píng)估的幾種類型之一是強(qiáng)效單酸性磺胺類；例如，化合物14似乎對(duì)KEAP1具有相當(dāng)?shù)倪x擇性，在葛蘭素史克公司(GlaxoSmithKline)增強(qiáng)的體外實(shí)驗(yàn)交叉屏幕面板中顯示出適度的活性，以識(shí)別潛在的脫靶效應(yīng)（246）。
動(dòng)物模型。阻礙大多數(shù)慢性病藥物開發(fā)成功的一個(gè)問題是動(dòng)物模型中人類病理的不完全可復(fù)制性（288）。這一問題可能與人類退行性疾病缺乏一個(gè)非常重要的標(biāo)志有關(guān)，即與NRF2相關(guān)的體內(nèi)平衡功能的逐漸喪失。事實(shí)上，盡管在人類仍有許多工作需要做，但動(dòng)物研究證據(jù)表明，NRF2活性隨著年齡的增長(zhǎng)而下降，并且NRF2的藥理學(xué)或遺傳學(xué)上調(diào)可延長(zhǎng)壽命并改善健康狀況（283, 284）。慢性疾病動(dòng)物模型缺乏“NRF2變量”，這在AD小鼠模型中得到了很好的證明。目前的模型是基于這樣的假設(shè)，即有毒的APP或tau突變蛋白在原本健康的動(dòng)物背景下的表達(dá)復(fù)制了人類的病理。盡管這些模型提供了關(guān)于蛋白病的發(fā)病和進(jìn)展的有價(jià)值信息，但是它們未能將治療成功應(yīng)用于人類。這種失敗的原因可能與這些模型不考慮與NRF2相關(guān)穩(wěn)態(tài)功能的疾病相關(guān)性下降這一事實(shí)有關(guān)。更復(fù)雜的臨床前模型將需要一種反向翻譯方法，這種方法不僅要在動(dòng)物身上復(fù)制特定疾病的解剖病理特征，而且要復(fù)制受損的氧化還原、炎癥或蛋白穩(wěn)態(tài)。因此，NRF2敲除小鼠與AD患者甚至老年人有許多共同改變（156）。最近的研究表明，與野生型動(dòng)物相比，喂食高脂肪食物的NRF2敲除小鼠表現(xiàn)出更大的神經(jīng)血管功能障礙、血腦屏障破壞、神經(jīng)炎癥、淀粉樣基因表達(dá)和認(rèn)知能力下降，這與隨著年齡增長(zhǎng)而發(fā)生的許多表型變化類似（285）。引入低NRF2表達(dá)作為降低穩(wěn)態(tài)反應(yīng)的變量，可能有助于改進(jìn)現(xiàn)有的慢性病模型，以獲得更好的治療效果?？紤]到隨著衰老NRF2活性的緩慢下降，雜合的NFE2L2 +/-小鼠可能是復(fù)制基礎(chǔ)表達(dá)減少和藥理學(xué)上調(diào)的合適模型。
癌癥風(fēng)險(xiǎn)。從藥理學(xué)角度來(lái)看，有必要確定NRF2水平升高超過致癌安全閾值的風(fēng)險(xiǎn)有多大(圖4)。促進(jìn)NRF2在癌細(xì)胞中穩(wěn)定性的體細(xì)胞突變影響與NRF2的藥理學(xué)激活引起的影響存在顯著差異。因此，KEAP1和NFE2L2的體細(xì)胞突變導(dǎo)致NRF2活性升高而不受限制，這與NRF2激活劑的藥理作用引起的脈沖激活完全不同。動(dòng)力學(xué)特征，如曲線下的振幅和面積，反映NRF2信號(hào)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，在基因激活設(shè)置和藥理學(xué)手段方面有很大差異（202, 286）。此外，KEAP1基因丟失或失活突變似乎與該蛋白的藥理學(xué)抑制作用不一樣。因此，KEAP1丟失導(dǎo)致的NRF2活性以及E3連接酶適配器的幾個(gè)致癌靶標(biāo)（包括IKKβ和B細(xì)胞淋巴瘤2，bcl-2）增加，可能至少是惡性轉(zhuǎn)化的部分原因。因此，在具有功能性KEAP1的一組細(xì)胞系中，成熟的NRF2激活劑，即BARD類似物RTA-405，增加NRF2但不增加IKKβ或BCL-2水平，并且不賦予腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活優(yōu)勢(shì)（287）。
雖然目前NRF2激活劑的癌癥風(fēng)險(xiǎn)不能被忽視，但令人鼓舞的是，DMF III期試驗(yàn)薈萃分析顯示安慰劑和DMF治療組之間的癌癥發(fā)生率沒有差異（288）。 同樣重要的是要注意，一些NRF2激活藥物如果具有抗腫瘤作用的其他靶標(biāo)可以降低這種風(fēng)險(xiǎn)。因此，最近發(fā)現(xiàn)DMF抑制GAPDH（289），并且這種抑制可能導(dǎo)致高度糖酵解的KRAS或BRAF突變癌細(xì)胞的能量危象，從而阻止腫瘤發(fā)展，如維生素C（290）。
展望
許多慢性疾病的標(biāo)志是喪失穩(wěn)態(tài)，如氧化還原信號(hào)、代謝靈活性、炎癥控制和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。這些復(fù)雜疾病的多因素性質(zhì)可以通過對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NRF2的單次靶向激活，產(chǎn)生有益的、全面的、多靶點(diǎn)和持久的細(xì)胞保護(hù)作用。盡管KEAP1-NRF2系統(tǒng)的特殊性使得這種方法在監(jiān)測(cè)靶向參與和脫靶效應(yīng)方面特別具有挑戰(zhàn)性，但生物制藥公司正在緩慢而穩(wěn)定地開發(fā)針對(duì)NRF2主要調(diào)控因子KEAP1的藥物。此外，需要明確排除增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)的擔(dān)憂。在未來(lái)幾年，正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)無(wú)疑將在回答這些問題方面取得重要進(jìn)展。
圖1：KEAP1對(duì)NRF2的調(diào)控及其藥理靶標(biāo)。
圖2：KEAP1和NFE2L2 mRNA在人腦和血液中的表達(dá)。
圖3：KEAP1結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)。
圖4：根據(jù)NRF2的狀態(tài)調(diào)節(jié)癌癥風(fēng)險(xiǎn)。
摘要：轉(zhuǎn)錄因子NF-E2 p45相關(guān)因子2（NRF2;由NFE2L2編碼）及其主要負(fù)調(diào)節(jié)因子，E3連接酶受體Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（KEAP1）是維持氧化還原、代謝和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)以及炎癥調(diào)節(jié)的關(guān)鍵。因此，激活NRF2可對(duì)多種疾病起到細(xì)胞保護(hù)作用，包括肺和肝的慢性疾病、自身免疫病、神經(jīng)退行性疾病和代謝性疾病以及癌癥啟動(dòng)。一種NRF2激活劑已獲得臨床批準(zhǔn)，并且基于半胱氨酸傳感器KEAP1的幾種親電修飾劑及其與NRF2相互作用的抑制劑目前正在臨床開發(fā)中。然而，在靶向特異性、藥效學(xué)特性、療效和安全性方面仍存在挑戰(zhàn)。
前言
轉(zhuǎn)錄因子NF-E2 p45相關(guān)因子2（NRF2;由NFE2L2編碼）于1994年作為人類cap 'n' collar（CNC）堿性區(qū)域亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族成員被發(fā)現(xiàn)（1）。隨后的研究，包括NRF2敲除小鼠的產(chǎn)生，確定NRF2調(diào)控約250個(gè)基因的表達(dá)，調(diào)控的基因在其啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)中含有增強(qiáng)子序列，稱為抗氧化應(yīng)答元件（ARE）（2, 3）。這些基因編碼一個(gè)合作酶網(wǎng)絡(luò)，參與內(nèi)生和外生生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)、抗氧化代謝、碳水化合物和脂類的中間代謝、鐵的分解代謝、蛋白質(zhì)降解和炎癥調(diào)節(jié)（4）。通過這個(gè)轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，NRF2能夠協(xié)調(diào)多方面應(yīng)對(duì)各種形式的應(yīng)激，維持穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境。
1999年，Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（KEAP1）被鑒定為NRF2的抑制因子（5），又過了5年才被報(bào)道為E3泛素連接酶底物適配器，靶向NRF2進(jìn)行蛋白酶體的快速降解（6-8）。因此，KEAP1確保在無(wú)應(yīng)激條件下，NRF2是低豐度的蛋白質(zhì)，具有僅約15-40分鐘的有限半衰期，這取決于細(xì)胞類型。然而，重要的是，KEAP1含有幾個(gè)高活性的半胱氨酸，經(jīng)親電子分子修飾后，可防止其靶向NRF2進(jìn)行蛋白酶體降解，從而導(dǎo)致NRF2蛋白在氧化還原應(yīng)激下快速核聚集，并在與小肌肉筋膜纖維肉瘤癌基因同源蛋白（sMAF）二聚化后，通過NRF2-sMAF誘導(dǎo)含有ARE的基因（9,10）。
現(xiàn)在人們普遍認(rèn)識(shí)到，由于NRF2-靶基因編碼的蛋白質(zhì)的多功能和全面的細(xì)胞保護(hù)作用（包括抗氧化、解毒和抗炎），因此，NRF2-KEAP1信號(hào)通路對(duì)于預(yù)防以氧化應(yīng)激和炎癥為基礎(chǔ)病理特征的多種疾病至關(guān)重要。這些疾病包括代謝、炎癥和自身免疫性疾病，肺、肝、腎、胃腸道和心血管系統(tǒng)疾病以及神經(jīng)疾?。?, 11）。NRF2在這些非腫瘤性疾病中的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)證據(jù)將在本綜述的后面討論。我們還討論了NRF2在癌癥中的作用，這是一個(gè)需要深入研究的問題（12）。
通過單粒子電子顯微鏡獲得的KEAP1二聚體3D重建顯示，該蛋白具有叉狀莖結(jié)構(gòu)，包括兩個(gè)大球體，它們包圍了中間區(qū)域（IVR）、Kelch和羧基末端結(jié)構(gòu)域，而二聚化由BTB域介導(dǎo)（圖1a）（13）?？紤]到KEAP1包含許多不同且自主運(yùn)作的半胱氨酸傳感器（C151、C226、C273、C288和C613）（14-16），現(xiàn)有證據(jù)表明，NRF2和KEAP1整合了一氧化氮、Zn2+、烯醛信號(hào)傳導(dǎo)與氧化還原信號(hào)傳導(dǎo)一起提供了一種可能至少部分進(jìn)化的機(jī)制，以允許快速適應(yīng)飲食中遇到的植物化學(xué)物質(zhì)。許多植物來(lái)源的親電異種生物激活NRF2-KEAP1信號(hào)通路以引發(fā)細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)，KEAP1中的高活性半胱氨酸起直接傳感器的作用（17-19）。這些傳感器與親電子試劑的高反應(yīng)性使得KEAP1在沒有非特異性硫醇修飾的情況下進(jìn)行靶向治療成為可能（圖1b）。因此，已經(jīng)描述了許多天然存在的NRF2靶基因誘導(dǎo)劑（20），并且新的誘導(dǎo)劑在不斷被發(fā)現(xiàn)。
盡管大量學(xué)術(shù)實(shí)驗(yàn)室參與了NRF2激活劑的鑒定，但從歷史上看，制藥公司在這個(gè)令人興奮和充滿希望領(lǐng)域的參與度卻相當(dāng)?shù)?。業(yè)界之所以不愿將NRF2-keap1信號(hào)通路視為有價(jià)值的藥物靶點(diǎn)，部分原因可能是其廣泛的生物化學(xué)活性，而不僅僅是控制由NRF2直接或間接調(diào)控的抗氧化系統(tǒng)。NRF2激活劑的各種直接和間接效應(yīng)有時(shí)被解釋為非特異性效應(yīng)的證據(jù)。然而，KEAP1中幾種不同的基于硫醇的氧化還原開關(guān)的進(jìn)化允許哺乳動(dòng)物適應(yīng)廣泛的植物化學(xué)物質(zhì)，這為改變NRF2的激活引起某些“脫靶”效應(yīng)并采用更廣泛視野的觀念提供了理論基礎(chǔ)。NRF2的激活產(chǎn)生有益的“多靶點(diǎn)”細(xì)胞保護(hù)作用（11）。尤其是NRF2激活的多靶點(diǎn)效應(yīng)包括維持氧化還原信號(hào)、增強(qiáng)異種生物轉(zhuǎn)化、控制和解決炎癥、抑制糖異生和肝脂肪生成、支持蛋白穩(wěn)定和抑制纖維化（9）。在這方面，值得注意的是，大多數(shù)慢性疾病，特別是老年人的慢性病，沒有獨(dú)特的病因?qū)W，也沒有單一的病理表型，因此，它們可能通過激活NRF2的藥物得到最有效的治療。事實(shí)上，與更有針對(duì)性的治療干預(yù)相比，NRF2激活后廣泛的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制的刺激不太可能被致病過程有效地淹沒或規(guī)避。
這種對(duì)NRF2作為潛在藥物靶標(biāo)的廣泛認(rèn)可引起了制藥業(yè)的興趣，并導(dǎo)致對(duì)NRF2調(diào)節(jié)劑臨床開發(fā)的大量投資（21）。NRF2激活劑富馬酸二甲酯(DMF;目前，商標(biāo)名如Fumaderm或Tecfidera)已被臨床用于治療銀屑病和復(fù)發(fā)性多發(fā)性硬化癥(MS)(表1)，其目前的分布情況仍是其他制藥公司希望達(dá)到的目標(biāo)。目前，多種不同化學(xué)類型的NRF2激活劑處于臨床開發(fā)的不同階段，如靶向KEAP1半胱氨酸的富馬酸衍生物、異硫氰酸硫蘿卜硫素(SFN;4‐異硫氰酸甲酰丁酯)、氰烯酮三萜、硝基脂肪酸和羥胺。其他候選藥物包括破壞NRF2-KEAP1蛋白-蛋白相互作用(PPIs)的非親電化合物，以及具有keap1獨(dú)立作用模式的分子。NRF2的抑制劑也在研究中，但尚未進(jìn)行臨床試驗(yàn)。本綜述概述了這些候選藥物，并強(qiáng)調(diào)了針對(duì)NRF2-KEAP1信號(hào)通路不尋常的性質(zhì)和至關(guān)重要的意義。本文描述了NRF2在細(xì)胞氧化還原、代謝和蛋白穩(wěn)態(tài)以及炎癥調(diào)控中的生理作用，并為NRF2在非腫瘤性疾病中的保護(hù)作用提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。評(píng)價(jià)了目前臨床開發(fā)的各種小分子NRF2活性藥理調(diào)節(jié)劑的優(yōu)缺點(diǎn)。最后，強(qiáng)調(diào)了與NRF2調(diào)節(jié)劑開發(fā)相關(guān)的持續(xù)挑戰(zhàn)，包括靶點(diǎn)特異性、藥效學(xué)評(píng)估、生物利用度、有效性和安全性。
NRF2-KEAP1信號(hào)通路的生理作用
氧化還原、代謝和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)
自從其最初被發(fā)現(xiàn)參與生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，調(diào)節(jié)某些細(xì)胞色素P450氧化還原酶、結(jié)合酶和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)（表2），NRF2參與控制細(xì)胞內(nèi)氧化還原環(huán)境的作用變得越來(lái)越明顯，最終將NRF2-KEAP1信號(hào)通路識(shí)別為“硫醇驅(qū)動(dòng)的總開關(guān)”用于“整個(gè)系統(tǒng)范圍的氧化應(yīng)激反應(yīng)”（22）。NRF2調(diào)控參與NADPH生成的4個(gè)基因(葡萄糖6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、蘋果酸酶1和異檸檬酸脫氫酶1)的表達(dá)（23–26）。這種還原當(dāng)量的供應(yīng)進(jìn)一步被大量氧化還原反應(yīng)所利用，其中許多氧化還原反應(yīng)也受到NRF2的調(diào)節(jié)。因此，NRF2調(diào)控氧化還原緩沖物還原型谷胱甘肽(GSH;其氧化形式為GSSG)，如谷氨酸半胱氨酸連接酶、谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶和數(shù)個(gè)谷胱甘肽s -轉(zhuǎn)移酶的催化和調(diào)節(jié)亞基（4）。此外，氧化還原蛋白家族中的許多輔助蛋白，如硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶、過氧化物還蛋白和硫還蛋白，都受到NRF2的調(diào)控，提供區(qū)域活性氧生成的區(qū)域化傳感和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（ROS;即過氧化氫（H2O2）羥基和超氧自由基 ）（27-29）。除了這些對(duì)氧化還原狀態(tài)的直接影響外，NRF2還調(diào)節(jié)編碼酶的基因，這些酶可阻止醌參與氧化還原循環(huán)反應(yīng)和谷胱甘肽耗竭（通過NAD(P)H:醌氧化還原酶1（NQO1））或參與間接生產(chǎn)膽紅素（血紅素加氧酶1（HMOX1）和膽綠素還原酶（BVR）），是最有效的非極性生理抗氧化劑（30）。最后，NRF2通過與戊糖磷酸途徑和糖酵解的相互作用，影響中間代謝，增加底物的可用性，減少線粒體呼吸鏈的等效物（31），并維持線粒體DNA （mtDNA）的完整性（32）。
NRF2在氧化還原改變或營(yíng)養(yǎng)缺乏期間參與清除氧化或其他損傷的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器。因此，自噬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白泛素結(jié)合蛋白p62(由SQSTM1編碼)是NRF2的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，它通過其泛素關(guān)聯(lián)域(UBA)與泛素化產(chǎn)物相互作用，并通過其LC3相互作用的基序?qū)⑵湔心嫉阶允审w中（33, 34）。此外，KEAP1與p62結(jié)合（33, 35），最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)KEAP1-CULLIN 3（CUL3）在其UBA結(jié)構(gòu)域中的K420位點(diǎn)泛素化p62，從而促進(jìn)p62的螯合活性（36）。在其一級(jí)結(jié)構(gòu)中，p62含有ETGE樣基序STGE，在被mTORC1磷酸化后產(chǎn)生識(shí)別位點(diǎn)與KEAP1對(duì)接（37）。然后，KEAP1被轉(zhuǎn)運(yùn)到自噬體降解，從而使NRF2積累（38）。此外，一些自噬基因似乎在其啟動(dòng)子區(qū)域含有序列，有報(bào)道稱NRF2同時(shí)激活伴侶介導(dǎo)的自噬（39）和巨自噬（40，41）。NRF2在氧化條件下在蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)中的其他作用通過未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)的激活（42,43）及其調(diào)節(jié)蛋白酶體亞基表達(dá)的能力來(lái)證明（44,45）。
至少在腦和血液中，編碼NRF2的mRNA豐度高于KEAP1的mRNA（圖2）；相反，KEAP1蛋白的半衰期比NRF2的半衰期長(zhǎng)（表2）。這些觀察結(jié)果強(qiáng)調(diào)了兩種蛋白質(zhì)的不同轉(zhuǎn)換率——KEAP1緩慢，NRF2快。此外，盡管NRF2和KEAP1普遍表達(dá)，但特定細(xì)胞類型主要負(fù)責(zé)穩(wěn)態(tài)適應(yīng)并呈現(xiàn)不同的表達(dá)水平（圖2）。因此，單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞在血細(xì)胞中表現(xiàn)出最高水平的NRF2，表明先天免疫系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)作用（見下文）。在大腦中，星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間的相互作用將中間代謝與氧化還原穩(wěn)態(tài)結(jié)合起來(lái)，至少部分通過NRF2實(shí)現(xiàn)（46）。此外，神經(jīng)元中的谷氨酸能神經(jīng)傳遞導(dǎo)致產(chǎn)生由神經(jīng)元GSH池控制的ROS。當(dāng)該池濃度較低時(shí)，鄰近的星形膠質(zhì)細(xì)胞通過向神經(jīng)元提供GSH前體甘氨酸、谷氨酸/谷氨酰胺和半胱氨酸來(lái)促進(jìn)其恢復(fù)（47）。毫不奇怪，星形膠質(zhì)細(xì)胞中NRF2水平很高（圖2）。此外，與神經(jīng)元相比，小膠質(zhì)細(xì)胞作為單核細(xì)胞譜系的一部分表達(dá)高水平的NRF2。
控制炎癥
NRF2在單核細(xì)胞和粒細(xì)胞中含量豐富(圖2)，提示NRF2參與了這些細(xì)胞類型驅(qū)動(dòng)的免疫應(yīng)答。敲除NRF2的小鼠對(duì)敗血癥休克高度敏感（48），并且在創(chuàng)傷愈合過程中表現(xiàn)為持續(xù)性炎癥（49, 50）。而NRF2的基因或藥理激活抑制了促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生（51 - 56）。在人類細(xì)胞中，KEAP1的破壞通過減弱髓系白細(xì)胞（57）和巨噬細(xì)胞（58）的炎癥反應(yīng)來(lái)預(yù)防敗血癥。特別有趣的是，NFE2L2中的一個(gè)多態(tài)性與轉(zhuǎn)錄活性降低相關(guān)，與炎癥性腸病(IBD)（59）和慢性胃炎（60）風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。如下所示，NRF2的強(qiáng)抗炎活性至少可歸因于三個(gè)獨(dú)立的機(jī)制：氧化還原代謝的調(diào)節(jié)；與核因子-κB(NF-κB)的相互作用；對(duì)促炎基因的直接調(diào)控。
炎癥與局部和全身病理水平的ROS積累增加有關(guān)，這可能損害氧化還原信號(hào)（61）。線粒體功能障礙和NADPH氧化酶不受控制的激活是炎癥細(xì)胞中ROS生成升高的主要因素，線粒體ROS引起mtDNA損傷和釋放，從而形成惡性循環(huán)，進(jìn)一步ROS的產(chǎn)生和炎性小體的激活，最終導(dǎo)致器官功能衰竭（62）。NRF2的氧化還原調(diào)節(jié)活性是阻止炎癥惡化和隨后組織損傷的惡性循環(huán)中的重要突破（63）。
NF-κB和NRF2相互作用。幾個(gè)NF-κB功能結(jié)合位點(diǎn)已確定在NFE2L2基因啟動(dòng)子區(qū)（64）。另一方面，NRF2抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。用脂多糖（LPS）或TNF處理NRF2缺陷小鼠增加了NF-κB轉(zhuǎn)錄的表達(dá)，表明NRF2對(duì)NF-κB的抑制作用（48）。該發(fā)現(xiàn)的可能解釋是NF-κB抑制劑（IκB）在NRF2缺陷細(xì)胞中高度磷酸化并且經(jīng)歷快速蛋白酶體降解，從而減少對(duì)NF-κB的抑制（48）。此外，LPS顯示同時(shí)激活NF-κB介導(dǎo)的快速反應(yīng)和NRF2介導(dǎo)的緩慢反應(yīng)，最初的促炎反應(yīng)由NF-κB驅(qū)動(dòng)，然后當(dāng)NRF2活性最大時(shí)隨后被抑制（65）。NRF2-KEAP1信號(hào)通路抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的其他機(jī)制包括NRF2和p65之間與p300競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合（66）和KEAP1對(duì)IκB激酶-β（IKKβ）的降解（67, 68）。
幾種巨噬細(xì)胞特異性基因含有ARE序列，因此受NRF2調(diào)節(jié)。這些包括MARCO（細(xì)菌吞噬作用所需的受體）和CD36（氧化低密度脂蛋白的清道夫受體）（69, 70）。 另一方面，NRF2以不依賴ARE的方式結(jié)合編碼IL-6和IL-1β促炎基因調(diào)節(jié)區(qū)，并阻止RNA聚合酶II開始轉(zhuǎn)錄募集（52）。
最近的研究表明巨噬細(xì)胞代謝與NRF2引起的抗炎反應(yīng)有關(guān)。線粒體代謝物亞甲基丁二酸是由三羧酸循環(huán)在促炎刺激下產(chǎn)生的，在巨噬細(xì)胞活化過程中會(huì)顯著增加（71, 72）。反過來(lái)，亞甲基丁二酸烷基化幾個(gè)KEAP1半胱氨酸傳感器，包括關(guān)鍵C151、C273和C288殘基，從而激活NRF2并抑制促炎細(xì)胞因子如IL-6和IL-1β的轉(zhuǎn)錄（71）。因此，亞甲基丁二酸是KEAP1的內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑，在炎癥的控制過程中起到“關(guān)閉開關(guān)”的作用。此外，通過細(xì)胞可滲透的亞甲基丁二酸衍生物4-octylitaconate或SFN激活NRF2，通過降低mRNA穩(wěn)定性來(lái)抑制干擾素基因(STING)的銜接子分子刺激物的表達(dá)，從而抑制I型干擾素(IFN)的產(chǎn)生（73，74）。
NRF2-KEAP1信號(hào)通路和非腫瘤性疾病
在細(xì)胞和動(dòng)物模型中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量關(guān)于NRF2對(duì)多種慢性疾病保護(hù)作用的信息，許多研究使用了NRF2敲除小鼠（75）。關(guān)于人類，最近的一項(xiàng)研究為使用系統(tǒng)醫(yī)學(xué)方法分析NRF2對(duì)抗慢性病奠定了基礎(chǔ)，并且基于NRF2與其他分子（NRF2相互作用組）的連通性以及經(jīng)驗(yàn)證據(jù)，建立了第一個(gè)NRF2相關(guān)疾病（NRF2病變）的圖譜（9）。NFE2L2的功能性遺傳變異與疾病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)研究不斷提供有關(guān)NRF2在確定人類對(duì)慢性病易感性中作用的令人信服的證據(jù)。此外，這些遺傳學(xué)研究支持這樣一種假設(shè)，即對(duì)于NFE2L2的某些功能變化，模仿NRF2表達(dá)的微小變化的藥物可能具有治療價(jià)值。下面，我們將簡(jiǎn)要描述NRF2參與人類慢性疾病的一些里程碑性的成果，并重點(diǎn)介紹現(xiàn)有的遺傳學(xué)證據(jù)。
自身免疫性疾病
氧化組織損傷和細(xì)胞凋亡導(dǎo)致半抗原或受損大分子的形成，增加了自身免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。由于NRF2調(diào)節(jié)的酶在許多化學(xué)物質(zhì)的解毒中起著關(guān)鍵作用，因此它提供了一種保護(hù)機(jī)制，防止對(duì)自身免疫發(fā)病機(jī)制的環(huán)境易感性（79）。此外，NRF2抑制促炎T輔助細(xì)胞1（TH1）和TH17細(xì)胞反應(yīng)并激活免疫抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和TH2細(xì)胞（80）。NRF2在自身免疫中的相關(guān)性已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）中進(jìn)行了廣泛研究，其是MS的小鼠模型，MS是一種慢性炎性疾病，其特征在于自身反應(yīng)性免疫細(xì)胞浸潤(rùn)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。在EAE小鼠模型中，NRF2的缺乏加劇了疾?。?1），而KEAP1的敲低（52）或用一系列NRF2激活劑（包括氰基三萜類化合物和SFN）（82,83）治療減弱了其嚴(yán)重性。在人類中，通過IFNβ治療患者基因表達(dá)譜確定NRF2是長(zhǎng)期抗氧化反應(yīng)和神經(jīng)元保護(hù)的潛在介質(zhì)（84）。如下所述，一些生物制藥公司正在利用強(qiáng)有力的證據(jù)表明NRF2的活化在MS中具有治療價(jià)值。事實(shí)上，迄今為止唯一獲得美國(guó)食品藥品管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）DMF批準(zhǔn)的NRF2激活劑正在由Biogen銷售，用于治療緩解復(fù)發(fā)型MS和銀屑?。?5）。NRF2的保護(hù)作用已被建議用于其他自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（86, 87）、干燥綜合征（86）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（88, 89）、白癜風(fēng)（90-92）和STING依賴性干擾素?。?4）。
呼吸系統(tǒng)疾病
肺通過釋放促炎細(xì)胞因子和趨化因子對(duì)包括煙霧在內(nèi)的各種環(huán)境毒物作出反應(yīng)。這一主要效應(yīng)通過循環(huán)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞的募集產(chǎn)生漸進(jìn)的低度炎癥反應(yīng)，這些細(xì)胞釋放額外的炎癥介質(zhì)、ROS和金屬蛋白酶。最終結(jié)果是肺實(shí)質(zhì)受損的惡性循環(huán)，導(dǎo)致慢性阻塞性肺?。–OPD）或肺氣腫（93）。NRF2減輕由ROS和炎癥引起的肺實(shí)質(zhì)負(fù)擔(dān)。香煙煙霧是COPD和肺氣腫發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素。
NFE2L2-/-小鼠對(duì)香煙煙霧引起的肺氣腫的發(fā)展比野生型更敏感（94）。此外，長(zhǎng)期暴露于香煙煙霧后肺氣腫的發(fā)展與細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)下降有關(guān)（95），而五環(huán)氰基酮CDDO-咪唑啉保護(hù)NFE2L2+/+小鼠對(duì)抗香煙煙霧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、肺泡細(xì)胞凋亡、肺泡破壞和肺動(dòng)脈高壓，而不是NFE2L2-/-小鼠（96）。NRF2的遺傳上調(diào)（通過Clara細(xì)胞中的Keap1缺失，其在鼠上呼吸道中是豐富的）具有類似的保護(hù)作用（97）。
在人類中，與沒有肺氣腫的患者相比，吸煙相關(guān)肺氣腫患者的肺泡巨噬細(xì)胞中NRF2轉(zhuǎn)錄信號(hào)降低（98）。人類NFE2L2基因啟動(dòng)子包含一個(gè)含有三個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)序列的單倍型和一個(gè)調(diào)控NRF2表達(dá)的三重重復(fù)多態(tài)性。具有低至中等啟動(dòng)子活性的COPD患者更容易發(fā)生呼吸衰竭（99）。SFN對(duì)NRF2的藥理學(xué)激活，或一種干擾KEAP1與NRF2相互作用的化合物，逆轉(zhuǎn)培養(yǎng)肺泡巨噬細(xì)胞和從COPD患者中分離的單核細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞受損的細(xì)菌吞噬作用（70,100）。然而，每日口服一定劑量SFN(西蘭花芽苗提取物)的慢性阻塞性肺病患者并沒有導(dǎo)致NRF2依賴性基因表達(dá)或肺泡巨噬細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞炎癥標(biāo)志物的一致性變化（101），說明將細(xì)胞培養(yǎng)研究結(jié)果轉(zhuǎn)化為人類結(jié)果的一些挑戰(zhàn)。其他慢性肺病，如特發(fā)性肺纖維化、慢性結(jié)節(jié)病和過敏性肺炎，被發(fā)現(xiàn)在支氣管肺泡灌洗液中表現(xiàn)出NRF2表達(dá)增加和內(nèi)源性抗氧化劑水平增加，表明對(duì)病理性ROS水平的適應(yīng)性反應(yīng)不成功（102）。
胃腸疾病
胃腸道經(jīng)常受到外來(lái)生物的挑戰(zhàn)，這可能導(dǎo)致形成病理水平的ROS，并可能引發(fā)IBD（103）。胃腸道也是膳食及其合成類似物在藥理學(xué)上激活NRF2的重要部位之一（23, 104-106）。在小鼠中，右旋糖酐硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎在NRF2缺陷小鼠中引起的IBD要比野生型小鼠嚴(yán)重（107）。在人類中，NRF2在腸細(xì)胞對(duì)炎癥應(yīng)激適應(yīng)的相關(guān)性在IBD患者的一項(xiàng)全面轉(zhuǎn)錄組研究中得到證實(shí)，證明了NRF2在減弱腸道巨噬細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中的作用（108）。重要的是，在一組日本患者中發(fā)現(xiàn)了NFE2L2基因中特定SNP與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的遺傳關(guān)聯(lián)（109）。NFE2L2啟動(dòng)子中3個(gè)SNP功能單倍體NRF2表達(dá)略有降低，與胃黏膜炎癥和幽門螺桿菌感染相關(guān)消化性潰瘍的發(fā)生發(fā)展有關(guān)（60）。
肝臟是抵御食物、外來(lái)生物制劑和口服活性藥物的第一道防線，因?yàn)閺南懒鞒龅拇蟛糠盅和ㄟ^肝門靜脈直接流到肝臟。早期使用NFE2L2-/-小鼠證實(shí)了NRF2對(duì)對(duì)乙酰氨基酚的保肝作用（110），NRF2的遺傳活化也是如此（111）。正如可能預(yù)期的那樣，喂食酒精（4-7天）的NFE2L2-/-小鼠比同樣喂養(yǎng)的野生型小鼠明顯更容易脂肪肝加重、肝臟炎癥反應(yīng)和肝功能衰竭，這在一定程度上可能是SREBP脂源性轉(zhuǎn)錄因子的激活和對(duì)乙醛解毒的相對(duì)無(wú)能（112）。通過觀察NRF2在小鼠肝部分切除后對(duì)肝臟再生的阻礙，發(fā)現(xiàn)NRF2調(diào)控NOTCH1基因表達(dá)（113），這一機(jī)制也參與了NRF2介導(dǎo)的造血干細(xì)胞祖細(xì)胞功能改善和電離輻射后骨髓抑制（114）。在遺傳性血色素沉著癥伴鐵超載的小鼠模型中(由于穩(wěn)態(tài)鐵調(diào)節(jié)基因突變)，敲除NRF2增加了小鼠肝臟內(nèi)導(dǎo)致肝纖維化的壞死炎癥病變（115）。與這些觀察結(jié)果一致，原發(fā)性膽管炎和肝硬化患者NRF2表達(dá)減少（116。）
代謝性疾病
代謝性疾病又稱代謝綜合征，以腹部肥胖、高血壓、高甘油三酯血癥、低水平高密度脂蛋白和空腹高血糖為特征。它與2型糖尿?。═2DM）和相關(guān)的合并癥如血管功能障礙、心血管疾病、腎小球腎炎、非酒精性脂肪性肝炎（NASH;見下文）和認(rèn)知障礙密切相關(guān)。盡管T2DM及其合并癥的特征在于線粒體產(chǎn)生過量超氧化物（117），但NRF2缺失小鼠不會(huì)自發(fā)地發(fā)展成糖尿病。實(shí)際上，敲除小鼠表現(xiàn)出增加的胰島素敏感性，這歸因于ROS介導(dǎo)的蛋白酪氨酸激酶磷酸酶1B的抑制，該蛋白拮抗胰島素信號(hào)（118）。相比之下，db/db背景下小鼠中KEAP1敲除或敲低對(duì)NRF2的遺傳激活，或db/db小鼠中NRF2的藥理活化，抑制了T2DM的發(fā)生（119）。因此，似乎當(dāng)胰腺β細(xì)胞代謝挑戰(zhàn)合成胰島素以應(yīng)對(duì)高血糖時(shí)，所產(chǎn)生的ROS負(fù)擔(dān)可能會(huì)導(dǎo)致氧化損傷、損害反應(yīng)、導(dǎo)致T2DM（120,121）。如果這個(gè)結(jié)論是正確的，那么很可能在飲食誘導(dǎo)的T2DM小鼠中，TBE-31或SFN激活NRF2后，胰腺功能的改善對(duì)葡萄糖處理的改善有顯著的作用（122,123）以及富含SFN西蘭花芽提取物對(duì)T2DM失調(diào)肥胖患者空腹血糖和糖化血紅蛋白(HbA1c)的降低作用（123）。除了增加對(duì)胰腺β細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力之外，NRF2活化可通過增加糖原分支酶和磷酸化酶b激酶α的表達(dá)來(lái)抑制骨骼肌中的糖原分解，從而有助于改善全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)（119）。在糖尿病腎病小鼠模型中，SFN或肉桂醛對(duì)NRF2的藥理激活已被證明可抑制氧化應(yīng)激以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1信號(hào)傳導(dǎo)和纖維化（124）。
NRF2可能在胰島素抵抗中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因?yàn)樗谔悄虿』颊叩膯魏思?xì)胞中表達(dá)很低（125）。令人信服的證據(jù)來(lái)自遺傳關(guān)聯(lián)研究，表明導(dǎo)致低NRF2表達(dá)的一些NFE2L2多態(tài)性導(dǎo)致病理性ROS和T2DM的風(fēng)險(xiǎn)增加（126-128）。關(guān)于并發(fā)癥，由于KEAP1啟動(dòng)子中CpG島的去甲基化導(dǎo)致的抗氧化保護(hù)失效與糖尿病白內(nèi)障有關(guān)（129）。
NRF2也可能對(duì)NASH的發(fā)展具有保護(hù)作用。在使用缺乏蛋氨酸和膽堿飲食的NASH小鼠模型中，NRF2缺失小鼠比野生型小鼠死于該疾病的速度要快得多（130,131）。在更為生理的NASH模型中，喂食高脂肪飲食的NRF2缺失小鼠也會(huì)出現(xiàn)肝臟脂肪變性和炎癥惡化，這表明需要NRF2來(lái)抑制這些癥狀的發(fā)生（118, 132）。此外，野生型而非NRF2敲除小鼠，在長(zhǎng)期高脂肪、高果糖飲食使其變得肥胖和胰島素抵抗后，通過三環(huán)氰基酮TBE-31對(duì)NRF2藥理激活后，逆轉(zhuǎn)了胰島素抵抗，抑制肝臟脂肪變性，改善NASH和肝纖維化（122）。TBE-31對(duì)NRF2的藥理激活拮抗SREBP1c和ChREBP及其脂質(zhì)生物合成靶基因的表達(dá)，這可能涉及AMPK的激活（122, 133）。此外，在小鼠肝臟中，NRF2的基因激活可拮抗糖異生酶PEPCK和G6PC的表達(dá)，這可能也涉及AMPK（133）。在NASH患者的肝臟活檢標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)病理性ROS水平升高、NRF2基因表達(dá)增加，提示其試圖減輕氧化和炎癥（134）。
心血管疾病
ROS的產(chǎn)生和處理之間的不平衡導(dǎo)致破壞性氧化物質(zhì)的過度形成，已被認(rèn)為在許多心血管疾病中發(fā)揮作用，如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病血管疾病、心肌缺血再灌注損傷和心力衰竭（135）。此外，血管壁內(nèi)的低度持續(xù)性炎癥是動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的形成過程和發(fā)展特點(diǎn)，所以動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易破裂，進(jìn)而導(dǎo)致血栓形成和終末器官缺血。鑒于NRF2是抗氧化防御的關(guān)鍵調(diào)控因子，且具有直接的抗炎特性，因此可以合理地假設(shè)NRF2可以預(yù)防與ROS相關(guān)的心血管疾病。事實(shí)上，包括富馬酸鹽和硫化氫在內(nèi)的NRF2激活劑在許多心血管疾病動(dòng)物模型中顯示出了保護(hù)作用，如心臟缺血再灌注損傷（136, 137）和心力衰竭（138, 139）。NRF2在高膽固醇血癥小鼠模型動(dòng)脈粥樣硬化中的作用就不那么直接了：在骨髓來(lái)源細(xì)胞中NRF2的缺失加重了動(dòng)脈粥樣硬化（140, 141），而根據(jù)病變發(fā)展程度評(píng)估的NRF2全面缺失減輕了動(dòng)脈粥樣硬化（142-145），但增加了斑塊炎癥和易損性（145）。然而，一些NRF2激活劑已被證明在多種動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型中具有動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)作用（146-148）。由收縮性、細(xì)胞骨架蛋白和分子伴侶蛋白突變引起的心臟疾病約占遺傳性心肌疾病的30%（149）。在某些情況下，還原而不是氧化應(yīng)激，再加上蛋白質(zhì)聚集，與心肌病有關(guān)。血液透析患者全身炎癥和病理ROS的形成與NRF2的下調(diào)有關(guān)（150），位于NFE2L2啟動(dòng)子的多態(tài)性與這些患者死亡率的增加有關(guān)（151）。NRF2信號(hào)通路的破壞可防止還原性應(yīng)激并延緩過量表達(dá)心臟中CRYAB（α-結(jié)晶B鏈）小鼠蛋白質(zhì)性心臟?。?52）。因此，正如這篇綜述所強(qiáng)調(diào)的，針對(duì)NRF2的環(huán)境非常重要——越多不一定越好。
神經(jīng)退行性疾病
在各種形式的神經(jīng)退行性疾病中，NRF2和蛋白穩(wěn)定之間的聯(lián)系尤其密切，因?yàn)檫@些疾病的特點(diǎn)是蛋白異常聚集（43）。NRF2在蛋白質(zhì)病中具有保護(hù)作用的令人信服的證據(jù)已經(jīng)在阿爾茨海默病（AD）模型的淀粉樣病變（153,154）、tau病變（155）或兩者皆有（40, 156, 157）以及帕金森病（PD）模型的α-突觸核蛋白病變（158-160）中得到證實(shí)。在人類，APP受損和tau損傷神經(jīng)元NRF2及其靶蛋白p62 / SQSTM1表達(dá)增加（40,161）。這些發(fā)現(xiàn)與最近報(bào)道的NRF2上調(diào)巨自噬（40）和分子伴侶介導(dǎo)自噬（39）的基因表達(dá)作用是一致的，這是清除APP、tau和α-突觸核蛋白的兩種必要機(jī)制。NRF2上調(diào)保護(hù)神經(jīng)元免受突變型α-突觸核蛋白和leucinerich重復(fù)激酶2（LRRK2）的毒性（162），LRRK2也導(dǎo)致與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的神經(jīng)變性（163）。奇怪的是，盡管NRF2激活增加了α-突觸核蛋白的降解，但錯(cuò)誤折疊的彌漫性LRRK2被隔離到包涵體中。
NRF2在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中的作用尤其重要，因?yàn)樗鼈冊(cè)诖竽X中表達(dá)水平最高(圖2b)。通過使用帶有ARE驅(qū)動(dòng)的堿性磷酸酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，我們發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞在幾種神經(jīng)變性模型中對(duì)NRF2的激活反應(yīng)高度敏感（164），這表明NRF2通過對(duì)即將死亡的神經(jīng)元提供代謝和GSH前體而在星形膠質(zhì)細(xì)胞的培育作用中具有相關(guān)性（46, 165）。小膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦的免疫應(yīng)答細(xì)胞，在NRF2介導(dǎo)的應(yīng)答中也起著至關(guān)重要的作用（166, 167）。在帕金森毒素甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶致小鼠PD模型中，NRF2可調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)，從而降低COX2、NOS2、IL-6和TNF的生成，并增加多種抗炎標(biāo)志物的水平（55, 168）。tau損傷神經(jīng)元激活小膠質(zhì)細(xì)胞似乎至少部分地通過與分形趨化因子相互作用有關(guān)。在小鼠和人類，tau損傷神經(jīng)元釋放出分形趨化因子，抑制鄰近的小膠質(zhì)細(xì)胞中GSK3并導(dǎo)致NRF2蛋白的增加。反過來(lái)，NRF2減少TNF和IL-6的釋放，并參與小膠質(zhì)細(xì)胞的重編程，以達(dá)到愈合傷口（161）。
一些NRF2靶基因，包括HMOX1、NQO1、GCLM和SQSTM1，在AD和PD腦中上調(diào)（159,169-171）。通過對(duì)NFE2L2啟動(dòng)子中3個(gè)SNP的功能單倍型與疾病風(fēng)險(xiǎn)之間關(guān)系的遺傳分析，證明了這種上調(diào)的相關(guān)性。在肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)中，一種保護(hù)性的單倍體等位基因與疾病發(fā)作延遲4年有關(guān)（172），但另一項(xiàng)研究沒有發(fā)現(xiàn)明顯的關(guān)聯(lián)（173）。在AD中，另一個(gè)單倍型變異與早2年發(fā)病有關(guān)（76）。已經(jīng)報(bào)道了PD的更詳細(xì)證據(jù)。最初，保護(hù)性單倍型與瑞典隊(duì)列中疾病發(fā)作延遲相關(guān)，并且波蘭隊(duì)列PD患者的風(fēng)險(xiǎn)降低（77）。之后，這些研究結(jié)果在四個(gè)獨(dú)立的歐洲病例對(duì)照研究中得到了重復(fù)（174），但臺(tái)灣人口卻沒有（175），這表明存在種族和/或環(huán)境差異。NRF2的藥理激活也有望用于治療亨廷頓病(Huntington disease, HD)和弗里德雷希共濟(jì)失調(diào)(Friedreich ataxia, FRDA)，對(duì)于這兩種疾病來(lái)說，氧化應(yīng)激和炎癥是重要的病理驅(qū)動(dòng)因素。在小鼠、來(lái)自HD和FRDA患者的模型生物體和培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行的研究報(bào)告了NRF2信號(hào)通路受損（53,176 - 178）以及藥理學(xué)NRF2激活劑的有益作用。因此，三唑衍生物對(duì)NRF2的激活抑制了HD原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞以及來(lái)自HD患者的培養(yǎng)單核細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的釋放（53），并且在離體HD大鼠皮質(zhì)紋狀體腦切片和HD果蠅模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用（179）。在HD、DMF和三萜類化合物的小鼠模型中，CDDO-乙基酰胺和CDDO-三氟乙基酰胺改善了動(dòng)物的腦病理和行為（180,181）。用SFN和環(huán)狀氰基酮TBE-31或RTA-408處理改善了FRDA小鼠模型成纖維細(xì)胞、小腦顆粒神經(jīng)元以及FRDA患者成纖維細(xì)胞的線粒體功能和抗氧化能力（182,183）?？偠灾?，現(xiàn)有證據(jù)表明NRF2的適度激活對(duì)大腦具有神經(jīng)保護(hù)作用。
NRF2-KEAP1信號(hào)通路和癌癥
據(jù)報(bào)道，NRF2具有抗腫瘤和促腫瘤作用。在這里，我們簡(jiǎn)要總結(jié)了目前對(duì)NRF2在癌癥中作用的理解，并參考了最近在癌癥背景下討論NRF2的全面綜述（12）。
在非惡性細(xì)胞中，NRF2激活對(duì)氧化劑誘導(dǎo)的遺傳損傷以及化學(xué)和物理致癌物具有抵抗性，這是由于NRF2激活增強(qiáng)了機(jī)體的防御能力，包括抗氧化（184）、放射性保護(hù)（114）以及加速DNA損傷劑的生物轉(zhuǎn)化和清除（185）。此外，NRF2轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的激活似乎將ROS水平維持在低于對(duì)腫瘤發(fā)生關(guān)鍵蛋白質(zhì)發(fā)送信號(hào)所必需的水平，例如磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶（PI3K）、絲裂原活化激酶、缺氧誘導(dǎo)因子1和NF-κB（186）。
相反，在腫瘤發(fā)展的早期階段，選擇具有NRF2組成型激活的癌細(xì)胞作為能夠適應(yīng)惡劣微環(huán)境、化療、放療或高內(nèi)源ROS水平的方式。此外，在快速增殖的細(xì)胞中，NRF2通過增強(qiáng)核苷酸（26）和氨基酸（187）的生物合成來(lái)支持中間代謝，但也會(huì)產(chǎn)生代謝失衡和對(duì)谷氨酰胺酶的依賴，這可能用于治療（188,189）。
KEAP1的體細(xì)胞功能缺失突變或NFE2L2的功能獲得突變?cè)诜切〖?xì)胞肺癌和其他一些環(huán)境因素是重要病因的癌癥中很常見（190）。癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中的NRF2突變綜合目錄在10364例中識(shí)別出226個(gè)獨(dú)特的NRF2突變腫瘤，其中33種腫瘤類型中有21種發(fā)生了功能獲得性NRF2突變（191）。這種突變的頻繁發(fā)生表明NRF2抑制劑在癌癥治療中的潛在益處，從而引發(fā)對(duì)此類藥物的研究(Box 1)。這些NRF2抑制劑代表了藥理學(xué)的一個(gè)完全開放的領(lǐng)域，目前處于概念驗(yàn)證研究的水平。NRF2抑制的替代方法包括靶向依賴NRF2和/或在KEAP1突變癌細(xì)胞中選擇性表達(dá)的蛋白。例如谷氨酰胺酶（188, 189）和NR0B1的抑制劑，NR0B1是一種非典型的孤兒核受體，在多聚體蛋白復(fù)合物中調(diào)節(jié)KEAP1突變細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄（192）。然而，值得注意的是，目前尚無(wú)證據(jù)表明單單KEAP1或NFE2L2突變能夠引發(fā)惡性轉(zhuǎn)化，與致癌驅(qū)動(dòng)因子共發(fā)生似乎是必要的，PI3K通路改變與惡性轉(zhuǎn)化的相關(guān)性最強(qiáng)（193）。
最能說明問題的是，KEAP1亞等位基因敲低的NRF2全基因組上調(diào)小鼠不會(huì)自發(fā)形成腫瘤（194, 195），而小鼠肺中同時(shí)缺失Keap1和PTEN則會(huì)促進(jìn)腺癌的形成（195）。重要的是，由此產(chǎn)生的腫瘤具有免疫抑制微環(huán)境的特征，可通過免疫檢查點(diǎn)抑制劑進(jìn)行治療（195）。很明顯，NRF2基因激活是腫瘤發(fā)生的重要因素，因?yàn)榘┗?KRASG12D)激活嚙齒動(dòng)物NRF2信號(hào)可以增加腫瘤發(fā)展（196）,而KEAP1基因敲低(也導(dǎo)致NRF2信號(hào)激活)強(qiáng)烈阻礙NOTCH1驅(qū)動(dòng)的腫瘤發(fā)生（197）以及紫外線輻射介導(dǎo)的皮膚癌發(fā)生（51, 198）。值得注意的是，在后一種模型中，同時(shí)喪失NRF2可以消除KEAP1敲低對(duì)皮膚癌發(fā)生的保護(hù)作用（199）。 NRF2的這種兩面作用得到廣泛的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持，在這些實(shí)驗(yàn)證據(jù)中，NRF2的激活增強(qiáng)了抗腫瘤免疫，以防止肺癌的發(fā)生，但只有在腫瘤發(fā)生后才會(huì)加速惡性生長(zhǎng)（200）。此外，與野生型同窩小鼠相比，接受化學(xué)誘導(dǎo)致癌作用的NFE2L2敲除小鼠表現(xiàn)出腫瘤數(shù)量增加（啟動(dòng)增強(qiáng)）但體積小得多（進(jìn)展受損）（201）。因此，低NRF2活性促進(jìn)癌發(fā)生的起始，而持久的組成型高NRF2活性可以驅(qū)動(dòng)癌癥進(jìn)展和對(duì)治療的抗性（202）。
NRF2調(diào)節(jié)劑的臨床開發(fā)
富馬酸酯。富馬酸酯代表一組NRF2激活劑，工業(yè)上對(duì)此進(jìn)行了大量的研究。臨床最成功的例子是DMF（化合物1，圖3a），它于1994年被批準(zhǔn)用于治療銀屑病，并且基于其在MS的EAE小鼠模型中的功效（203），于2014年被Biogen（Tecfidera）重新用于治療復(fù)發(fā)-緩解型MS。在發(fā)現(xiàn)NRF2之前，對(duì)嚙齒動(dòng)物的早期研究報(bào)道DMF是NRF2轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)GST和NQO1的強(qiáng)效誘導(dǎo)劑（204），后來(lái)發(fā)現(xiàn)DMF代謝物富馬酸單甲酯(MMF;化合物2，圖3a)與KEAP1中的C151反應(yīng)，激活NRF2（203）。自從發(fā)現(xiàn)DMF的誘導(dǎo)劑活性以來(lái)，安全性一直是一個(gè)優(yōu)先考慮的問題，并注意到獲得顯著酶誘導(dǎo)劑所需DMF濃度對(duì)嚙齒動(dòng)物具有良好的耐受性（204）。DMF在兩個(gè)III期試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的安全性和耐受性（205, 206），自其商業(yè)化以來(lái)，它已成為近年來(lái)最成功的新藥之一。然而，Tecfidera的一個(gè)缺點(diǎn)是出現(xiàn)輕度至中度腹痛、潮紅、腹瀉和惡心。盡管可以控制這些不良反應(yīng)，但是更嚴(yán)重的癥狀是在治療開始時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)低的患者發(fā)生白細(xì)胞減少癥。事實(shí)上，用DMF治療的動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中粒細(xì)胞的水平遠(yuǎn)低于未接受該藥物治療的動(dòng)物（207）。該作用與NRF2無(wú)關(guān)，但很可能是由于羥基羧酸受體的活化，因?yàn)槿狈υ摰鞍踪|(zhì)的小鼠具有高水平的粒細(xì)胞，無(wú)論它們是否用DMF處理（207）。這些觀察結(jié)果強(qiáng)調(diào)了仔細(xì)選擇治療納入標(biāo)準(zhǔn)的重要性。
如上所述，DMF在體內(nèi)代謝為MMF，通過在C151處形成加合物使KEAP1失活（203）。由于這種代謝轉(zhuǎn)化，一些生物制藥公司正在開發(fā)具有緩慢和持續(xù)釋放MMF的化合物，與DMF相比，其顯示出改善的生物利用度和更少的副作用（表1）。Alkermes（被Biogen收購(gòu)）開發(fā)了富馬酸迪羅西酯（BIIB098，以前為ALK8700，化合物3;圖3a），一種具有降低GI副作用的MMF前藥，現(xiàn)在正在進(jìn)行MS的III期臨床試驗(yàn)（NCT03093324）。 XenoPort（由Arbor Pharmaceuticals收購(gòu)）開發(fā)了富馬酸富馬酰胺，一種MMF前藥（XP23829，化合物4，圖3a）。與DMF相比，XP23829在臨床前模型中具有更高的溶解度和滲透性，口服給藥后更大的吸收，改善功效和降低GI副作用，并且現(xiàn)在處于斑塊狀銀屑病的II期臨床試驗(yàn)中（NCT02173301）。Catabasis制藥公司正在開發(fā)另一種MMF和二十二碳六烯酸(CAT4001)的化學(xué)連接偶聯(lián)物，與單獨(dú)的生物活性分子相比，這種偶聯(lián)物具有增強(qiáng)細(xì)胞靶向性、有效性、安全性和耐受性的潛力。特定的酶釋放細(xì)胞內(nèi)的兩個(gè)組件，同時(shí)調(diào)整多個(gè)生物目標(biāo)，包括細(xì)胞和動(dòng)物模型中的NRF2和NF-κB, 并顯示出治療神經(jīng)退行性疾?。ㄈ鏔RDA和ALS）的前景。V ClinBio正在開發(fā)一種類似的技術(shù)，用于治療MS和銀屑病的MMF和二十碳五烯酸（VCB101，化合物5，圖3a和VCB102）的結(jié)合物（表1）。
蘿卜硫素（SFN）。SFN一種廣泛應(yīng)用的天然親電NRF2激活劑 (化合物6，圖3a)。該化合物最初由Paul Talalay和Yuesheng Zhang作為十字花科植物提取物NRF2靶酶NQO1的主要誘導(dǎo)物分離得到的（208），并與KEAP1的C151相互作用(14，209)。值得注意的是，SFN可通過血腦屏障（55），并在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床前模型中具有保護(hù)作用（210）。在一項(xiàng)針對(duì)患有自閉癥譜系障礙年輕男性的雙盲安慰劑對(duì)照臨床試驗(yàn)中，口服富含SFN的西蘭花芽提取物膠囊，通過異常行為檢查表和社會(huì)反應(yīng)量表評(píng)估，在行為方面改善顯著；這些量表上的總分?jǐn)?shù)在停止治療后逆轉(zhuǎn)至治療前水平（211）。三日齡的西蘭花芽富含葡萄糖苷，一種SFN前體分子，可被植物黑芥子酶水解，釋放出SFN和葡萄糖（212）。類似的β-硫葡糖苷酶存在于腸道微生物群中；因此，釋放的SFN實(shí)際水平高度依賴于飲食習(xí)慣和微生物組成，受抗生素治療的影響（213）并表現(xiàn)出晝夜節(jié)律（214）。并且，無(wú)論是芽苗提取物還是高度純化的SFN，已有超過500名受試者接受超過25,000劑量，證明了具有高度安全性。目前有超過20個(gè)正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)。
考慮到天然化合物知識(shí)產(chǎn)權(quán)的相關(guān)問題、SFN在室溫下不穩(wěn)定以及需要精確控制劑量，Evgen Pharma開發(fā)了SFN的藥物形式，SFX-01（化合物7，圖3a） 。 SFX-01是化學(xué)合成的SFN，包裹在環(huán)糊精中，形成穩(wěn)定的固體形式的丸劑或膠囊，具有良好的生物利用度。SFX-01目前正在用于蛛網(wǎng)膜下腔出血(NCT02614742)和轉(zhuǎn)移性乳腺癌(NCT02970682)臨床試驗(yàn)(表1)。Evgen還有一系列基于SFN的新型類似物，這些類似物正處于臨床前評(píng)估階段。此外，許多營(yíng)養(yǎng)保健品公司正在生產(chǎn)含有NRF2誘導(dǎo)劑的制劑，包括SFN，具有不同程度的標(biāo)準(zhǔn)化。其中一個(gè)例子是來(lái)自Nutrinov實(shí)驗(yàn)室的Prostaphane，它是一種穩(wěn)定的游離SFN，從花椰菜種子中提取，在前列腺癌的安慰劑對(duì)照臨床試驗(yàn)中顯示了在根治性前列腺切除術(shù)后控制生化復(fù)發(fā)的優(yōu)勢(shì)（215）。SFX-01和Prostaphane的生物利用度和效力等同于穩(wěn)定性較差的SFN（216）。另一個(gè)例子是膠囊膳食補(bǔ)充劑Avmacol（Nutramax Laboratories），含有來(lái)自精細(xì)研磨的花椰菜種子的蘿卜硫苷和冷凍干燥的西蘭花芽粉末以提供黑芥子酶。該補(bǔ)充劑目前正在臨床試驗(yàn)中用于調(diào)節(jié)與自閉癥譜系障礙、精神分裂癥和環(huán)境污染有關(guān)的疾病癥狀和/或生物標(biāo)志物（217）。
氰基酮三萜。越來(lái)越多的證據(jù)表明，富馬酸酯、SFN以及與KEAP1共價(jià)結(jié)合的其他小親電試劑可以從更大的支架結(jié)構(gòu)中受益，以賦予更好的選擇性（和可能的效力）和更可控的藥代動(dòng)力學(xué)和/或藥效學(xué)特性。含五環(huán)邁克爾受體的氰基酮三萜類化合物的開發(fā)可滿足這些要求。這些五環(huán)三萜類化合物最初由Michael Sporn、Gordon Gribble和Tadashi Honda開發(fā)，來(lái)自天然產(chǎn)物齊墩果酸（218, 219），這些五環(huán)三萜類化合物是迄今已知最有效的親電子NRF2激活劑（220），由KEAP1中的C151檢測(cè)，目前正在由Reata Pharmaceuticals和Kyowa Hakko Kirin進(jìn)行臨床開發(fā)。
兩種臨床上先進(jìn)的化合物，bardoxolone methyl（BARD;化合物8，圖3a）和omaveloxolone（化合物9），能使代謝正?；⒃黾泳€粒體能量產(chǎn)生、增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力和降低ROS水平（221）（表1）。在臨床前研究中，BARD或類似物已被證明可通過減少炎癥、纖維化和氧化應(yīng)激以及增加腎小球的過濾表面積來(lái)改善腎功能（222, 223）。通過修改選擇標(biāo)準(zhǔn)以排除有早期心力衰竭跡象的患者（B型利鈉肽升高），BARD目前正在臨床試驗(yàn)中測(cè)試幾種與慢性腎?。–KD）相關(guān)的罕見病癥，大多數(shù)沒有經(jīng)批準(zhǔn)的治療方法，包括Alport綜合征（NCT03019185）、常染色體顯性遺傳性多囊腎病、免疫球蛋白A（IgA）腎病、1型糖尿病和局灶性節(jié)段性腎小球硬化（NCT03366337），其中促炎和促纖維化過程造成腎小球硬化和腎功能受損（224）。BARD治療有可能延緩或預(yù)防腎小球?yàn)V過率下降，而腎小球?yàn)V過率下降會(huì)導(dǎo)致Alport綜合征和其他罕見形式CKD患者需要透析或移植。因此，在患有T2DM和CKD患者的II期臨床試驗(yàn)中（NCT02316821），BARD治療可使直接測(cè)量腎小球?yàn)V過率的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著增加，并且在排除具有液體潴留風(fēng)險(xiǎn)患者后，耐受性良好。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，Kyowa Hakko Kirin在患有G3期或G4期CKD的糖尿病患者中，在日本SAKIGAKE指定系統(tǒng)的支持下，開展了III期臨床試驗(yàn)（NCT03550443）。
此外，BARD正在用于研究肺動(dòng)脈高壓（PAH）（NCT03068130）和結(jié)締組織?。–TD-PAH）引起的PAH（NCT02657356），這是一種導(dǎo)致心力衰竭和死亡的嚴(yán)重和進(jìn)行性疾病。CTD-PAH與特發(fā)性病因之間的差異很大程度上歸因于炎癥、自身免疫和系統(tǒng)性血管病變之間復(fù)雜的相互作用，這些相互作用促成了結(jié)締組織疾病的發(fā)病機(jī)制。由于NF-κB的上調(diào)，CTD-PAH患者的炎癥加重（225），對(duì)現(xiàn)有血管擴(kuò)張劑治療的反應(yīng)性低于特發(fā)性PAH患者，預(yù)后較差（226）。在II期研究中，對(duì)CTD-PAH患者進(jìn)行了BARD測(cè)試，目前正在III期研究中進(jìn)行測(cè)試。Omaveloxolone目前正在FRDA患者（NCT02255435）的II期臨床試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試，這是一種遺傳性神經(jīng)肌肉疾病，其NRF2被下調(diào)（176-178）。值得注意的是，目前尚無(wú)批準(zhǔn)治療FRDA的療法（227）（表1）。
硝基脂肪酸。脂肪酸的硝化衍生物(NO2-FAs)是內(nèi)源性信號(hào)介質(zhì)，在代謝和炎癥疾病的臨床前動(dòng)物模型中具有抗炎和抗纖維化活性（228）。硝基烯烴基團(tuán)賦予其β-碳親電性，促進(jìn)與親核試劑如半胱氨酸的可逆NO2-FA邁克爾加合物的快速形成，這種改性稱為硝基烷基化（22, 230）。已經(jīng)表明，硝基油酸（NO2-OA; 9-硝基十八碳-9-烯酸）與KEAP1中的半胱氨酸反應(yīng)，包括C273和C288，從而激活NRF2（231,232）。該反應(yīng)的可逆性阻止了穩(wěn)定的NO2-FA硫醇加合物積累的可能性，這可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性（219,230,233）。實(shí)際上，I期安全性評(píng)估證明了先導(dǎo)化合物CXA10（10-NO2-OA; 10-硝基-十八碳-9-烯酸，NO2-OA的特異性區(qū)域異構(gòu)體）（化合物10，圖3a）在藥理活性劑量下對(duì)人體是安全的（234）。目前，Complexa正在開發(fā)CXA10作為局灶性節(jié)段性腎小球硬化和PAH的治療方法（234）（表1）。最近報(bào)道了來(lái)自α-生育酚的硝基烯烴合成和生物學(xué)評(píng)價(jià)（235）。
羥胺。一個(gè)特殊的挑戰(zhàn)是提供可以通過血腦屏障的NRF2激活劑。給藥途徑（注射、口服或局部）對(duì)特定疾病也至關(guān)重要。Othera Pharmaceuticals（現(xiàn)由Colby Pharmaceutical收購(gòu)）正在開發(fā)一種具有抗氧化特性的二取代羥胺（OT551），局部應(yīng)用，通過靶向KEAP1抑制氧化應(yīng)激和疾病相關(guān)炎癥（化合物11，圖3a）。在臨床前研究中，該化合物的眼用溶液保護(hù)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和光感受器免受氧化損傷和炎癥反應(yīng)，并且一項(xiàng)關(guān)于年齡相關(guān)性黃斑變性的II期試驗(yàn)已證明可有效預(yù)防視力喪失的進(jìn)展（NCT00485394）（表1）。
TFM735。一種高通量篩選報(bào)告子策略評(píng)估了包含融合到LacZ (NRF2d-LacZ)236的NRF2氨基末端區(qū)域嵌合蛋白的穩(wěn)定性，該策略確定TFM735為先導(dǎo)化合物（化合物12，圖3a）。TFM735以C151依賴性方式激活NRF2，并抑制受刺激的人外周血單核細(xì)胞中IL-6和IL-17合成以及小鼠EAE進(jìn)展（237）。該化合物目前由Mochida Pharmaceuticals進(jìn)行治療MS的臨床前開發(fā)（表1）。
NRF2-KEAP1蛋白-蛋白相互作用抑制劑。近年來(lái)，非親電性非共價(jià)化合物的發(fā)展受到關(guān)注，這些化合物可以直接干擾KEAP1和NRF2之間的PPI(238)，或者干擾KEAP1和CUL3之間的PPI(239)。通過直接干擾KEAP1和NRF2或CUL3之間的相互作用，化合物的作用方式不需要共價(jià)結(jié)合組分。該方法具有潛在的優(yōu)點(diǎn)，包括探索NRF2誘導(dǎo)物的新化學(xué)型的范圍，由于與KEAP1的不同相互作用模式導(dǎo)致的不同藥效學(xué)以及由于半胱氨酸非依賴性結(jié)合機(jī)制導(dǎo)致的不同脫靶效應(yīng)譜。有證據(jù)表明，親電子和非親電子（PPI）KEAP1抑制劑的生物學(xué)效應(yīng)譜不同，一個(gè)例子是非親電試劑誘導(dǎo)線粒體自噬的能力，與SFN和DMF等親電試劑相比；這表明兩種化合物類別之間藥理活性和治療效用的潛在差異。
PPI抑制劑的設(shè)計(jì)是以KEAP1的Kelch結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)可用性為指導(dǎo)的(241-243)(圖3b)。已經(jīng)報(bào)道了幾種類型的PPI抑制劑；根據(jù)制藥行業(yè)投入開發(fā)的主要化學(xué)類別如圖3b所示。萘雙磺酰胺化合物起源于Biogen的高通量篩選（244），隨后由中國(guó)藥科大學(xué)Jiang等人提供化合物13（CPUY192018）和類似物（245）。該雙羧酸化合物是KEAP1的高親和力配體，在低微摩爾濃度下誘導(dǎo)ARE依賴性基因的表達(dá)。Astex和葛蘭素史克還從基于X射線晶體學(xué)碎片的篩選程序中鑒定了含磺酰胺的鉛化合物。在這種情況下先導(dǎo)化合物的例子是化合物14，KEAP1-NRF2 PPI低納摩爾抑制劑，它能增加COPD患者上皮細(xì)胞中NRF2靶基因NQO1的表達(dá)。該化合物能夠在靜脈內(nèi)給藥后減輕大鼠的肺部炎癥，并有效抑制臭氧誘導(dǎo)的支氣管肺泡液中白細(xì)胞的積累并恢復(fù)GSH濃度（246）。來(lái)自該系列的化合物已經(jīng)在幾種模擬肺病特征的氧化應(yīng)激動(dòng)物模型中顯示出功效，并且目前正在開發(fā)用于臨床評(píng)估。已經(jīng)開發(fā)了另外兩類不是磺酰胺的單酸性PPI抑制劑。第一類是由胡等人在Rutgers開發(fā)（247），由Evotec和UCB Pharma詳細(xì)描述（248），包括四氫異喹啉(例如化合物15)，它們是KEAP1-NRF2 PPI的低微摩爾抑制劑。第二類是由Toray Industries和RIKEN開發(fā)的，并加入了惡二唑基序；化合物16是PPI抑制劑，具有微摩爾范圍內(nèi)的結(jié)合活性（249）。突出顯示的化合物或其類似物已與KEAP1 Kelch域共結(jié)晶；圖3b顯示了化合物13-16所獲得的結(jié)合位點(diǎn)亞袋的占用情況，并為這些配體未來(lái)的精煉提供了思路。
C4X Discovery利用計(jì)算化學(xué)、配體核磁共振光譜和蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)方法以及Keapstone利用基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)方法聯(lián)合開發(fā)了新的PPI抑制劑。學(xué)術(shù)團(tuán)體也在為非親電NRF2誘導(dǎo)物研究做出貢獻(xiàn)（250,251）。
如何使PPI抑制劑具有適當(dāng)?shù)乃幬锎x和藥代動(dòng)力學(xué)特性，用于外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)，后者是一個(gè)需要具有強(qiáng)安全性NRF2激活劑用于長(zhǎng)期給藥等條件的領(lǐng)域，如AD和PD。此時(shí)，非親電性PPI抑制劑改善靶向選擇性的潛在優(yōu)勢(shì)被當(dāng)前化合物相對(duì)較高的分子質(zhì)量、阻斷較大KEAP1-NRF2界面的要求以及極性官能團(tuán)賦予KEAP1緊密結(jié)合親和力的需要所抵消。因此，目前通過體外研究鑒定的許多原型化合物表現(xiàn)出較差的吸收、分布、代謝和排泄性質(zhì)。例如，萘雙磺酰胺（化合物13）對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎具有保護(hù)作用，在低微摩爾范圍內(nèi)激活NCM460培養(yǎng)細(xì)胞中NQO1表達(dá)，并在體外與納米級(jí)Kd結(jié)合，說明蛋白質(zhì)結(jié)合與生物活性之間的相互抵消（252）。
大多數(shù)PPI抑制劑的體內(nèi)評(píng)價(jià)都集中在外周炎癥。例如，化合物NK-252（化合物16的類似物）被Toray Industries鑒定為相當(dāng)弱的KEAP1抑制劑，但對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用并且降低了膽堿缺乏的l-氨基甲酸鹽飲食大鼠（NASH模型系統(tǒng)）的纖維化評(píng)分（253）。
用KEAP1非依賴性藥物靶向NRF2。越來(lái)越多的證據(jù)表明，NRF2除了KEAP1所發(fā)揮的作用外還表現(xiàn)出多層調(diào)節(jié)，如轉(zhuǎn)錄（196）、表觀遺傳（254,255）、共價(jià)蛋白修飾（258,257），以KEAP1非依賴性方式進(jìn)行蛋白酶體降解（258-261）以及NRF2二聚體伴侶的靶向結(jié)合ARE序列的調(diào)節(jié)（262,263）。在藥理學(xué)發(fā)展水平上，ARE介導(dǎo)的基因調(diào)控的KEAP1非依賴性機(jī)制涉及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄抑制因子BACH1（廣泛復(fù)合物，tramtrack、bricàbrac和cap'n'collar同源體1），該機(jī)制抑制NRF2調(diào)控基因亞基的失活，尤其是HMOX1（28）。vTv 療法現(xiàn)在正在分析該亞基是否足以引起治療用處。他們開發(fā)了一類新的非親電子小分子，可以獨(dú)立于KEAP1抑制BACH1與某些ARE驅(qū)動(dòng)基因的結(jié)合（264）。
挑戰(zhàn)與思考
藥效學(xué)評(píng)價(jià)。考慮到NRF2的半衰期很短，即使在藥物誘導(dǎo)穩(wěn)定后，也需要通過間接指標(biāo)來(lái)推斷其在病變器官中的激活情況，從而確定最合適的治療方案。一種可能性是分析可接觸的細(xì)胞或組織（如外周血單核細(xì)胞、鼻腔灌洗液細(xì)胞、脫落的膀胱細(xì)胞、頰細(xì)胞和皮膚）中的藥物分布和NRF2基因表達(dá)特征，希望NRF2的轉(zhuǎn)錄組特征反映了其他組織（如肺，肝和腦）的局部參與（265-267）。群體不可避免地暴露于有害環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的情況下，尿液中相應(yīng)代謝物的水平已被用作NRF2介導(dǎo)的藥效學(xué)作用生物標(biāo)志物（268,269）。
NRF2通路的激活表現(xiàn)為依賴于時(shí)間、組織、劑量、發(fā)病時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的差異基因表達(dá)。表2顯示了NRF2調(diào)控基因產(chǎn)物代表性亞群的半衰期。由于其中許多蛋白質(zhì)的半衰期相當(dāng)長(zhǎng)，其生物化學(xué)活性的持續(xù)時(shí)間預(yù)計(jì)將遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于NRF2穩(wěn)定的時(shí)間間隔或其藥理激活劑的存在，后者通常在數(shù)小時(shí)內(nèi)被清除。因此，NRF2活化分子的藥效學(xué)觀察時(shí)間比NRF2水平要長(zhǎng)得多，且與血漿藥物濃度不一致。因此，NRF2激活劑TBE-31（一種與上述三萜類化合物密切相關(guān)的三環(huán)氰基酮）在小鼠皮膚和血漿中的半衰期為10小時(shí)（51,270），而NRF2依賴的NQO 1誘導(dǎo)蛋白在最后一劑局部應(yīng)用藥物3天后仍可在皮膚中檢測(cè)到（51）。因?yàn)镹RF2激活劑導(dǎo)致“刺激產(chǎn)生或抑制控制測(cè)量效果的因素”，所以“間接藥效學(xué)反應(yīng)”模型可能是用于測(cè)試NRF2激活劑藥效學(xué)走向臨床應(yīng)用的更合理方法（272,272）。
NRF2活化藥物在相關(guān)組織中的濃度和分布，以及它們的溶解度、細(xì)胞通透性、代謝穩(wěn)定性和蛋白結(jié)合，也將在NRF2活化程度中發(fā)揮重要作用，最終達(dá)到預(yù)期的長(zhǎng)效藥效學(xué)效果。因此，優(yōu)化臨床有意義的藥物暴露需要通過一個(gè)假定的NRF2激活劑分析劑量依賴性基因調(diào)控。此外，NRF2靶向參與研究必須考慮患者的年齡和表現(xiàn)狀態(tài)，因?yàn)樵谀挲g較大和健康狀況較差的受試者中，藥物激活NRF2或促進(jìn)“適應(yīng)性反應(yīng)”的能力似乎有所下降。最近在DMF復(fù)發(fā)緩解型和多發(fā)性硬化癥患者的臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，NRF2轉(zhuǎn)錄靶NQO1的誘導(dǎo)程度與患者年齡呈負(fù)相關(guān), 在4 - 6周高NQO1蛋白含量的患者在開始治療后的第二年更有可能沒有疾病活動(dòng)的證據(jù)（267）。
藥物選擇性。KEAP1中高活性半胱氨酸的鑒定對(duì)于理解親電化合物與泛素連接酶底物適配器共價(jià)作用的機(jī)制至關(guān)重要。結(jié)構(gòu)信息表明，某些作用于C151的藥物可能會(huì)干擾與CUL3-RBX1的相互作用(273, 274)，從而使KEAP1庫(kù)被結(jié)合的NRF2飽和，并允許新合成的NRF2逃避降解: 這是用親電試劑n -碘乙酰- n -生物素己二胺模型證明的（275）。其他化合物可能會(huì)修飾KEAP1，使其不再能夠在轉(zhuǎn)錄因子內(nèi)的高親和力和低親和力位點(diǎn)與NRF2相互作用。值得注意的是，一些親電的NRF2激活劑，如環(huán)氰烯酮，以共價(jià)形式與硫醇結(jié)合，但不形成不可逆的加合物（276,277）。因此，它們結(jié)合了不可逆共價(jià)藥物(即高效力和持續(xù)的靶點(diǎn)參與)和可逆非共價(jià)藥物(即缺乏永久性修飾，因此可能破壞或免疫原性其蛋白靶點(diǎn))的理想特性（278）。這類分子的一個(gè)潛在缺點(diǎn)是，它們可能與KEAP1以外的蛋白質(zhì)中對(duì)氧化還原敏感的半胱氨酸發(fā)生反應(yīng)，從而影響其功能。巰基反應(yīng)性分子的特異性問題表明，對(duì)于每種化合物，需要確定在其他蛋白質(zhì)中不存在硫醇修飾的情況下允許治療相關(guān)KEAP1修飾的窗口（圖1b）。KEAP1內(nèi)的靶半胱氨酸以及其他含巰基的非靶蛋白的這種分層呈現(xiàn)被稱為“半胱氨酸代碼”（279），并且受誘導(dǎo)劑的化學(xué)和劑量影響（280）。
KEAP1-NRF2 PPI抑制劑的一個(gè)重要潛在優(yōu)勢(shì)是提高了靶點(diǎn)的選擇性。然而，對(duì)于任何小分子，不能完全排除脫靶效應(yīng)。此外，KEAP1靶向NRF2以外的蛋白進(jìn)行泛素化，這些蛋白也可能受到影響（281）。PPI抑制劑的脫靶選擇性已被評(píng)估的幾種類型之一是強(qiáng)效單酸性磺胺類；例如，化合物14似乎對(duì)KEAP1具有相當(dāng)?shù)倪x擇性，在葛蘭素史克公司(GlaxoSmithKline)增強(qiáng)的體外實(shí)驗(yàn)交叉屏幕面板中顯示出適度的活性，以識(shí)別潛在的脫靶效應(yīng)（246）。
動(dòng)物模型。阻礙大多數(shù)慢性病藥物開發(fā)成功的一個(gè)問題是動(dòng)物模型中人類病理的不完全可復(fù)制性（288）。這一問題可能與人類退行性疾病缺乏一個(gè)非常重要的標(biāo)志有關(guān)，即與NRF2相關(guān)的體內(nèi)平衡功能的逐漸喪失。事實(shí)上，盡管在人類仍有許多工作需要做，但動(dòng)物研究證據(jù)表明，NRF2活性隨著年齡的增長(zhǎng)而下降，并且NRF2的藥理學(xué)或遺傳學(xué)上調(diào)可延長(zhǎng)壽命并改善健康狀況（283, 284）。慢性疾病動(dòng)物模型缺乏“NRF2變量”，這在AD小鼠模型中得到了很好的證明。目前的模型是基于這樣的假設(shè)，即有毒的APP或tau突變蛋白在原本健康的動(dòng)物背景下的表達(dá)復(fù)制了人類的病理。盡管這些模型提供了關(guān)于蛋白病的發(fā)病和進(jìn)展的有價(jià)值信息，但是它們未能將治療成功應(yīng)用于人類。這種失敗的原因可能與這些模型不考慮與NRF2相關(guān)穩(wěn)態(tài)功能的疾病相關(guān)性下降這一事實(shí)有關(guān)。更復(fù)雜的臨床前模型將需要一種反向翻譯方法，這種方法不僅要在動(dòng)物身上復(fù)制特定疾病的解剖病理特征，而且要復(fù)制受損的氧化還原、炎癥或蛋白穩(wěn)態(tài)。因此，NRF2敲除小鼠與AD患者甚至老年人有許多共同改變（156）。最近的研究表明，與野生型動(dòng)物相比，喂食高脂肪食物的NRF2敲除小鼠表現(xiàn)出更大的神經(jīng)血管功能障礙、血腦屏障破壞、神經(jīng)炎癥、淀粉樣基因表達(dá)和認(rèn)知能力下降，這與隨著年齡增長(zhǎng)而發(fā)生的許多表型變化類似（285）。引入低NRF2表達(dá)作為降低穩(wěn)態(tài)反應(yīng)的變量，可能有助于改進(jìn)現(xiàn)有的慢性病模型，以獲得更好的治療效果?？紤]到隨著衰老NRF2活性的緩慢下降，雜合的NFE2L2 +/-小鼠可能是復(fù)制基礎(chǔ)表達(dá)減少和藥理學(xué)上調(diào)的合適模型。
癌癥風(fēng)險(xiǎn)。從藥理學(xué)角度來(lái)看，有必要確定NRF2水平升高超過致癌安全閾值的風(fēng)險(xiǎn)有多大(圖4)。促進(jìn)NRF2在癌細(xì)胞中穩(wěn)定性的體細(xì)胞突變影響與NRF2的藥理學(xué)激活引起的影響存在顯著差異。因此，KEAP1和NFE2L2的體細(xì)胞突變導(dǎo)致NRF2活性升高而不受限制，這與NRF2激活劑的藥理作用引起的脈沖激活完全不同。動(dòng)力學(xué)特征，如曲線下的振幅和面積，反映NRF2信號(hào)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，在基因激活設(shè)置和藥理學(xué)手段方面有很大差異（202, 286）。此外，KEAP1基因丟失或失活突變似乎與該蛋白的藥理學(xué)抑制作用不一樣。因此，KEAP1丟失導(dǎo)致的NRF2活性以及E3連接酶適配器的幾個(gè)致癌靶標(biāo)（包括IKKβ和B細(xì)胞淋巴瘤2，bcl-2）增加，可能至少是惡性轉(zhuǎn)化的部分原因。因此，在具有功能性KEAP1的一組細(xì)胞系中，成熟的NRF2激活劑，即BARD類似物RTA-405，增加NRF2但不增加IKKβ或BCL-2水平，并且不賦予腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活優(yōu)勢(shì)（287）。
雖然目前NRF2激活劑的癌癥風(fēng)險(xiǎn)不能被忽視，但令人鼓舞的是，DMF III期試驗(yàn)薈萃分析顯示安慰劑和DMF治療組之間的癌癥發(fā)生率沒有差異（288）。 同樣重要的是要注意，一些NRF2激活藥物如果具有抗腫瘤作用的其他靶標(biāo)可以降低這種風(fēng)險(xiǎn)。因此，最近發(fā)現(xiàn)DMF抑制GAPDH（289），并且這種抑制可能導(dǎo)致高度糖酵解的KRAS或BRAF突變癌細(xì)胞的能量危象，從而阻止腫瘤發(fā)展，如維生素C（290）。
展望
許多慢性疾病的標(biāo)志是喪失穩(wěn)態(tài)，如氧化還原信號(hào)、代謝靈活性、炎癥控制和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。這些復(fù)雜疾病的多因素性質(zhì)可以通過對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NRF2的單次靶向激活，產(chǎn)生有益的、全面的、多靶點(diǎn)和持久的細(xì)胞保護(hù)作用。盡管KEAP1-NRF2系統(tǒng)的特殊性使得這種方法在監(jiān)測(cè)靶向參與和脫靶效應(yīng)方面特別具有挑戰(zhàn)性，但生物制藥公司正在緩慢而穩(wěn)定地開發(fā)針對(duì)NRF2主要調(diào)控因子KEAP1的藥物。此外，需要明確排除增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)的擔(dān)憂。在未來(lái)幾年，正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)無(wú)疑將在回答這些問題方面取得重要進(jìn)展。
圖1：KEAP1對(duì)NRF2的調(diào)控及其藥理靶標(biāo)。
圖2：KEAP1和NFE2L2 mRNA在人腦和血液中的表達(dá)。
圖3：KEAP1結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)。
圖4：根據(jù)NRF2的狀態(tài)調(diào)節(jié)癌癥風(fēng)險(xiǎn)。
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